人微小RNA-302s 表达载体的构建及其对细胞周期的影响

葛秋燕^1,2 丁利军² 颜桂军² 刁振宇² 孙海翔^1,2 胡娅莉^1,2*

¹南京医科大学鼓楼临床医学院, 南京210029; ²南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心, 南京210008)

摘要 : PCR扩增人miR-302s的启动子区和编码区，亚克隆至pEGFP-C1载体，构建miR-302s重组表达载体pEGFP-C1-miR-302s。经过测序鉴定该载体含有核心启动子区(TATA)和miR-302s(miR-302a、miR-302a^#、miR-302b、miR-302b^#、miR-302c、miR-302c^#、miR-302d、miR-367 和miR-367^#簇)的编码子。荧光素酶报告基因实验结果显示pEGFP-C1-miR-302s转染HEK293细胞后抑制细胞周期相关基因cyclin D1 和PCAF 3'UTR 的活性，提示cyclin D1 和PCAF 是miR-302s 的靶基因。pEGFP-C1-miR-302s 转染HEK293 细胞后， Real-time Q-PCR检测发现miR-302s 高表达， Westernblot 分析发现cyclin D1 和PCAF的表达降低，流式细胞术分析进一步表明细胞转染后细胞周期G1 期缩短， S 期延长，表明miR-302s 对细胞周期G1-S 期转换具有重要调节作用。