{"code":0,"msg":"","count":81,"data":[{"caddress1":"(西湖大学, 生命科学学院, 杭州 310000)","cauthor":"崔诗遥 张兵*","cintpic":"Upload/qianyan/25-01-21-15-40-12-530.pdf","clicktime":696,"clong1":"

间歇性禁食通过引发器官间互作抑制毛囊再生<\/span>
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崔诗遥 张兵*<\/span><\/p>

(西湖大学, 生命科学学院, 杭州 310000)<\/span><\/p>


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【摘要】间歇性禁食因其潜在的健康益处而在全球范围内受到青睐。这种饮食方式不仅有助于改善代谢健康和体重控制, 还对组织健康产生了深远的影响。然而, 其具体作用机制尚不完全清楚。成体干细胞是组织更新和再生的核心驱动力, 位于特殊的“微环境”中, 该微环境通过整合局部和全身信号(包括神经、代谢和免疫等因素)精准调控干细胞的命运和行为, 从而影响组织和机体的整体健康。研究团队以毛囊干细胞(HFSCs)及毛囊再生为模型, 揭示了常见的间歇性禁食方案通过选择性诱导激活的毛囊干细胞凋亡来抑制毛囊再生的作用机制。这一现象与热量摄入减少、昼夜节律改变或mTORC1营养感应通路无关。相反, 禁食通过激活肾上腺与皮肤中真皮脂肪细胞的相互作用, 触发游离脂肪酸迅速释放至微环境, 干扰毛囊干细胞的代谢稳态, 并升高细胞活性氧水平,最终导致氧化损伤和细胞凋亡。此外, 一项在人群中开展的随机对照试验也表明, 间歇性禁食会抑制人类毛发生长。这一研究对间歇性禁食如何影响组织健康的根本机制进行了深入解析, 为理解其对组织再生和干细胞命运的影响提供了重要依据。<\/p>

【关键词】间歇性禁食; 成体干细胞; 毛囊干细胞; 毛囊再生; 毛发生长<\/p>


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Intermittent Fasting Triggers Interorgan Communication to Suppress Hair Follicle Regeneration<\/p>

CUI Shiyao, ZHANG Bing*<\/span><\/p>

(School of Life Sciences, Westlake University, Hangzhou 310000, China)<\/span><\/p>


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【Abstract】Intermittent fasting has become increasingly popular worldwide due to its potential health benefits. This dietary strategy not only supports metabolic health and weight management but also exerts significant effects on tissue health. However, the underlying mechanisms remain largely unclear. Adult stem cells, the driving force behind tissue renewal and regeneration, are located within specialized “niches” that integrate local and systemic signals—such as neural, metabolic, and immune factors—to precisely regulate their fate and behavior. These processes are essential for maintaining tissue and overall organismal health. Using HFSCs (hair follicle stem cells) and hair follicle regeneration as a model, researchers discovered that intermittent fasting inhibits hair follicle regeneration by selectively inducing apoptosis in activated HFSCs. Notably, this effect is independent of calorie restriction, circadian rhythm changes, or the mTORC1 nutrient-sensing pathway. Instead, fasting activates interactions between the adrenal glands and dermal adipocytes, leading to a rapid release of free fatty acids into the HFSC niche. This disrupts the metabolic balance of HFSCs, elevates ROS (reactive oxygen species) levels, and causes oxidative damage, ultimately triggering cell apoptosis. Additionally, a randomized controlled trial in humans revealed that intermittent fasting suppresses hair growth. These findings provide critical insights into the mechanisms by which intermittent fasting influences tissue health, shedding light on its impact on tissue regeneration and stem cell dynamics.<\/p>

【Keywords】intermittent fasting; adult stem cells; hair follicle stem cells; hair follicle regeneration; hair growth<\/p>


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1 间歇性禁食对组织健康的影响<\/p>

近年来, 多种饮食干预方式[如热量限制饮食、间歇性禁食(intermittent fasting, IF)、生酮饮食等]在多种生物体中展现出显著益处, 包括改善代谢健康、降低炎症水平和延长寿命[1-3], 因而在全球范围内广受欢迎[4-5]。间歇性禁食已在人群中被开发出多种具体方案, 并被广泛应用于临床和日常生活。据统计,美国18至80岁的人群中, 超过10%的人采用间歇性禁食作为饮食调控手段。然而, 尽管间歇性禁食的实践日益普及, 其对身体各系统的具体影响及作用机制仍未被完全阐明。<\/p>


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在哺乳动物中, 机体对饮食变化的适应涉及多个层面, 从全身系统性变化到器官间的相互协作, 甚至延伸至单个细胞和亚细胞水平。成体干细胞是驱动机体各组织器官更新与再生的关键力量。这些干细胞位于独特的“生态位”(niche, 也称微环境)中, 生态位通过整合局部和全身多种信号, 决定干细胞的命运, 并在应对多种生理与环境变化时调控组织再生过程, 从而帮助动物适应自然环境和维持生存[6]。一些研究表明, 间歇性禁食可改善多种成体干细胞群体(如肠道、肌肉和造血系统)的功能及稳态维持能力[7-9]。然而, 间歇性禁食对外周组织(如皮肤)的具体影响尚不明确。<\/p>


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从机制上看, 间歇性禁食通过延长进餐间隔、改变饮食节律以及减少总热量摄入对机体产生影响。然而, 目前尚不清楚这些因素中的哪一个在间歇性禁食对成体干细胞及组织再生的影响中起主要作用。此外, 间歇性禁食引起的全身性变化如何通过具体途径作用于外周组织, 以及这些信号在生态位中的哪类细胞中被感知并如何调控干细胞命运,这些问题尚未得到充分解答。值得注意的是, 成体干细胞通常表现出异于生态位其他细胞的独特代谢特征, 并在组织再生的不同阶段依赖不同的代谢途径。然而, 这些代谢特性如何塑造干细胞对间歇性禁食的响应, 目前仍不明确。接下来我们将以研究间歇性禁食对毛囊干细胞和毛囊再生的影响及机制为例[10], 介绍干细胞及其微环境对系统性代谢变化的响应, 为此类研究提供参考。<\/p>


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2 常用的间歇性禁食方案会抑制毛囊再生<\/p>

在皮肤中, 毛囊经历生长期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)的周期性变化, 其中毛囊干细胞(hair follicle stem cells, HFSCs)的周期性激活是驱动毛发新生的关键动力[11-12](图1A)。在休止期,毛囊干细胞处于其特有的生态位(hair bulge和hair germ)中, 保持休眠状态。当毛囊进入生长期时, 毛囊干细胞会短暂被激活, 进行自我更新并启动毛囊再生[13-14]。此外, 皮肤中的多种细胞类型围绕毛囊干细胞形成一个复杂的微环境, 可响应外界刺激或生理变化, 精确调控毛囊干细胞的再生活动[15]。<\/p>


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为了探讨间歇性禁食对毛囊再生的影响, 我们采用了两种常见的间歇性禁食方案: 16/8限时进食(time restricted feeding, TRF), 即每日仅允许在8小时的进食窗口内进食, 其余16小时禁食; 隔日禁食(alternate day fasting, ADF), 即在24小时禁食期和24小时自由饮食期之间交替(图1B)。实验中, 我们选取P60的小鼠, 剃去背部毛发, 并使其在接下来的96天中分别接受不同饮食处理, 以观察毛发生长情况(图1C)。<\/p>


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实验结果显示, 自由采食(ad libitum, AL)喂养的小鼠在P80左右进入生长期, 到P100时, 大部分背部毛发重新长出。而接受TRF或ADF饮食干预的小鼠则表现出显著的毛囊再生障碍: 即使到P156, 仍仅有部分背部毛发生长出来(图1C和图1D)。值得注意的是, 与先前研究一致[16-17], 间歇性禁食的小鼠表现出增强的葡萄糖耐受性, 说明代谢健康得到了改善。综上所述, 尽管间歇性禁食在代谢调控方面具有显著益处, 但我们的研究发现, 常见的间歇性禁食方案对毛囊再生产生了显著的抑制作用。<\/p>


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A: 小鼠毛发周期由毛囊干细胞(HFSCs)周期性激活驱动的示意图。B: 饮食干预模式的示意图, 包括自由进食(AL)、16/8限时进食(TRF)和隔日禁食(ADF)。进食从光照关闭后的Zeitgeber时间(ZT) 12开始。C: P60至P156期间接受AL、16/8 TRF和ADF处理的雌性小鼠毛发再生的进程。在开始处理前, 小鼠被剃毛(n=8~10)。D: 图B中小鼠毛发再生统计(n=5, 双因素方差分析)。<\/span><\/p>

A: schematic of mouse hair cycle phases driven by the periodic activation of HFSCs. B: schematic of dietary intervention paradigms including AL, 16/8 TRF, and ADF. Feeding starts from Zeitgeber time (ZT) 12 after lights off. C: progression of hair regrowth in female mice subjected to AL, 16/8 TRF, and ADF between P60 and P156. Mice were shaved before treatments (n=8-10). D: quantification of the hair regrowth in mice in figure B (n=5, Two-Way ANOVA).<\/span><\/p>

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图1 间歇性禁食抑制毛囊再生(根据参考文献[10]修改)<\/span><\/p>

Fig.1 Intermittent fasting inhibits hair follicle regeneration (modified from reference [10])<\/span><\/p>


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3 延长的禁食时间选择性诱导激活的HFSC凋亡<\/p>

为了揭示毛囊再生受到抑制的原因, 我们从干细胞命运和行为角度入手展开研究。静止状态下的HFSC无法被激活是许多毛囊再生缺陷的常见成因[18-19]。因此, 我们从P24(此时小鼠的毛囊处于休止期, HFSC处于静止状态)开始对小鼠进行ADF处理, 并每日检测HFSC的激活状态(图2A)。结果显示, 在AL条件下, 小鼠在P26便开始激活HFSC(EdU+)并进入生长期。同样地, ADF处理的小鼠在P26也出现了相当数量的HFSC激活。然而, 在24小时禁食期结束后, 毛囊内EdU+ HFSC数量骤减, 同时伴随大量凋亡信号(aCAS3, active caspase-3)(图2A)。<\/p>


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通过EdU追踪实验, 我们发现, 大多数凋亡的HFSC为EdU阳性, 表明这些细胞在凋亡前已被激活(图2B)。流式细胞术分析表明, 在ADF处理中, 大约25%的HFSC会在喂食阶段被激活(图2C), 其中约90%在随后的禁食期发生凋亡。这种周期性的激活与凋亡的循环导致了HFSC总数的显著减少(图2D和图2E)。<\/p>


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一般认为, 间歇性禁食通过减少总卡路里摄入或改变饮食节律发挥作用。然而, 我们的研究显示,在间歇性禁食处理的小鼠中, 平均每日的卡路里摄入并未显著减少。此外, 无论禁食发生在白天还是夜晚, 都会导致毛囊再生延迟, 表明这一现象并非源于昼夜节律的改变。<\/p>


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为了探究HFSC凋亡是否与禁食时间长短有关,我们让小鼠接受不同禁食时长的处理, 并检测HFSC的凋亡情况。结果发现, 在禁食8小时后, 毛囊内仅检测到少量凋亡信号。然而, 当禁食时间延长至16小时, 凋亡的HFSC显著增多, 并随着禁食时长的进一步延长而持续增加。值得注意的是, 凋亡现象在重新进食后逐渐消失(图2F)。这些数据表明, 延长禁食时间会诱导激活的HFSC发生凋亡, 从而阻碍毛囊再生。<\/p>


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A: 从P24开始接受自由进食(AL)和隔日禁食(ADF)处理的小鼠中毛囊干细胞(HFSCs)的激活与凋亡。Active caspase-3(aCAS3, n=30, 30个毛囊,来自5只小鼠, 单因素方差分析)。B: EdU追踪间歇性禁食下激活的HFSCs的命运(n=30个毛囊, 来自5只小鼠, 双尾非配对t检验)。C: 流式细胞术分析显示24小时禁食后EdU+HFSCs比例的下降。D: 流式细胞术分析显示24小时禁食后HFSCs总数的减少(n=3, 双尾非配对t检验)。E: 模型总结了间歇性禁食期间HFSCs的周期性激活与凋亡过程。F: HFSCs在24小时禁食和24小时再进食期间的凋亡时间进程。红色箭头标记了凋亡的HFSCs(n=30个毛囊, 来自5只小鼠, 单因素方差分析)。<\/span><\/p>

A: activation and apoptosis of HFSCs in mice subjected to AL and ADF starting from P24. Active caspase-3 (aCAS3, n=30, HFs from five mice, One-Way ANOVA). B: tracing the fate of activated HFSCs upon intermittent fasting (n=30 HFs from five mice, two-tailed unpaired t-test). C: flow cytometry analysis showing the proportion of EdU+HFSCs. D: flow cytometry analysis showing the total number of HFSCs decrease after a 24-hour fasting period in ADF (n=3, two-tailed unpaired t-test). E: model summarizing the cyclic activation and apoptosis of HFSCs during intermittent fasting. F: time course of HFSC apoptosis along the 24-hour fasting and 24-hour refeeding periods. Red arrowheads mark the apoptotic HFSCs. (n=30 HFs from five mice, One-Way ANOVA).<\/span><\/p>

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图2 延长的禁食时间导致激活的HFSCs发生凋亡(根据参考文献[10]修改)<\/span><\/p>

Fig.2 Extended duration of fasting induces apoptosis in activated HFSCs (modified from reference [10])<\/span><\/p>


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4 禁食诱导的脂肪分解导致HFSC凋亡
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我们发现, 延长的禁食时间会导致HFSC凋亡并抑制毛囊再生。那么, 这一现象的具体机制是什么呢？禁食引起的全身性营养水平暂时下降可能是关键因素, HFSC可能通过其细胞内的营养感应机制(nutrient sensing)直接感知这一变化[20], 进而引发凋亡。为验证这一假设, 我们在HFSC中敲除Tsc2基因(mTORC1信号通路的负调控因子), 以破坏其经典营养感知能力[21]。结果显示, 即便在Tsc2敲除的小鼠中, HFSC仍在禁食后发生显著凋亡, 表明禁食引起的HFSC凋亡并不依赖于mTORC1介导的细胞营养感应机制。<\/p>


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延长禁食时间会引发一系列全身性适应反应,例如通过脂肪组织调动储存的能量。在皮肤中, 真皮脂肪细胞是HFSC微环境的重要组成部分[22-23](图3A)。我们进一步探讨禁食诱导的全身性变化是否会传递到皮肤, 并通过微环境中的脂肪细胞影响HFSC。研究发现, 在禁食24小时后, 真皮脂肪细胞发生剧烈的脂解, 分解储存的甘油三酯并向微环境释放大量游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)(图3B)。在ADF小鼠中, 我们监测了24小时禁食期间的脂肪分解过程, 发现禁食16小时后, 真皮脂肪细胞出现显著脂解, 与毛囊中HFSC的凋亡同步发生(图2F和图3B)。这些数据表明, 禁食期间真皮脂肪细胞脂解与HFSC凋亡之间存在密切联系。<\/p>


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为了确定真皮脂肪细胞脂解是否直接导致HFSC凋亡, 我们利用AdipoQCreER;Atglfl/fl小鼠敲除脂肪细胞中的甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase, ATGL, 脂解的限速酶)[24]。在ATGL敲除小鼠中, 真皮脂肪细胞在禁食条件下无法进行脂解, 同时HFSC的凋亡显著减少(图3C)。接下来, 我们使用Lhx2CreER;Cpt1afl/fl小鼠, 在HFSC中特异性敲除肉碱棕榈酰转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A, CPT1A), 它是将自由脂肪酸转运至线粒体进行β氧化的限速酶[9]。结果显示, 尽管在CPT1A敲除小鼠中, 禁食引起的脂解依然存在,但HFSC的凋亡显著减少(图3D)。<\/p>


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为进一步验证FFA是否能够独立诱导HFSC凋亡, 我们从真皮脂肪细胞中提取甘油三酯, 并通过气相色谱–质谱(GC-MS)分析FFA的组成, 发现棕榈酸(16:0)、油酸(18:1, 顺式-9)和亚油酸(18:2, 顺式-9,12)是最丰富的FFA类型。将这些FFA注射至自由饮食(AL)小鼠的皮肤中, 结果显示, 即使在无禁食的条件下, 这些FFA也能够显著诱导HFSC凋亡(图3E)。综上所述, 我们的研究表明, 禁食期间真皮脂肪细胞释放的过量FFA及其在HFSC中的β氧化是导致HFSC凋亡的主要原因, 从而抑制毛囊再生。<\/p>


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A: 全组织染色的真皮脂肪细胞(Plin1, 脂滴包被蛋白)和毛囊(K14)。B: 真皮脂肪细胞在24小时禁食和24小时再进食期间的脂解时间进程。α6标记毛囊轮廓, BODIPY标记脂滴(n=30, 30个脂滴, 来自3只小鼠, 单因素方差分析)。C: 在AdipoQCreER;Atglfl/fl(ATGL cKO)小鼠中观察到的真皮脂肪细胞的脂解(下方)和HFSCs的凋亡(上方)。D: 在Lhx2CreER;Cpt1afl/fl(CPT1A cKO)小鼠中, 在24小时禁食后的脂解和HFSCs凋亡(n=30, 30个毛囊,来自6只小鼠, 双尾非配对t检验)。E: 在自由饮食(AL)小鼠中皮内注射FFA后HFSCs的凋亡(n=30个毛囊, 来自3只小鼠, 单因素方差分析)。<\/span><\/p>

A: whole-mount staining of dermal adipocytes (Plin1, marks the surface of lipid droplets) and HFs (K14). B: time course of dermal adipocyte lipolysis along the 24-hour fasting and 24-hour refeeding periods. α6 outlines the HF, and BODIPY marks lipid droplets (n=30, lipid droplets from three mice, One-Way ANOVA). C: lipolysis of dermal adipocytes (bottom) and apoptosis of HFSCs (top) in AdipoQCreER;Atglfl/fl (ATGL cKO) mice. D: Lhx2CreER;Cpt1afl/fl (CPT1A cKO) mice after 24-hour fasting (n=30, HFs from six mice, two-tailed unpaired t-test). E: apoptosis of HFSCs upon FFAs intradermal injection on AL mice. (n=30 HFs from 3 mice, One-Way ANOVA).<\/span><\/p>

图3 禁食诱导的微环境脂肪细胞脂解驱动HFSC凋亡(根据参考文献[10]修改)<\/span><\/p>

Fig.3 Fasting-induced lipolysis in niche adipocytes drives HFSC apoptosis (modified from reference [10])<\/span><\/p>


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5 禁食通过激活肾上腺抑制毛囊再生<\/p>

为了探究禁食信号如何传递到皮肤并诱导真皮脂肪细胞脂解从而导致HFSC凋亡, 我们首先关注了靠近真皮脂肪细胞的交感神经[25]。通过使用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)神经毒素去除皮肤中的交感神经[26]后发现, 即使交感神经被去除, 禁食时真皮脂肪细胞的脂解和HFSC的凋亡仍然存在, 这排除了交感神经支配的作用。另一种可能的机制涉及肾上腺, 其在调节机体对禁食的适应性反应中起着核心作用[27-29]。禁食会导致全身瘦素水平下降, 从而刺激下丘脑神经元, 通过下丘脑–垂体–肾上腺(HPA)轴启动激素级联反应, 促使肾上腺释放激素(主要为皮质酮和肾上腺素)进入血液。这些激素具有显著的促脂解功能。既往研究表明, β3-肾上腺素受体(beta-3 adrenergic receptor, ADRB3)和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)在真皮脂肪细胞中表达[30]。因此, 我们假设禁食激活肾上腺释放的激素诱导真皮脂肪细胞脂解, 从而介导禁食对HFSC和毛囊再生的影响。<\/p>


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为验证这一假设, 我们监测了ADF小鼠在24小时禁食和24小时再喂食周期内血液中瘦素、肾上腺素和皮质酮的水平变化(图4A)。在禁食的最初12小时内, 这些激素水平保持相对稳定。然而, 在禁食超过12小时后, 瘦素水平显著下降, 同时肾上腺素和皮质酮水平显著升高, 表明肾上腺被激活(图4A)。这一现象与真皮脂肪细胞的显著脂解及HFSC的凋亡同步发生(图3B和图2F)。在重新进食后, 激素水平迅速恢复正常。这些数据表明, 禁食期间肾上腺激活、真皮脂肪细胞脂解及HFSC凋亡之间存在强相关性。我们在未禁食的情况下向皮肤内注射高浓度的皮质酮或肾上腺素, 发现真皮脂肪细胞发生剧烈脂解, 同时HFSC出现显著凋亡(图4B和图4C)。为验证肾上腺释放激素在这一过程中发挥主要作用,我们对小鼠进行了双侧肾上腺切除术(ADX), 并将其与假手术对照组一起接受ADF处理。结果显示,在ADX小鼠中, 禁食诱导的真皮脂肪细胞脂解和HFSC凋亡均显著减少(图4D和图4E)。因此, 我们的研究表明, 延长的禁食时间通过激活肾上腺释放脂解激素, 这些激素作用于真皮脂肪细胞, 诱导脂解并释放FFA, 诱导HFSC发生凋亡, 导致毛囊再生被抑制。<\/p>


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A: ELISA测量24小时禁食和24小时再喂养期间血浆瘦素、皮质酮和肾上腺素水平(n=5, 单因素方差分析)。B: 皮下注射皮质酮或肾上腺素引起真皮脂肪细胞的脂解。C: 皮下注射皮质酮或肾上腺素导致HFSC的凋亡(n=30, 30个毛囊来源于3只小鼠, 单因素方差分析)。D: 在肾上腺切除(ADX)小鼠中, 禁食诱导的真皮脂肪细胞脂解被挽救(n=30, 30个脂滴来源于3只小鼠, 单因素方差分析)。E: 在ADX小鼠中, 禁食诱导的HFSC凋亡被挽救(n=30, 30个毛囊来源于3只小鼠, 单因素方差分析)。<\/span><\/p>

A: ELISA measurement of plasma leptin, corticosterone, and epinephrine levels during the 24-hour fasting and 24-hour refeeding periods (n=5, One-Way ANOVA). B: intradermal injection of corticosterone or epinephrine causes lipolysis of dermal adipocytes. C: apoptosis of HFSCs (n=30, HFs from three mice, One-Way ANOVA). D: fasting-induced lipolysis in dermal adipocytes was blocked in ADX mice. (n=30, lipid droplets from three mice,One-Way ANOVA). E: fasting-induced apoptosis of HFSCs was blocked in ADX mice. (n=30, HFs from three mice, One-Way ANOVA).<\/span><\/p>

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图4 禁食激活肾上腺引发niche脂肪细胞的脂解及HFSCs的凋亡(根据参考文献[10]修改)<\/span><\/p>

Fig.4 Fasting activates adrenal glands to induce lipolysis in niche adipocytes and apoptosis in HFSCs (modified from reference [10])<\/span><\/p>


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6 禁食引起HFSC中的ROS升高, 诱导细胞凋亡<\/p>

为了研究禁食引起 HFSC 死亡的分子机制, 我们使用荧光激活细胞分选(FACS)从对照组和禁食组小鼠中分离HFSC, 并进行了RNA测序, 发现禁食小鼠的HFSC显著上调了脂肪酸代谢、氧化应激反应和线粒体功能障碍相关的代谢和信号通路。由于细胞氧化应激通常来源于活性氧(ROS)的增加, 我们使用MitoSox染料对分离出的HFSC的线粒体超氧化物水平进行检测。结果显示, 在禁食24小时后, HFSC中的MitoSox信号显著增强, 表明线粒体ROS水平增加(图5A)。<\/p>


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为了进一步验证禁食对HFSC线粒体功能的影响, 我们利用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)检测线粒体膜电位, 发现禁食处理后的HFSC中TMRM信号明显减弱, 提示线粒体功能障碍(图5A)。此外, 通过8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)染色观察到禁食HFSC中的氧化性DNA损伤增加, 表明禁食引发了更强的细胞氧化应激(图5B)。透射电子显微镜(TEM)图像显示, 禁食HFSC的线粒体嵴结构退化, 这是线粒体损伤的典型特征(图5C)。这些数据表明, 禁食通过促进脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)和ROS生成, 导致HFSC发生氧化损伤并诱导细胞凋亡。在RNA-seq数据中, 我们发现与禁食期间不会发生凋亡的表皮干细胞(EpiSC)相比, HFSC中抗氧化基因表达水平较低, 使其更容易受到ROS的损害。因此, 我们尝试通过外源性抗氧化剂来缓解HFSC的氧化压力并防止细胞凋亡。结果显示, 局部涂抹维生素E或过表达关键抗氧化酶—过氧化氢酶(CAT)[31], 均能显著降低禁食诱导的HFSC凋亡, 并缓解禁食对毛囊再生的抑制(图5D和图5E)。<\/p>


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A: 通过MitoSox Red测量HFSCs中的mROS, 通过TMRM测量小鼠HFSCs在24小时禁食后的线粒体膜电位(n=3)。MitoSox阳性对照: 500 μmol/LH2O2; TMRM阳性对照: 碳酰氰基对氯苯基肼(CCCP, 氧化磷酸化解偶联剂)。B: 24小时禁食后HF中的8-oxoG染色(n=3)。C: 透射电镜下HFSCs的超微结构。伪彩表示正常HFSCs(绿色)和凋亡的HFSCs(红色)。白色箭头标记禁食后HFSC中损伤的线粒体(蓝色框)。D: VE的局部施用或过表达过氧化氢酶(CAT OE)可挽救HFSCs在禁食后的凋亡。E: 在ADF下接受 VE或CAT OE处理的小鼠毛发生长(n=3~5)。<\/span><\/p>

A: measurement of mROS by MitoSox Red and mitochondrial membrane potential by TMRM in HFSCs from mice upon 24-hour fasting (n=3). Positive controls: 500 μmol/L H2O2 (for MitoSox), carbonyl cyanide m chlorophenylhydrazone (CCCP, an oxidative phosphorylation uncoupler, for TMRM). B: 8-oxoG staining of HFs after 24-hour fasting (n=3). C: ultrastructure of HFSCs under TEM. Pseudo-coloring indicates normal HFSCs (green) and apoptotic HFSCs (red). White arrowheads mark the damaged mitochondria in fasted HFSC (blue box). D: topical application of VE, or genetic overexpression of catalase (CAT OE) rescued HFSC apoptosis upon fasting. E: hair regrowth of mice receiving VE or CAT OE under ADF (n=3-5).<\/span><\/p>

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图5 HFSCs中的ROS升高导致凋亡, 增强抗氧化能力可防止HFSCs在禁食时的凋亡(根据参考文献[10]修改)<\/span><\/p>

Fig.5 Elevated ROS in HFSCs leads to apoptosis, and enhancing antioxidant capability prevents HFSC apoptosis upon fasting (modified from reference [10])<\/span><\/p>


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7 脂肪酸氧化诱导HFSC凋亡并抑制人类毛发生长
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为了确定使用FFA是否也会诱导人类HFSC中的ROS升高和细胞凋亡, 我们使用健康供体的头皮毛囊建立了人类毛囊外植体培养模型, 并用FFA对其进行处理[32], 发现HFSC中处于活跃增殖状态的HFSC和祖细胞凋亡增加[33], 与我们在小鼠HFSC中的发现一致(图6A)。为了确定间歇性禁食是否影响人类的毛发生长, 我们进行了一项人群随机对照试验(RCT)研究(Westlake Precision Nutrition Study 2,Clinicaltrials.gov NCT05800730)。首要结局为间歇性禁食对血糖稳态的影响, 而毛发生长的变化则作为次要结局进行测量。为了确定毛发生长的变化,我们在基线期和干预期结束时进行头发生长速度测定: 剃掉头皮上1 cm2区域内的现有毛发, 然后测量3天后重新长出的头发的长度(图6B)。与我们在小鼠模型中的发现一致, 间歇性禁食组别的人表现出显著的毛发生长变缓: 与对照组相比, TRD组的平均毛发生长速度降低了18%(P=0.002 8, 图6C和图6D)。虽然毛干密度没有显示出显著变化, 但许多重新长出的头发长度变得更短、直径更细(图6E)。这表明间歇性禁食在人类中, 同样对HFSC和毛发生长产生不利影响。<\/p>


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A: 左图为对经FFA或载体处理的培养人毛囊(HFs)进行EdU和aCAS3全毛囊染色。右上图为对经FFA或对照处理的人毛囊进行aCAS3、角蛋白15(K15, 标记人毛囊干细胞的标志物)和EdU的染色(n=9~12个毛囊, 双尾非配对t检验)。B: Weprecision-2人类随机对照试验(RCT)中饮食干预的示意图。C: 干预最后3天的平均毛发生长速度(毫米/天)。D: 干预后毛发密度的变化。E: 在基线期或干预期剃毛后3天重新生长的毛发。红色箭头指示异常毛发。<\/span><\/p>

A: left, whole-mount staining for EdU and aCAS3 of cultured human HFs treated with FFA or vehicle. Right top, staining for aCAS3, keratin 15 (K15, a marker for human HFSC), and EdU of human HFs treated with FFA or vehicle (n=9-12 HFs, two-tailed unpaired t-test). B: schematic of dietary intervention in the Weprecision-2 human RCT study. C: average hair growth speed (millimeter per day) in the last three days of intervention. D: changes in hair shaft density after intervention. E: hairs regrown three days post-shaving during baseline or intervention periods. Red arrowheads mark the abnormal hair shafts.<\/span><\/p>

图6 代谢切换到脂肪酸氧化(FAO)诱导HFSC凋亡并抑制人类毛发生长(根据参考文献[10]修改)<\/span><\/p>

Fig.6 Metabolic switching to FAO induces HFSC apoptosis and inhibits hair growth in humans (modified from reference [10])<\/span><\/p>


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8 总结与展望
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间歇性禁食近年来已在全球范围内得到广泛应用, 尽管关于其代谢益处已有许多报道, 但这种剧烈的代谢波动对干细胞功能和组织更新的影响和机制, 仍然不清楚。在本研究中, 我们以毛囊干细胞和毛囊再生为模型, 发现间歇性禁食期间肾上腺和干细胞微环境中的脂肪细胞之间存在密切的器官间通讯, 结果促使激活的成体干细胞发生凋亡, 破坏了正常的组织再生过程。由于脂肪细胞是许多干细胞系统的常见微环境成分, 我们推测这也可能影响其他组织再生过程。在进化过程中, 野生动物和我们的人类祖先都面临着食物供应的波动, 使得禁食成为一种常见现象。这一机制可能使它们停止外周组织再生, 为大脑等更重要的器官节省资源, 从而促进适应和生存。同时, 我们的研究表明, 通过外源性补充抗氧化剂来增强HFSC的抗氧化能力可以显著减轻间歇性禁食对毛囊再生的抑制作用, 这为减轻间歇性禁食在应用中产生的不利影响提供了参考策略。<\/p>


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我们的研究结果阐明了间歇性禁食深刻影响成体干细胞和组织生物学的原理和机制, 并概括出了研究此类影响的综合策略。考虑到间歇性禁食在全球范围内的广泛采用, 在未来, 彻底评估各种禁食方案对不同干细胞系统的影响将非常重要。了解不同干细胞和组织反应的复杂性对于优化人类的饮食干预策略, 减轻对组织生物学的不利影响同时保留其益处至关重要。<\/p>


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参考文献 (References)<\/span><\/p>

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张兵, 西湖大学生命科学学院研究员。2007年毕业于山东大学; 2015年获得美国凯斯西储大学生物化学博士学位; 2015至2020年在美国哈佛大学干细胞与可再生生物学系任职博士后, 从事哺乳动物皮肤干细胞调控与皮肤和毛发再生的研究。曾先后获得哈佛大学杰出教学奖和Charles A. King Trust博士后奖金。2020年秋季入职西湖大学任研究员。张兵研究组的主要方向为系统性因素对皮肤干细胞的调控以及皮肤和毛发再生, 代表性研究工作在Nature、Cell<\/em>等国际学术期刊上发表。<\/p>","cshort2":"
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张兵, 西湖大学生命科学学院研究员。2007年毕业于山东大学; 2015年获得美国凯斯西储大学生物化学博士学位; 2015至2020年在美国哈佛大学干细胞与可再生生物学系任职博士后, 从事哺乳动物皮肤干细胞调控与皮肤和毛发再生的研究。曾先后获得哈佛大学杰出教学奖和Charles A. King Trust博士后奖金。2020年秋季入职西湖大学任研究员。张兵研究组的主要方向为系统性因素对皮肤干细胞的调控以及皮肤和毛发再生, 代表性研究工作在Nature、Cell<\/em>等国际学术期刊上发表。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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肌肉干细胞对骨骼肌健康的多重调控<\/span>
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胡苹1,2<\/sup>*<\/span><\/p>

(1<\/sup>广州医科大学附属第五医院广东省生物靶向与诊治与康复工程技术研究中心, 广州 510005; 2<\/sup>广州国家实验室, 广州 510005)<\/span><\/p>


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【摘要】肌肉干细胞是存在于成体骨骼肌中的一种组织干细胞, 能够特异性分化为肌管细胞,从而实现对骨骼肌损伤的修复, 是骨骼肌损伤修复再生的主要执行者。肌肉干细胞具有较高的异质性, 其命运转化受到微环境因子和细胞内源转录与表观遗传网络的精密调控。随着更多准确模拟患者表型的动物模型的建立, 在这些模型中的新研究结果表明肌肉干细胞病变是很多骨骼肌疾病发生和发展的重要原因, 同时肌肉干细胞功能退变也是青少年特发性脊柱侧弯等传统意义上的非骨骼肌疾病的发生与发展的重要原因。因此, 建立有功能的肌肉干细胞的体外长期扩增体系对于通过细胞治疗的方式治疗肌肉干细胞相关的骨骼肌和非骨骼肌疾病有重要意义。<\/p>

【关键词】肌肉干细胞; 再生; 骨骼肌疾病<\/p>


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The Multiple Roles of Muscle Stem Cells in Skeletal Muscle Health<\/p>

HU Ping1,2<\/sup>*<\/span><\/p>

(1<\/sup>Key Laboratory of Biological Targeting Diagnosis,Therapy and Rehabilitation of Guangdong Higher Education Institutes, the Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510005, China; <\/span>2<\/font><\/sup>Guangzhou Laboratory, Guangzhou 510005, China<\/span>)<\/span><\/p>


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【Abstract】Muscle stem cells are a group of tissue stem cells present in skeletal muscles. Muscle stem cells can specifically differentiate to myotubes and support the regeneration of skeletal muscles. Muscle stem cells are the major executors of muscle regeneration. They are highly heterogeneous and regulated by a well knitted network of microenvironment and cell intrinsic molecular signaling. Not only many skeletal diseases but also nonmuscle diseases like adolescent idiopathic scoliosis turn out to be caused by the dysfunction of muscle stem cells. Therefore, muscle stem cell transplantation will improve and cure these stem cell related diseases. The establishment of the in vitro expansion system to expand functional muscle stem cells has great impacts on the development of cell therapies for these muscle stem cell related diseases.<\/p>

【Keywords】muscle stem cells; regeneration; muscle diseases<\/p>


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1 肌肉干细胞与骨骼肌再生<\/p>

骨骼肌是体内最大的组织器官, 不仅能够通过收缩产生力, 支持集体的主动运动、姿态维持及呼吸, 而且具有重要的代谢和免疫调节功能。骨骼肌具有较强的再生能力, 能够高效修复日常活动导致的骨骼肌磨损及拉伤、扭伤等急性骨骼肌损伤[1-2]。骨骼肌的再生主要是由肌肉干细胞(muscle stem cells, MuSCs)执行的。MuSCs是存在于成体骨骼肌中的组织干细胞, 具有自我更新能力, 能够特异性地分化为肌管细胞, 从而实现对骨骼肌损伤的修复[3]。<\/p>


<\/p>

肌肉干细胞处在肌膜(membrane of myofibers)和基底膜(basal membrane)之间的干细胞巢(niche)中(图1)[4], 处于G0期的静息(quiescence)状态。在骨骼肌稳态下, 干细胞巢中的胞外基质(extracellular matrix, ECM)、多种分泌因子等共同构成稳定的微环境, 维持肌肉干细胞的静息[1,5]。在骨骼肌稳态时,MuSCs所处静息态的深浅程度并不相同, 有较强的异质性(heterogeneity)。一群表达Gli1的MuSCs处在更浅的静息状态, 在损伤发生时首先被动员[6]。损伤发生后, MuSCs被激活回归细胞周期, 进入细胞周期后, MuSCs经过短暂扩增, 分化为成肌细胞(myoblasts),成肌细胞经过扩增后, 一方面可以与受损肌纤维融合, 进行损伤修复; 另一方面, 也可以独立分化为肌管细胞(myotubes)后形成新的肌纤维, 完成损伤修复。同时, MuSCs也重新回到静息态, 为下一次的损伤修复做准备[1,5](图2)。这一过程贯穿整个生命周期, 对保持健康的骨骼肌至关重要。<\/p>


<\/p>

绝大多数MuSCs表达paired box家族转录因子Pax7。Pax7被认为是MuSCs的最重要的标志基因。有少量MuSCs不表达Pax7, 而表达同属paired box家族的转录因子Pax3。在正常骨骼肌损伤修复中, 由于Pax3+ MuSCs细胞数量很小, 因此其对再生的贡献非常小。但是Pax3+ MuSCs具有较低的内源活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平, 在辐射等恶劣环境下具有更强的增殖能力[7-8]。Pax3+ MuSCs可能是在进化中被选择出来在体内用于在恶劣环境下保持骨骼肌再生能力, 维护骨骼肌功能的干细胞。<\/p>


<\/p>

\"HP-1.jpg\"/<\/p>


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图1 肌肉干细胞在骨骼肌中的位置(引自参考文献[4])<\/span><\/p>

Fig.1 The localization of muscle stem cells (cited from reference [4])<\/span><\/p>


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\"HP-2.jpg\"/<\/span><\/p>

图2 肌肉干细胞在再生中的命运转变<\/span><\/p>

Fig.2 The conversion of muscle stem cell fate during regeneration<\/span><\/p>

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<\/p>

2 肌肉干细胞的活性调控<\/p>

在骨骼肌稳态和损伤修复过程中, MuSCs从静息到激活, 从增殖到分化, 每一步命运改变都受到严格的调控。参与调控MuSCs命运转变的既包括多种微环境细胞和微环境因子, 也包括干细胞的多种内源信号通路。<\/p>


<\/p>

损伤发生时, 不仅损伤部位的物理和化学微环境会发生显著的改变, 而且还会有来自损伤部位的因子通过血管被运送到全身, 产生远程效应。例如,损伤小鼠后腿一侧骨骼肌之后, 损伤部位会产生肝生长因子激活因子(hepatocyte growth factor activator,HGFA), 远程调控对侧腿骨骼肌中的MuSCs, 激活其中的mTOR信号通路使其进入GAlert状态, 更快地响应损伤信号离开静息态激活[9]。对于Gli1+MuSC亚群的进一步研究表明, 感受对侧损伤信号进行响应的主要是Gli1+ MuSCs, GAlert主要来源于Gli1+MuSCs[6]。<\/p>


<\/p>

损伤发生后, MuSCs保持静息的微环境被破坏。损伤既会破坏肌膜和基底膜, 从而改变MuSCs周围的ECM种类和结构, 还会由于血管的破裂导致大量炎症细胞的浸润。除了细胞和ECM微环境的变化外,损伤还会导致大量细胞死亡, 从而导致多种细胞内容物的释放, 同时, 各种微环境细胞也会分泌多种因子, 造成MuSCs周围的化学微环境发生重大改变, 从而与细胞内源信号网络共同改变MuSCs的命运。<\/p>


<\/p>

在急性损伤发生的早期, 肌纤维受损后会发生大量死亡。这些受损肌纤维发生程序性坏死(necroptosis)。发生程序性坏死的肌纤维激活TNC(Tenasin C)的表达, 随着程序性坏死细胞膜的破裂,TNC随其他细胞内容物一起被释放到损伤部位, 进入MuSCs的微环境。TNC的N-端存在类EGF结构域(EGF like domain), 这一结构域可以模拟EGF与MuSCs的EGF受体(EGF receptor, EGFR)结合, 进而激活EGFR信号通路, 促进MuSCs的增殖[10]。<\/p>


<\/p>

受损肌纤维的存在还会激活免疫系统, 造成大量炎症细胞的浸润, 从而诱发急性炎症反应。这类在再生过程中发生的无菌炎症与感染诱发的炎症有很大的区别, 无菌炎症在骨骼肌再生中发挥重要的调控作用[1-2,10-11]。巨噬细胞在骨骼肌再生过程中分泌多种因子调控MuSCs从激活、增殖到分化的多种命运转换[1-2,11-12]。T细胞在损伤发生后被大量招募至损伤部位并被激活。由T细胞介导的炎症是骨骼肌再生所必需的, 缺乏T细胞的免疫缺陷型小鼠表现出明显的骨骼肌再生障碍, 移植T细胞可以纠正免疫缺陷小鼠的骨骼肌再生障碍, 说明T细胞在骨骼肌再生中扮演不可或缺的角色。进一步的研究发现,T细胞分泌的四种炎症因子(IL-1α、IL-13、TNFα、IFNγ)组合能够保持MuSCs的干性, 同时促进MuSCs的增殖, 实现具有干性的MuSCs的扩增[13]。大部分组织干细胞都难以在体外进行功能性扩增, 在体外培养后的组织干细胞或者无法有效扩增, 或者在扩增过程中丢失干性, 无法在体内支持再生。因此阐明体内组织干细胞的增殖原理对于建立组织干细胞在体外的高效功能性扩增体系具有重要的指导意义。<\/p>


<\/p>

基于对MuSCs体内免疫微环境的研究, 在体外MuSCs扩增体系中加入IL-1α、IL-13、TNFα、IFNγ四种炎症因子组合后, MuSCs在体外培养体系中的增殖能力显著增强。MuSCs在体外培养超过24小时后会发生干性丢失, 移植入体内后丧失在体内再生为肌纤维的能力。在加入四种炎症因子后, MuSCs可以在体外长期传代至p40, 每一代MuSCs均具有MuSCs的分子特征, 在移植入体内后均能够高效支持对急性损伤的修复。在体外长期扩增的MuSCs移植入体内之后, 能够进入体内的干细胞库, 进入静息状态。在体外长期扩增后的MuSCs在移植后不仅能够支持对移植时损伤的修复, 而且在发生后续骨骼肌损伤时, 进入体内干细胞库的MuSCs可以被再次激活, 支持对后续损伤的修复。加入四种炎症因子后培养的MuSCs在体内具有干细胞的全部性质, 说明通过模拟体内MuSCs的免疫微环境, 在体外可以高效扩增保持完整干性的有功能的MuSCs, 为骨骼肌损伤和骨骼肌疾病的细胞治疗提供足量的优秀种子细胞[13]。<\/p>


<\/p>

在受到微环境的调控的同时, MuSCs的增殖、分化等命运转换还受到复杂的表观遗传和转录调控。bHLH(basisc helix-loop-helix)家族转录因子MyoD长期以来被认为是肌向分化的核心转录因子[3,5], 能够进一步激活分化关键转录因子Myogenin的表达。Myogenin同样属于bHLH转录因子家族, 能够激活终末分化关键基因Myh1、MCK等的表达[1]。FoxO3能够与Pax7相互作用, 促进MuSCs中MyoD的表达,从而起始MuSCs的分化[14]。对全基因组转录因子的分析表明, FoxO3与MyoD共同决定MuSCs的超级增强子[15], 在MuSCs命运转换中发挥多面功能。FoxO3既能够在静息态MuSCs中促进静息, 抑制激活[16]; 又能够在激活的MuSCs中促进MyoD表达, 促进MuSCs分化[14]。转录辅因子Vgll4在MuSCs增殖时期作为Yap信号通路的抑制因子, 通过与YAP竞争性结合TEAD4转录因子, 抑制YAP靶基因CTGF等的转录, 防止MuSCs过度增殖。在分化起始时, Vgll4转变为转录激活辅因子, 通过与TEAD4和MyoD形成三元复合物, 激活Myogenin的转录[17]。<\/p>


<\/p>

Myogenin基因的转录还受到DNA甲基化的调控。DNA双加氧酶Tet2可以通过氧化Myogenin增强子中MyoD结合位点附近的甲基化CpG岛, 进而降低MyoD结合位点附近的DNA甲基化水平, 从而稳定MyoD的结合。通过这一机制, Myogenin基因可以实现稳定的转录激活[18]。<\/p>


<\/p>

MuSCs的命运转变还受到多种非编码RNA的调控。6种微小RNA(microRNAs, miRs) miR-1、miR-133a/b、miR-206、miR-208b、miR-499在骨骼肌中特异性高表达, 被称为myoMiRs, 调控骨骼肌的胚胎发育与成体骨骼肌中MuSCs的增殖与分化[19]。其他miRs在MuSCs中也发挥重要的调控作用[1]。这些miRs的表达水平受到宿主基因的转录及miRs的加工成熟等多方面的调控。例如, RNA结合蛋白Msi2与HuR共同抑制miR7a-1的成熟, miR7a-1通过结合节律基因Cry2 3′UTR序列抑制Cry2的翻译。Cry2能够促进MuSCs的分化, 因而Msi2和HuR这一对RNA结合蛋白通过双重抑制机制促进MuSCs的分化[20]。<\/p>


<\/p>

除了miRs外, 长非编码RNA也对MuSCs的命运转变发挥重要的调控作用。长非编码RNA Lnc17000113A16RIK通过促进肌源转录因子MEF2D的翻译进而促进MuSCs的翻译[21]。长非编码RNAMyolncR4能够编码微肽LEMP, 促进MuSCs的分化[22]。<\/p>


<\/p>

MuSCs的内源性调控机制涉及细胞活动的方方面面, 还需要很多深入研究, 阐明MuSCs从静息到激活、从激活到增殖、从增殖到分化的多重命运转化的精密调控机制。<\/p>


<\/p>

3 肌肉干细胞与骨骼肌衰老和疾病<\/p>

MuSCs不仅在骨骼肌损伤修复再生中作为再生的基本执行细胞发挥重要的作用, 而且也是骨骼肌衰老与疾病发生、发展的关键细胞群体。骨骼肌的衰老包括骨骼肌质量的降低、肌力等功能的衰减、再生能力减弱等。增龄导致的骨骼肌功能病态功能蜕变称为肌少症(sarcopenia)。目前肌少症的成因尚不清楚, 缺乏准确、客观、简便的早期诊断方法和有效的治疗方法。衰老的骨骼肌高表达分泌因子Dkk3, Dkk3能够抑制骨骼肌细胞中的Akt信号通路, 促进FoxO3和ꞵ-Catenin入核, 新入核的FoxO3与ꞵ-Catenin相互作用, 共同激活骨骼肌特异性E3泛素连接酶Atrogin 1和MurF 1的表达, 从而加速骨骼肌的萎缩。由于Dkk3是分泌因子, 因此一块骨骼肌的衰老可以诱导多块肌肉的衰老, 在全身“传染”[23]。除了肌肉萎缩之外, 由于MuSCs的增殖和分化能力减弱, 衰老骨骼肌的再生能力显著降低。衰老MuSCs的功能减弱受到多种因素的调控, 例如由于细胞自噬水平降低造成ROS的累积[24]。来源于衰老骨骼肌的MuSCs中的Msi2表达水平降低, 从而使得Msi2对miR-7a-1成熟的抑制能力降低, 提高成熟miR-7a-1在MuSCs中的表达水平, 抑制MuSCs的分化, 造成衰老骨骼肌的再生能力减弱[20]。针对这些衰老因素进行靶向干预能够延缓和逆转骨骼肌的衰老。例如, 通过RNAi敲低Dkk3的表达能够在衰老小鼠中有效地改善骨骼肌功能, 提高骨骼肌质量, 逆转骨骼肌衰老, 是潜在的肌少症治疗方法[23]。<\/p>


<\/p>

很多骨骼肌疾病也与MuSCs功能障碍密切相关。强直性肌营养不良(myotonic dystrophy, DM1)是一种多系统遗传疾病, 影响骨骼肌、平滑肌和心肌, 患者肌肉强直、无力、吞咽困难、心律失常、学习困难、发生白内障等, 目前没有有效的治疗药物。这一疾病是常染色体隐性遗传疾病, 由DMPK(myotonic dystrophy protein kinase)基因3′UTR区域的CTG重复序列异常扩增造成。在小鼠DMPK基因的3′UTR区域添加80个CTG重复单元模拟患者的基因突变获得的DM1疾病模型仅能够模拟患者的少数轻微症状, 无法模拟临床的复杂多系统病变。应用单倍体细胞“人造精子”技术构建DMPK及其邻近基因SIX5、DMWD、MBNL1的半敲除杂合小鼠, 能够模拟DM1临床患者的全部多系统病变, 揭示DMPK 3′UTR区域CTG重复序列的异常扩增导致染色质结构异常, 干扰DMPK基因及其邻近基因的表达。这一染色质结构异常导致的多基因表达异常使DM1多系统病变发生。应用这一新型DM1疾病模型小鼠, 发现DM1 MuSCs分化异常, 首次模拟出DM1患者中的MuSCs功能异常, 为DM1治疗药物开发提供了新的靶细胞[25]。<\/p>


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杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是由Dystrophin单基因突变导致的伴X隐性遗传疾病, 在男孩中的发病率为1/3 500。DMD主要表现为骨骼肌从远端向躯干中心的渐进性萎缩,在疾病晚期因呼吸系统并发症或心力衰竭而死亡。DMD长期以来被认为是由于终末分化的骨骼肌损毁而导致的疾病。通过模拟Dystrophin基因缺失制备了小鼠、狗、猪等动物模型, 这些模型在疾病机制研究、新药评价等工作中广泛应用[26-28]。但是,这些动物模型中DMD的进程与人类患者中的情况相去甚远, 使得对疾病进展的机制及药物评价的准确性不高。非人灵长类动物与人类在基因组序列上最为接近, 在生理、解剖、发育方面也高度相似, 能够更好地模拟人类疾病。通过CRSPR/Cas9介导的基因编辑技术, 科学家制备了DMD非人灵长类猕猴模型[29]。该模型在疾病发生的非常早期即可模拟DMD患者的下肢无力、表征肌肉损毁的血清学指标上调、步态改变等行为学特征, 以及肌肉严重纤维化、肌肉损毁等组织学表型。在DMD早期的非人灵长类模型中, 通过骨骼肌单细胞测序分析发现骨骼肌中有大量免疫细胞浸润, 与临床观察中看到的患者骨骼肌中免疫细胞增多, 发生炎症等症状相吻合[29]。对于骨骼肌中的FAPs(fibro-adipo progenitors)的研究表明, 与小鼠中的情况不同, 虽然骨骼肌发生了严重的纤维化, 但是FAPs细胞并没有大量增殖[29]。DMD非人灵长类模型中, FAPs细胞亚群之间的谱系关系紊乱, 同时所有亚群中纤维化相关基因的表达都显著上调, 提示DMD发病早期骨骼肌的纤维化可能是由于FAPs细胞中普遍的纤维化基因上调导致的。TGFꞵ信号通路是目前激活纤维化基因表达的主要信号通路。但是, DMD早期骨骼肌中的纤维化却不受TGFꞵ信号通路的调控。长期以来, DMD的发病机制一直被认为是肌纤维的持续损毁。持续的肌纤维损毁会激活MuSCs, 发生持续的骨骼肌损伤修复, 导致MuSCs耗竭。而在非人灵长类DMD模型中的研究则表明, MuSCs在疾病的早期即已经发生显著的细胞内源性改变, 细胞凋亡的比例升高, 表现出明显的细胞内源性分化障碍[29]。因此, DMD不仅是发生在分化肌纤维中的肌肉损毁的疾病, 同时也是一种干细胞疾病[29]。治疗DMD不仅要修正肌纤维中的问题, 而且要修正MuSCs的功能障碍, 为DMD的治疗提供了新的路径。<\/p>


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MuSCs不仅在传统的骨骼肌疾病中发挥重要的功能, 而且还在一些非骨骼肌疾病的进展中发挥作用。青少年特发性脊柱侧弯(adolescent idiopathic scoliosis, ALS)是多发于青春期女性中的疾病, 其发病原因不清楚。我们的研究表明, ALS中凹侧椎旁肌中的MuSCs中ESR1的表达水平显著下调, 进而导致ESR1信号通路下调。而凸侧椎旁肌中的MuSCs中ESR1的表达水平保持正常。ESR1信号通路水平下调导致MuSCs分化障碍。两侧椎旁肌中MuSCs功能的不对称导致凹侧椎旁肌的肌纤维直径变小, 力量减弱, 无法为脊柱提供平衡的支撑力量, 造成脊柱侧弯。在小鼠模型中通过抑制一侧椎旁肌中的ESR信号通路可以加速AIS的进展。在AIS小鼠模型的凹侧椎旁肌中通过注射FDA批准的药品雷洛昔芬能够重新激活ESR信号通路, 恢复MuSCs的分化能力,从而显著减缓AIS的进展[30]。这一工作揭示了肌肉力学支撑对于保持正常骨骼功能的重要作用, 为骨骼疾病的治疗提供了新的思路。<\/p>


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最近的研究表明, 除了分化为骨骼肌外, 人MuSCs还具有肌腱分化潜能。在损伤的肌腱中移植MuSCs, 能够显著促进肌腱的修复, 改善运动功能[31]。肌腱损伤难以修复, 肌腱中虽然有肌腱干细胞/前体细胞存在, 但是由于其数量非常少, 在体外几乎无法扩增, 因而很难支撑再生医学应用。应用我们建立的功能MuSCs长期扩增体系, 能够获得足量优质的MuSCs, 以用于肌腱损伤修复, 为肌腱损伤的再生医学治疗提供了新的种子细胞。<\/p>


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MuSCs在多种疾病中的功能, 及针对MuSCs开发治疗方法尚需进一步深入研究。借助功能MuSCs体外长期阔体系通过干细胞移植进行细胞治疗等新的治疗方法为很多骨骼肌和非骨骼肌疾病的治疗带来了新的希望。<\/p>


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4 展望与思考<\/p>

MuSCs作为一种组织干细胞通过增殖分化直接支持骨骼肌的再生, 在骨骼肌的再生和稳态维持中发挥决定性的作用。MuSCs的研究和临床应用都需要面对MuSCs的异质性问题。MuSCs经历静息–激活–增殖–分化, 及静息态时的自我更新等多种细胞状态的转变, 单细胞测序的结果表明, 在再生过程中存在着很多处于上述状态之间的中间态细胞[32-33],使得细胞状态的异质性更为复杂。同时, 在MuSCs中还存在细胞内源性异质性, 例如Gli1+ MuSCs是一群处在更浅的静息态的MuSCs, 但是大多数静息态MuSCs在激活过程中并不经过Gli1表达的过程[6], 即Gli1+ MuSCs并不是静息态细胞激活过程中产生的中间态, 而是一个有独特基因表达模式的MuSCs亚群。在体内, 细胞状态的多样性和源于细胞内源性差异的亚群多样性组合在一起, 使得MuSCs具有很高的异质性。在疾病情况下, 异质性进一步加强[29]。进一步解析MuSCs的异质性及其驱动机制, 一方面可以加深对MuSCs细胞命运转变的路径选择的理解; 另一方面, 对于MuSCs异质性的研究有助于鉴定具有更高干性和更强增殖能力的MuSCs, 为MuSCs的临床应用提供更优的种子细胞。<\/p>


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传统上MuSCs主要在骨骼肌损伤修复中发挥作用, 骨骼肌的衰老与多数疾病更多情况下被认为是终末分化的肌纤维的代谢、蛋白稳态被破坏, 发生功能退变而发生的。通过制备能够更准确地模拟患者表型的多种动物模型, 使得获取充足的骨骼肌样品进行深入研究成为可能。这些研究表明,MuSCs的病变在多种骨骼肌疾病的发病及进展中都发挥重要的作用。因此, 在治疗骨骼肌病变的时候,对MuSCs的功能校正也是治疗的重要考虑。此外,MuSCs的功能退变在一些非骨骼肌疾病的发生、发展中也发挥重要的作用。因此, 校正和增强MuSCs的功能不仅有望治疗骨骼肌疾病, 也可以用于非骨骼肌疾病的治疗。<\/p>


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由于功能MuSCs体外长期扩增体系的建立,我们能够获得足量的优质MuSCs, 因此通过健康MuSCs移植或在MuSCs中进行基因编辑校正基因缺陷从而实现对骨骼肌疾病的治疗都成为可能。建立高效移植系统、追踪移植细胞在体内的功能及转归,进一步提高肌肉干细胞治疗的安全性和有效性都是骨骼肌疾病细胞治疗的重要研究方向。应用MuSCs进行疾病治疗有望治愈很多目前缺乏有效治疗方法的疾病。<\/p>


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胡苹, 广州国家实验室研究员、博士生导师, 入选中国科学院BR计划、上海市重大人才计划、广东省重大人才计划。主要研究领域为: 组织干细胞与成体组织再生、病变及其在再生医学中的临床应用, 代表性成果发表于Cell、Nat Commun、Cell Res、EMBO J、Dev Cell<\/em>等学术期刊。在国际上首次进行父源肌肉干细胞治疗杜氏肌营养不良的临床试验, 证实其安全性与有效性, 探索杜氏肌营养不良、肌少症、特发性脊柱侧弯等疾病的再生医学治疗新路径。<\/p>","cshort2":"
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胡苹, 广州国家实验室研究员、博士生导师, 入选中国科学院BR计划、上海市重大人才计划、广东省重大人才计划。主要研究领域为: 组织干细胞与成体组织再生、病变及其在再生医学中的临床应用, 代表性成果发表于Cell、Nat Commun、Cell Res、EMBO J、Dev Cell<\/em>等学术期刊。在国际上首次进行父源肌肉干细胞治疗杜氏肌营养不良的临床试验, 证实其安全性与有效性, 探索杜氏肌营养不良、肌少症、特发性脊柱侧弯等疾病的再生医学治疗新路径。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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水熊虫超强辐射耐受机制研究进展<\/span>
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韦懿芮 李磊* 张令强*<\/span><\/p>

(军事科学院军事医学研究院, 北京 102206)<\/span><\/p>


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【摘要】空间辐射损伤是制约人类深空探测及长期在轨驻留的关键医学问题。在多种涉核作业中, 超强辐射对人体构成严重危害, 对人员健康与安全形成了巨大威胁。水熊虫作为一种独特的多细胞生物, 其超强的抗逆能力在生物学研究中备受瞩目。该综述聚焦于水熊虫耐受超强辐射的特性, 详细阐述了水熊虫超强辐射耐受机制研究的最新进展, 及其在生物医学、辐射防护等领域的意义和潜在应用价值。<\/p>

【关键词】水熊虫; 超强辐射; 多组学; 耐受机制; 水平基因转移; 液–液相分离<\/p>


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Research Progress on the Mechanism of Radiation Tolerance of a Tardigrade<\/span><\/p>

WEI Yirui, LI Lei*, ZHANG Lingqiang*<\/span><\/p>

(Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 102206, China)<\/span><\/p>


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【Abstract】Space radiation damage is a critical medical issue that constrains human deep-space exploration and long-term on-orbit residence. In various nuclear-related work environments, ultra-high radiation poses a severe hazard to human, and a substantial threat to personnel health and safety. Tardigrades, as unique multicellular organisms, have attracted considerable attention in biological research for their exceptional stress resistance. This review focuses on the radiation tolerance characteristics of tardigrades, detailing the latest progress in the research on the ultrahigh radiation tolerance mechanism of tardigrades, as well as its significance and potential application value in fields such as biomedicine and radiation protection.<\/p>

【Keywords】tardigrade; ultra-high radiation; multi-omics; tolerance mechanism; horizontal gene transfer; liquid-liquid phase separation<\/p>


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1 水熊虫的基本介绍<\/p>

水熊虫是缓步动物(tardigrades)的俗称, 是一类微小的无脊椎动物。它们通常生活在苔藓、地衣等\r\n环境。它们广泛分布在世界各地, 甚至在深海也能\r\n发现它们的踪迹。水熊虫体长一般不超过1 mm, 身体呈桶状, 由头部、3个体节、尾节组成, 身体表面覆盖一层几丁质和蛋白质构成的角质层或角质化的\r\n背甲; 有4对短而粗的肢, 肢的末端着生锐爪; 口器由\r\n口管、口针、针托、吸咽和吸咽内的大板组成。水\r\n熊虫利用其特有的口针结构穿刺植物细胞壁, 随后\r\n借助吸咽所产生的负压吸力, 经由口管来摄取植物\r\n汁液[1]。水熊虫可以在高温、低温、高压、超强辐射、\r\n极度干燥等多种极端环境下生存, 甚至在外太空真空环境下也能存活下来。<\/p>


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\"ZLQ-1.jpg\"/<\/p>

图1 显微镜下的河南高生熊虫 <\/span><\/p>

Fig.1 Micrograph of Hypsibius henanensis<\/span><\/p>


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2 水熊虫辐射耐受机制研究现状<\/p>

自1773年首次发现水熊虫以来, 其相关研究已\r\n历经二百多年, 目前世界上有近1 500余种水熊虫被\r\n描述[2-3]。国内对水熊虫的研究主要集中在形态学、\r\n生态学、分类学等领域。在国外, 近十几年内已有\r\n多种水熊虫被报道可耐受超强辐射。文献报道拉氏\r\n变形熊虫(Ramazzottius varieornatus)表达一种特有的\r\n蛋白质—损伤抑制因子(damage suppressor, Dsup), \r\nDsup可结合DNA或核小体, 从而保护DNA免受辐射\r\n损害[4-5]。水熊虫可耐受高达3 000 Gy到5 000 Gy的\r\n伽马辐射, 是人类辐射致死剂量的近1 000倍[6-8], 这\r\n使得水熊虫成为一种独特的超强辐射研究模型。尽\r\n管如此, 水熊虫耐受超强辐射背后的机制, 目前仍知之甚少。<\/p>


<\/p>

近期, 军事科学院军事医学研究院科研团队在Science杂志发表研究论文, 报道了一种新的水熊虫物种—河南高生熊虫(Hypsibius henanensis)(图1), 按分类学划分其属于缓步动物门 –真缓步纲 –并爪目–高生熊虫科–高生熊虫属。河南高生熊虫具有高生属水熊虫的典型特征, 与其他水熊虫不同的是, 它们的小格(septulum)较短, 在腿I~III基部没有角质条(longitudinal bar)和与后爪基部连接的角质条。研究团队经过长期探索, 成功建立了河南高生熊虫实验室培养体系。河南高生熊虫寿命为2~3个月, 体长200~500 µm, 以孤雌生殖方式繁衍后代。河南高生熊虫会经历周期性蜕皮, 并将卵产在脱的皮中。研究团队发现, 河南高生熊虫在伽马射线辐照后第15天的半数致死剂量为2 000 Gy, 在4 000~5 000 Gy伽马射线辐照后, 仍有相当一部分水熊虫可存活一段时间, 表明其可耐受超强辐射。为了研究河南高生熊虫耐受超强辐射的机制, 本研究团队在国际上首次组装了具有完善注释的染色体水平的水熊虫基因组图谱。随后, 本团队整合转录组、蛋白质组响应超强辐射的动态变化及分子进化和功能特征分析, 揭示了河南高生熊虫耐受超强辐射的三类机制, 并分别对代表性关键分子进行了深入的功能和机制研究[9]。<\/p>


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3 多组学分析筛选抗辐射相关基因<\/p>

本研究团队首先对河南高生熊虫进行了基因组测序, 获得了长读长测序数据 , 结合Hi-C(high\u0002throughput chromosome conformation capture)技术, 组装了河南高生熊虫高质量的染色体水平基因组 , 其大小为112.6 Mb。利用核型分析, 进一步证实河南高生熊虫有6对染色体。基于以上数据, 研究团队鉴定出14 701个编码蛋白质的基因。利用重离子辐照装置分别以200 Gy、2 000 Gy的剂量照射河南高生熊虫, 进行转录组和蛋白质组学分析, 获得了2 801个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs), 并从分子进化角度将其分为三类: 水平转移基因(horizontal transfer genes, HTG)、水熊虫特异基因(tardigrade-specific genes, TSG)、非水熊虫特异基因(non-tardigrade-specific genes, NTSG)(图2)。本团队分别从这三类基因入手, 筛选出了辐射耐受关键基因, 并对其开展了功能和机制研究, 揭示了河南高生熊虫耐受超强辐射的关键机制。<\/p>


<\/p>

\"ZLQ-2.jpg\"/<\/p>

图2 河南高生熊虫辐照后差异表达基因(DEGs)分类<\/span><\/p>

 Fig.2 The classification of differentially expressed genes in Hypsibius henanensis after radiation<\/span><\/p>


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4 水平转移基因DODA1通过合成甜菜色\r\n素赋予水熊虫超强辐射耐受性<\/p>

水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)事\r\n件作为生物进化的关键驱动力之一, 能够促使受体\r\n物种获得新的遗传物质, 进而产生适应性变化, 为生\r\n物适应极端环境提供一种独特的途径[10-12]。本团队\r\n鉴定出河南高生熊虫通过 HGT事件获得的基因有\r\n459个, 其中高可信度基因有75个, HTG占比为0.5%\r\n到3.1%。<\/p>


<\/p>

通过分析辐照后RNA和蛋白表达水平变化, 研\r\n究团队发现在HTG中辐照上调最明显的是多巴4,5-\r\n双加氧酶(DOPA 4,5-dioxygenase)基因(DODA1), 并\r\n且发现河南高生熊虫存在5个DODA。经过系统发\r\n育分析 , 发现 DODA1~DODA4来源于蛭弧菌门细\r\n菌。DODA是甜菜色素合成过程中的关键酶, 酪氨\r\n酸经过酪氨酸羟化酶催化生成L-多巴, 而L-多巴在\r\nDODA的催化下经过一系列反应最终生成甜菜色素\r\n(图3A)。甜菜色素是一类植物色素, 此前被认为只\r\n存在于石竹目植物、少数细菌和真菌中, 广泛参与植物抗逆过程[13-14], 动物中未见报道。本研究团队\r\n通过质谱、光谱检测等系列分析, 证明了河南高生\r\n熊虫DODA1在体外以L-多巴为底物, 催化产生甜菜\r\n黄素。进一步, 对DODA1的酶学特征进行了表征, \r\n对其关键酶活性位点进行了预测和验证, 在体外证\r\n实DODA1是多巴4,5-双加氧酶, 可催化合成甜菜色\r\n素。进一步, 研究团队在人HeLa细胞中表达了河南\r\n高生熊虫DODA1, 成功在哺乳动物细胞中建立了甜\r\n菜色素合成通路(HeLa细胞中存在酪氨酸羟化酶), \r\n在体内证实了DODA1是多巴4,5-双加氧酶, 可催化\r\n合成甜菜色素, 且在人HeLa细胞中表达DODA1能有\r\n效提升HeLa细胞的抗辐射能力。<\/p>


<\/p>

电离辐射通过直接和间接方式产生生物学效\r\n应, 直接方式即电离辐射直接作用于生物大分子(如\r\nDNA、RNA、蛋白质等), 造成生物大分子结构和功\r\n能的破坏, 间接方式主要是电离辐射与细胞内含有\r\n的大量水分子相互作用, 产生氧自由基(活性氧), 活\r\n性氧对细胞造成结构和功能的损伤。有研究表明 , \r\n辐射引起的细胞损伤, 有60%~70%是由活性氧造成\r\n的[15-16]。此前的研究表明, 甜菜色素是一类很强的\r\n抗氧化剂, 可以有效清除活性氧[17-20]。细胞学实验\r\n结果表明, HeLa细胞中异源重构甜菜色素合成通路, \r\n可通过清除活性氧来减轻辐射损伤。<\/p>


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随后 , 通过非靶向和靶向多反应监测质谱\r\n(MRM-MS)检测及拉曼光谱分析, 证实河南高生熊\r\n虫体内存在甜菜色素, 在受到辐照后, 河南高生熊\r\n虫体内的甜菜色素含量增加, 且分布发生改变。为\r\n了进一步确定DODA1在河南高生熊虫中是否发挥\r\n辐射保护作用, 研究团队成功建立了基于浸泡法的\r\nRNA干扰(siRNA)策略。敲低DODA1后, 河南高生\r\n熊虫体内甜菜色素含量下降, 并且辐照后河南高生熊虫存活率下降。这表明水平转移基因DODA1介\r\n导的甜菜色素合成在河南高生熊虫耐受超强辐射中\r\n发挥重要作用。<\/p>


<\/p>

与河南高生熊虫相比, 人和其他动物以L-多巴\r\n为底物最终代谢为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上\r\n腺素, 以及黑色素, 由于不存在DODA, 无法合成甜\r\n菜色素(图3B)。而在河南高生熊虫(也包括典型高\r\n生熊虫)中, 由于DODA1的存在, L-多巴可以被代谢\r\n为甜菜色素, 并且DODA1在辐照后表达水平升高, \r\n甜菜色素大量积累, 从而起到辐射保护作用。这就\r\n是为什么河南高生熊虫可耐受超强辐射而人却不能\r\n的原因之一。<\/p>


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这部分研究揭示了河南高生熊虫通过DODA1\r\n合成甜菜色素来发挥抗氧化作用, 从而赋予水熊虫\r\n超强辐射耐受特性(图3C)。<\/p>


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\"ZLQ-3.jpg\"/<\/p>

A: 河南高生熊虫L-多巴代谢路径。B: 人L-多巴代谢路径。C: 河南高生熊虫通过从蛭弧菌门水平转移基因DODA1合成甜菜色素清除自由基发\r\n挥辐射保护效应。 <\/span><\/p>

A: the L-DOPA metabolic pathway in Hypsibius henanensis. B: the L-DOPA metabolic pathway in Homo sapiens. C: Hypsibius henanensis synthesizes \r\nbetalains to scavenge ROS in response to radiation protection effects through the horizontal transfer gene DODA1 from Bdellovibrionota.<\/span><\/p>

 图3 河南高生熊虫与人L-多巴代谢通路比较(根据参考文献[9]修改) <\/span><\/p>

Fig.3 Comparison of L-DOPA metabolic pathways between Hypsibius henanensis and Homo sapiens (modified from reference [9])<\/span><\/p>


<\/p>

5 水熊虫特异性无序蛋白TRID1介导的相分离提高DNA双链损伤修复效率进而\r\n赋予水熊虫超强辐射耐受性<\/p>

研究团队发现水熊虫特异性基因有 4 436个 , \r\n在编码蛋白质基因总数14 701个中, 所占比值约为\r\n30%, 比例远高于常见模式生物。在这些水熊虫特\r\n异性基因中, 编码高度无序蛋白的基因有1 223个, \r\n占比约27.6%, 在辐射后上调的417个特异性基因中, \r\n编码高度无序蛋白的基因有163个, 占比约39.1%。\r\n根据上述数据, 结合无序蛋白容易发生液–液相分离\r\n的特性, 我们推测无序蛋白可能在辐射耐受中发挥\r\n了重要作用。在163个辐射后上调的特异性基因编\r\n码的高度无序蛋白中, 再进一步筛选出19个含有长\r\n无序区域及在2 000 Gy特异性上调且高丰度的水熊\r\n虫较保守蛋白, 进一步, 通过无序性分析和核定位信号预测, 筛选出可能在核中定位且响应辐射的水熊\r\n虫特异无序蛋白TRID1(tardigrade-specific radiation\u0002induced disordered protein 1)。TRID1蛋白长268个氨\r\n基酸, 具有一个类朊病毒结构域(PrLD)。研究团队\r\n表达纯化了GFP-TRID1蛋白, 证明了TRID1能够在\r\n体外发生液–液相分离, 形成液滴。进一步的突变体\r\n实验证明TRID1发生相分离依赖于PrLD结构域。<\/p>


<\/p>

在人HeLa细胞中表达TRID1也可以发生液–液\r\n相分离, 使用U2OS细胞进行克隆形成和免疫荧光分\r\n析, 结果表明TRID1介导的相分离能促进DNA双链\r\n损伤修复来减少人细胞辐射损伤。进一步实验结果\r\n表明TRID1通过相分离与53BP1特异性共定位, 提高\r\nKu70蛋白的表达水平, 并促进53BP1和Ku70在DNA\r\n损伤位点的募集。<\/p>


<\/p>

在河南高生熊虫中敲低TRID1后, 辐照后其存\r\n活率下降。基于以上数据, 团队揭示了河南高生熊\r\n虫通过TRID1介导的相分离提高DNA双链损伤修复\r\n效率, 赋予了河南高生熊虫超强辐射耐受性(图4)。<\/p>


<\/p>

\"ZLQ-4.jpg\"/<\/p>

图4 水熊虫特异性蛋白TRID1介导液–液相分离提高DNA双链损伤修复效率响应辐射(根据参考文献[9]修改) <\/span><\/p>

Fig.4 Tardigrade-specific protein TRID1 mediates liquid-liquid phase separation to improve the efficiency\r\n of DNA double-strand breaks damage repair in response to radiation (modified from reference [9])<\/span><\/p>


<\/p>

6 非水熊虫特异性基因BCS1和NDUFB8\r\n增强NAD+\r\n再生促进DNA损伤修复赋予水\r\n熊虫超强辐射耐受性<\/p>

通过GO(Gene Ontolog y ) 功能分析 , 发现线\r\n粒体相关基因显著富集。线粒体呼吸链复合体 I、III、IV组装蛋白, 如BCS1[ubiquinol-cytochrome c \r\nreductase (bc1) synthesis]、NDUFB8[NADH dehy\u0002drogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex subunit 8]\r\n在辐射后显著上调, BCS1是线粒体伴侣蛋白, 对于\r\n呼吸链复合体III组装至关重要[21], NDUFB8是线粒\r\n体呼吸链复合体I组分, 介导了线粒体呼吸链复合体\r\nI、III、IV间的相互作用, 影响了线粒体呼吸链超\r\n级复合体的形成。结合基因家族扩张收缩分析, 发\r\n现河南高生熊虫有477个扩张基因家族、2 609个收\r\n缩基因家族 , 而 BCS1基因在河南高生熊虫中出现\r\n扩张, 共有7个编码BCS1的基因。我们推断BCS1\r\n可能有助于水熊虫适应超强辐射环境。我们在人\r\nHeLa细胞中表达BCS1a和NDUFB8, 进行克隆形成\r\n实验、彗星实验和免疫荧光分析, 结果表明BCS1a、\r\nNDUFB8和人BCS1L都能减轻辐射诱导的DNA损\r\n伤, 提高HeLa细胞的存活率。进一步的研究揭示了\r\n河南高生熊虫BCS1a和NDUFB8不影响ATP和ROS\r\n水平, 可能调节电子传递。同时发现, BCS1a形成了\r\n与BCS1L一样的七聚体[22–23], NDUFB8可被组装到\r\n线粒体呼吸链复合物I中, BCS1a和NDUFB8促进了\r\n线粒体呼吸超复合物I1III2IV1(SC I1III2IV1)的形成。\r\n实验证实BCS1a和NDUFB8促进了线粒体NAD+\r\n的\r\n产生, 进而增加了细胞质NAD+\r\n水平。NAD+\r\n是PA\u0002Rylation修饰的前体, DNA损伤感应蛋白PARP1利用NAD+\r\n形成PARylation修饰, 进而招募DNA损伤修\r\n复蛋白到DNA损伤位点, 启动损伤修复[24]。研究团\r\n队观察到在人细胞中表达水熊虫BCS1a和NDUFB8\r\n后, PARP1、DNA修复蛋白均在DNA损伤位点显著\r\n富集。以上数据揭示了河南高生熊虫通过BCS1a和\r\nNDUFB8增强NAD+\r\n再生, 促进DNA损伤修复, 赋予\r\n水熊虫超强辐射耐受性(图5)。<\/p>


<\/p>

\"ZLQ-5.jpg\"/<\/p>

图5 非水熊虫特异性蛋白BCS1和NDUFB8增强NAD+\r\n再生响应辐射(根据参考文献[9]修改) <\/span><\/p>

Fig.5 The non-tardigrade-specific proteins BCS1 and NDUFB8 enhance the regeneration of NAD⁺ \r\nin response to radiation (modified from reference [9])<\/span><\/p>


<\/p>

7 未来展望与应用<\/p>

本研究团队成功建立了水熊虫的实验室培养\r\n体系, 首次整合基因组、转录组、蛋白质组图谱, 并\r\n通过分子机制和功能研究, 从HTG、TSG、NTSG中\r\n发现了水熊虫三类超强辐射耐受关键机制, 增加了\r\n我们对生命极限的认识, 为水熊虫超强抗逆机制提\r\n供了新的认识, 为超强辐射防护提供了重要理论依\r\n据和潜在防护靶点。<\/p>


<\/p>

水熊虫耐受多种极端环境的特性, 具有极高的\r\n科学研究价值和生物医学应用价值。然而对这些特\r\n性背后机制的认识却很有限。由于相关技术方法尚\r\n未建立, 水熊虫目前还不是模式生物。目前的研究\r\n只是揭示了水熊虫耐受极端环境机制的冰山一角 , \r\n未来还有很长的路要走, 也会面临诸多挑战, 如培养\r\n体系的建立、基因编辑技术的建立、超微量检测技术方法的建立等。同时, 针对水熊虫超强抗辐射机\r\n制的研究不仅具有重要的科学意义, 而且其广泛的\r\n现实应用场景为多个学科领域提供了创新的应用视\r\n角。在医学领域, 其机制有助于引导开发保护正常\r\n细胞免受放疗伤害的新型药物, 同时为辐射环境下\r\n工作人员提供更优的防护策略。太空探索中, 水熊\r\n虫的抗辐射机制为开发新型太空辐射防护材料提供\r\n了灵感, 这对于保护宇航员免受宇宙射线的伤害至\r\n关重要。此外, 水熊虫的生命力极强的特性为太空\r\n生物实验提供了重要参考, 有助于了解生命在太空\r\n环境中的生存和适应机制。在生物技术领域, 水熊\r\n虫的抗辐射基因通过基因工程技术被导入其他生物\r\n体中, 可能赋予这些生物体抗辐射的能力, 有助于开\r\n发新型抗辐射作物、抗辐射动物等, 提高生物在极\r\n端环境下的生存能力。这些应用有望在未来实现 , \r\n为人类应对辐射相关挑战和探索生命奥秘持续贡献\r\n独特的价值。<\/p>


<\/p>

参考文献 (References)<\/span><\/p>

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张令强, 军事科学院军事医学研究院研究员、医学蛋白质组全国重点实验室常务副主任。主要研究方向为蛋白质泛素化修饰与疾病的发生机理及其治疗, 围绕泛素连接酶Smurf1家族、去泛素化酶OTU家族、泛素应激小体的生理功能、作用机制与靶向干预开展了系列研究; 近期在水熊虫模式化及耐受超强辐射的研究中取得新发现。作为通信和共同通信作者在Science、Nat Cell Biol、Nat Med、Nat Chem Biol、Mol Cell、Cell Res、Nat Commun<\/em>等期刊发表论文100余篇。获得国家杰出青年基金、国务院特殊津贴、中国青年科技奖、谈家桢生命科学奖创新奖、树兰医学奖青年奖等, 入选国家万人计划领军人才、国家百千万人才工程。作为第一完成人获得2项北京市科学技术奖一等奖, 授权中国专利30余项。兼任中国生物化学与分子生物学会副秘书长、理事。<\/p>","cshort2":"
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张令强, 军事科学院军事医学研究院研究员、医学蛋白质组全国重点实验室常务副主任。主要研究方向为蛋白质泛素化修饰与疾病的发生机理及其治疗, 围绕泛素连接酶Smurf1家族、去泛素化酶OTU家族、泛素应激小体的生理功能、作用机制与靶向干预开展了系列研究; 近期在水熊虫模式化及耐受超强辐射的研究中取得新发现。作为通信和共同通信作者在Science、Nat Cell Biol、Nat Med、Nat Chem Biol、Mol Cell、Cell Res、Nat Commun<\/em>等期刊发表论文100余篇。获得国家杰出青年基金、国务院特殊津贴、中国青年科技奖、谈家桢生命科学奖创新奖、树兰医学奖青年奖等, 入选国家万人计划领军人才、国家百千万人才工程。作为第一完成人获得2项北京市科学技术奖一等奖, 授权中国专利30余项。兼任中国生物化学与分子生物学会副秘书长、理事。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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父母亲本起源基因互作调控胚根干细胞龛分化<\/span>
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程天河 孙蒙祥*<\/span><\/p>

(武汉大学生命科学学院, 武汉 430072)<\/span><\/p>


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【摘要】受精卵整合了父母亲本的遗传信息后启动胚胎发生。关于父母亲本对子代胚胎的贡献问题已讨论了数十年, 已有的数据表明父母双方都参与调控了植物早期胚胎发生。遗憾的是, 父本对胚胎发育的具体调控作用, 以及相关的分子调控途径迄今仍知之甚少, 对父母亲本基因如何相互作用更是不甚了解。武汉大学有性生殖团队最新研究揭示, TREE1和它的同源物DAZ3作为父本起源基因在受精卵中通过直接抑制母本起源基因RKD2的转录, 解除RKD2对根干细胞龛分化的有害影响, 从而确保胚胎正常发育和胚后根的正常发生。这一研究结果阐明了精子的遗传缺陷如何对特定植物器官分化施加持久的父本影响, 以及父母亲本基因如何相互作用以确保正常的胚胎发生。这项工作还提出了植物器官形成的先天性调控的新途径。<\/p>

【关键词】<\/span>精细胞; 卵细胞; 受精作用; 父母亲本起源基因; 胚根原; 根干细胞龛; 拟南芥<\/p>


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Interaction of Parental-of-Origin Genes Regulates Root Stem Cell Niche Differentiation<\/p>

CHENG Tianhe, SUN Mengxiang*<\/span><\/p>

(College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China)<\/span><\/p>

【Abstract】<\/p>

The fertilization integrates genetic information from both parents and initiates embryogenesis. The involvement of parental contributions in embryo development has been a hot topic for decades. Available data suggest that both parents play roles in early embryogenesis. However, the specific processes and associated molecular pathways involved in paternal contribution to early embryogenesis and plant development is poorly understood, not to mention how the parental-of-origin genes interaction. Recently, researchers from Wuhan University reveal that TREE1 and its homolog DAZ3 as paternal-of-origin genes can directly inhibit the transcription of a maternal-oforigin gene RKD2 in fertilized egg cell, so that counteract the RKD2 maternal detrimental effects to ensure normal embryogenesis and root organogenesis. These findings shed light on how genetic abnormalities in sperm can have long-lasting paternal effects on specific plant organ differentiation, as well as how interactions between parental-oforigin genes ensure normal embryogenesis. This work also introduces a new concept regarding how plant organogenesis can be influenced by gamete quality.<\/p>

【Keywords】sperm cell; egg cell; fertilization; parental-of-origin gene; hypophysis; stem cell niche; Arabidopsis<\/em><\/p>


<\/p>

被子植物受精后, 单倍体的卵细胞与精细胞融合, 产生二倍体的合子, 随后启动胚胎发生, 形成新一代孢子体, 以此繁衍后代[1-2]。这一过程是植物世代交替的关键环节, 也是杂交育种赖以进行的生理基础[3]。因此, 自上世纪以来, 受精和早期胚胎发生一直备受研究者关注。植物受精后, 父母亲本双方的遗传信息合为一处, 成为胚胎启动发生的遗传信息基础。由此就引发了几个基本的科学问题,即来自父母亲本的遗传信息何时开始作用, 有何作用, 如何作用？特别是哪些来自父母亲本的遗传信息对胚胎发生的启动和模式建成是至关重要的？父母亲本在胚胎发育具体的发育事件中扮演了何种不同的角色？显然, 回答这些问题是深入理解胚胎发生调控机制的必备基础[4-5]。为此, 学术界开展了持续30年的广泛讨论。要回答上述问题, 必然要关注父母亲本起源基因(parental-of-origin genes)的表达与作用[6-9]。所谓父母亲本起源基因是指在胚胎中单亲表达的基因, 即只有父本, 或母本表达的基因[6]。然而, 植物的精卵细胞发育、受精过程与早期胚胎发生过程短暂, 且精卵细胞又深埋于层层母体组织之中, 分离细胞不易且难以避免污染, 研究难度大, 以至于父母亲本基因研究长期迟滞。迄今为止, 配子携带的父母亲本起源基因表达产物调控早期胚胎发生的报道很少。其中SSP(SHORT SUSPENSOR)是一个编码白细胞介素受体相关激酶IRAK(interleukin-1 receptor-associated kinase)/粒样激酶的基因, 在精细胞中转录, 但不翻译成蛋白质, 受精后, 在受精卵中翻译成蛋白, 调控合子的伸长和第一次不均等分裂[8]。另外, 在水稻中, BBM1(BABY BOOM1)基因编码一个AP2型转录因子, 也只在精细胞中表达, 卵细胞中不表达, BBM蛋白通过受精作用传递到受精卵中, 调控胚胎发生, 其在卵细胞异位表达可以启动孤雌生殖[9-10]。基于父本起源基因在受精和早期胚胎发生中的重要作用, 挖掘新的父本起源基因的任务仍任重道远。<\/p>


<\/p>

1 TREE1<\/em>和DAZ3<\/em>确系父本起源基因<\/p>

为了挖掘新的父本起源基因, 基于实验室建立的精细胞、卵细胞和早期胚胎数据库, 我们筛选出符合父本起源基因表达特点即在精细胞中表达, 卵细胞中不表达, 基因表达产物可以传递到早期胚胎中的一系列候选基因[11-14]。其中, 一个转录抑制因子TREE1和其同源基因DAZ3为关注的重点。为了验证TREE1(transcriptional repressor of EIN3-dependent ethylene-response 1)和DAZ3(duo1-activated zinc finger 3)是否为父本起源基因, 我们设计了一系列的实验。首先, 我们使用RT-qPCR技术证实, TREE1和DAZ3只在生殖相关组织中表达, 而不在营养组织中表达, 为证明TREE1和DAZ3的细胞表达特异性, 我们分别构建了TREE1-GFP和DAZ3-GFP的融合蛋白植株。基于TREE1-GFP和DAZ3-GFP融合蛋白的观察, 确证了TREE1和DAZ3只在精细胞中表达, 不在卵细胞中表达。通过融合蛋白株系和野生型正反交实验证明TREE1和DAZ3可以通过受精作用传递到早期胚胎中, 并且随着受精卵分裂启动胚胎发生而逐步降解, 到八细胞胚胎时期其蛋白完全消失。提取去雄24小时后的胚珠总RNA, 通过RT-qPCR实验以母本起源基因ECS1为阳性对照, 父本起源基因SSP为阴性对照, 再次证明TREE1和DAZ3不在卵细胞中表达[15]。综上, TREE1和DAZ3确系父本起源基因。<\/p>


<\/p>

2 TREE1参与调控根干细胞龛细胞命运决定<\/p>

为了研究TREE1和DAZ3在受精和胚胎发育过程中的功能, 我们通过基因编辑技术分别创建TREE1和DAZ3的单突变体, 分别将其命名为tree1-L1、tree1-L2、daz3-L1和daz3-L2[16]。观察tree1和daz3的表型发现, 其营养生长和生殖发育过程与野生型没有区别。考虑到TREE1和DAZ3存在极其相似的表达模式和氨基酸序列, 以及TREE1和DAZ3在同一染色体小臂上, 杂交很难获得TREE1和DAZ3的双突变体, 我们以daz3-L1植株为背景, 再次编辑TREE1基因, 获得了tree1-L1 daz3-L1和tree1-L2 daz3-L1独立的突变体株系。通过DAPI染色分析发现, tree1 daz3的雄性生殖单位相较于野生型没有差异; 将tree1 daz3与精细胞标记基因HTR10的融合蛋白株系杂交发现,tree1 daz3植株精细胞数目、形态都正常; 限量授粉实验表明, tree1 daz3的精细胞受精能力也正常, 受精后受精卵可进行正常的不均等分裂[17-18]。有意思的是, 在双突变体中, 胚根原细胞不能进行正常的横分裂, 其分裂面倾斜, 继而胚根原子代细胞形态和位置出现异常, 最终导致根干细胞龛命运决定紊乱[19]。胚根原标记基因WOX5信号在tree1-L1 daz3-L1球形胚的部分基底细胞中缺失, 在心形胚的静止中心和根干细胞龛中的范围扩大[20]。根据前人的报道, 胚根原细胞命运的特化与生长素响应有关, 因此, 我们用生长素响应报告基因DR5来指示tree1 daz3中生长素响应[21], 结果表明在异常分裂的胚根原和初生根中生长素响应明显异常。综上, 两个精细胞特异表达的父本起源基因TREE1和DAZ3编码的两个转录抑制因子, 参与了胚根干细胞龛命运的决定。<\/p>


<\/p>

3 精子遗传缺陷导致根干细胞发育异常<\/p>

为了更加清晰地揭示TREE1和DAZ3如何调控胚根原命运的确立, 我们通过tree1 daz3和野生型正反交实验证明, 胚根原分裂异常只发生在tree1 daz3作为父本, 野生型作为母本时的胚胎中。此结果表明tree1 daz3中胚胎的缺陷具有父本效应。进一步观察发现TREE1和DAZ3只在精细胞中表达, 蛋白通过受精作用传递到早期胚胎中, 并在受精卵分裂几次后(八细胞胚胎之前)完全降解, 即胚根原出现异常分裂之前蛋白早已消失。这表明早期胚胎中的蛋白行使功能的效应对晚期胚胎和胚后器官发育具有长期影响。运用胚胎晚期启动子ABI3驱动TREE1和DAZ3分别回补tree1 daz3, 通过转基因胚胎表型观察发现, 从二细胞胚胎时期起始表达TREE1和DAZ3无法拯救缺陷的胚根原、初生根和根损伤后根尖再生的能力[22]。这表明是精细胞中缺失了TREE1和DAZ3蛋白, 导致了胚后根器官发育异常(图1)。由此揭示了目前尚未引起关注的配子质量在后代特定器官形成中的重要调控作用。<\/p>

\"c-1.jpg\"/<\/p>

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A: 野生型中, 正常发育的球形胚时期、心形胚时期胚胎和初生根; B: 在tree daz3胚胎中, 胚根原分裂异常和初生根尖发育异常。<\/span><\/p>

A: the photographs exhibited normal development of globular-stage embryo, heart-stage embryo and primary root, in wild type; B: in tree daz3 embryo, the hypophysis division and development of primary root tip are abnormal.<\/span><\/p>

图1 TREE1调控胚根原正常分裂和根的正常发育 (根据参考文献[7]修改)<\/span><\/p>

Fig.1 TREE1 regulates normal hypophysis division and normal root development (modified from reference [7])<\/span><\/p>

4 TREE1与母本起源基因RKD2<\/em>直接相互作用<\/p>

为了更好揭示TREE1和DAZ3如何行使功能,我们找到了一系列和TREE1和DAZ3相互作用的候选基因, 这些基因都满足在卵细胞中高表达且受精后快速被抑制的特点[12]。通过启动子活性分析, 我们发现其中一个候选基因RKD2为母本起源基因, 特异表达在卵细胞中, 受精之后快速被抑制转录[23-24]。通过RT-qPCR实验检测发现, 与野生型相比受精后突变体胚胎中RKD2表达水平显著性上调, 即RKD2转录失去了抑制。另外, 将RKD2启动子活性株系与tree1 daz3进行正反交实验, 在tree1 daz3为父本的杂交胚胎中RKD2的表达量上调。以上实验都表明在TREE1和DAZ3蛋白突变后, RKD2的表达不受抑制。在RKD2启动子活性报告植株中, 运用胚囊特异启动子驱动TREE1和DAZ3异位表达, 表明单独在胚囊中表达TREE1或DAZ3都能抑制RKD2的转录[25]。在前人研究中, 我们发现RKD2启动子上有TREE1的结合位点AGCTAAAG。我们对其进行突变, 在该结合位点突变了的RKD2-GFP融合蛋白植株中, 卵细胞中RKD2的表达不受影响, 受精后RKD2的表达也没有下调, 且在八细胞胚胎时期仍然能观测到RKD2-GFP存在[26]。综上, 父本起源的TREE1和DAZ3与母本起源基因RKD2相互作用, 通过在受精后抑制RKD2在早期胚胎中的表达而调控胚根原发育。<\/p>


<\/p>

5 母本起源基因RKD2延时表达对胚胎具有损害作用<\/p>

为了探究RKD2受精后为什么要被及时地抑制,我们用受精卵起始表达的启动子ZC2来驱动RKD2在早期胚胎中的表达[12], 发现胚根原出现了异常分裂的表型。通过报告基因WOX5的指示, 我们发现在异位表达植物中胚根原的命运确立出现异常, 最终导致初生根中根干细胞龛的范围和命运确立出现异常。进一步, 通过报告基因DR5的指示, 我们发现在异位表达植物中, 生长素的响应也出现异常。以上结果解释了为什么RKD2受精后要被及时地抑制, 如其不能被抑制将损害胚胎发育和胚后根发育。这一结果也揭示了受精作用新的内涵。<\/p>


<\/p>

6 展望<\/p>

本研究强调了精子质量和父本效应在植物胚胎发育和器官形成中的重要作用。它提供了一个清楚的例子, 说明父系遗传因子对植物发育的持续影响。同样, 由于精子中TREE1和DAZ3基因突变而导致的幼苗根部干细胞龛异常, 呈现一种精子起源的先天性缺陷[27-30], 凸显了迄今为止尚不知晓的根干细胞龛建立的新机制 (图2)。<\/p>

\"c-2.jpg\"/<\/p>

精子携带的TREE1和DAZ3通过受精作用传递到卵细胞中, 抑制受精卵中RKD2的表达, 从而促进胚根原的正确分裂、根干细胞龛命运确立和初生根的正常发育。<\/span><\/p>

In the wild type, TREE1 and DAZ3 from sperm cell transmitted to egg cell through fertilization and inhibited the expression of RKD2 to guarantee normal division of the hypophysis founder cell and subsequent cell fate specification of the stem cell niche for normal root tip development.<\/span><\/p>

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图2 TREE1和DAZ3工作模型(根据参考文献[7]修改)<\/span><\/p>

Fig.2 Working model of TREE1 and DAZ3 (modified from reference [7])<\/span><\/p>


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精细胞和卵细胞融合后, 沉寂状态的卵细胞被激活, 在这个过程中一系列基因被激活, 表观修饰进行重新编程。因此, 几十年来, 植物生殖生物学家一直关注卵细胞的激活机制, 而忽略了卵细胞中一些对胚胎发育有害的基因需要被关闭。我们的研究表明, 精子携带的父本起源基因TREE1及其同源基因DAZ3在受精后被传递到卵细胞, 抑制受精卵携带的母本起源基因RKD2转录, 解除RKD2对早期胚胎的毒害。从而确保胚胎和幼苗中根干细胞龛的正确建立。这也为相关科研工作者提供了参考, 即卵细胞基因组的激活和母本有害基因的表达抑制同等重要, 这一领域值得引起关注。<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

另一值得思考的问题是TREE1只存在早期胚胎中, 在胚根原异常分裂之前TREE1蛋白早已完全降解, 因此, TREE1如何跨越时空调控根的发育也是一个极其有趣又充满挑战的课题。或许时空组学能提供有益的线索揭示受精后TREE1下游级联反应,以及胚胎晚期根干细胞龛发育的调控网络。<\/span><\/p>


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参考文献 (References)<\/span><\/p>

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<\/span><\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/24-10-11-14-58-50-095.jpg","cshort":"

孙蒙祥, 武汉大学教授、博士生导师。1982年本科毕业于华中师范大学。1987年、1994年先后于武汉大学获得硕士和博士学位。1995年后分别在荷兰Wageningen University、意大利Siena University、德国University of Hamburg等从事博士后研究。主要研究领域为植物生殖发育, 具体方向为被子植物受精与早期胚胎发生的分子机制。近年, 先后揭示了植物如何防止多精入卵、父母亲本基因相互作用调控根的分化、杂交后父本基因组激活的时间进程、父母亲本对杂种胚胎转录组的贡献、种子发育中胚乳的独立性等一系列重要机制。在Nature、Nat Plants、Dev Cell、PNAS、Curr Biol、Nat Commun、Plant Cell<\/em>和Mol Plant<\/em>等期刊上发表论文120余篇。<\/p>","cshort2":"
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孙蒙祥, 武汉大学教授、博士生导师。1982年本科毕业于华中师范大学。1987年、1994年先后于武汉大学获得硕士和博士学位。1995年后分别在荷兰Wageningen University、意大利Siena University、德国University of Hamburg等从事博士后研究。主要研究领域为植物生殖发育, 具体方向为被子植物受精与早期胚胎发生的分子机制。近年, 先后揭示了植物如何防止多精入卵、父母亲本基因相互作用调控根的分化、杂交后父本基因组激活的时间进程、父母亲本对杂种胚胎转录组的贡献、种子发育中胚乳的独立性等一系列重要机制。在Nature、Nat Plants、Dev Cell、PNAS、Curr Biol、Nat Commun、Plant Cell<\/em>和Mol Plant<\/em>等期刊上发表论文120余篇。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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<\/span>\"程天河.jpg\"<\/td>

程天河, 武汉大学博士后。2014年本科毕业于安庆师范大学。2020年于武汉大学获得博士学位。博士毕业至今在武汉大学从事博士后和合作研究。主要研究领域为植物生殖发育, 具体方向为父母本起源基因在早期胚胎发生中的作用。近年来, 先后揭示父母亲本起源基因如何相互作用确保胚胎正常发育和胚胎早期表达基因如何调控晚期胚胎中油脂积累等重要机制。相关成果发表在Nature、New Phytol<\/em>期刊上。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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运动通过代谢稳态调控蛋白质翻译后修饰进而改善脑功能<\/span>
<\/p>

张力*<\/span><\/p>

(中枢神经再生教育部重点实验室, 暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院, 广州 510600)<\/span><\/p>


<\/p>

【摘要】不同类型的体育运动均能显著影响机体的代谢稳态。代谢物除了为组织供能外, 对于细胞内分子信号通路也具有广泛的影响。特别是在蛋白质的翻译后修饰(PTM)中, 多数过程均高度依赖于运动相关代谢物, 如乙酰基、乳酸、脂肪酸、单胺能递质等。因此, 运动可能通过影响脑内蛋白质PTM, 从而改变突触和神经网络活动, 改善情感认知等脑功能。围绕这一科学问题, 课题组已取得一定的成果, 特别是对运动后突触蛋白乳酰化修饰的解析, 初步揭示了运动改善情感障碍的代谢–脑机制。在这一领域, 后续研究可以从解析运动及蛋白修饰的量–效关系、发现更多运动代谢物的PTM调控效果, 以及建立完整的运动后全身代谢稳态及脑内蛋白修饰的互作模型等方面入手, 从而在深入阐明运动改善脑健康的身–心机制的同时, 进一步推动运动疗法的应用和运动增效或替代物质的开发。<\/p>

【关键词】<\/span>运动训练; 代谢稳态; 蛋白质修饰<\/p>


<\/p>

The Improvement of Brain Functions via Post-Translational Modification of Proteins by Exercise Mediated Metabolic Homeostasis<\/p>

ZHANG Li*<\/span><\/p>

(Key Laboratory of CNS Regeneration (Ministry of Education), Guangdong-Hong Kong-Macau Institute of CNS Regeneration, Jinan University, Guangzhou 510600, China)<\/span><\/p>


<\/p>

【Abstract】 Different types of exercise training significantly affect the body metabolic homeostasis. The exercise-related metabolites act as the energy supply molecules and have profound effects on intracellular signaling pathways. In particular, the process of PTM (post-translational modification) of proteins is highly dependent on exercise-mediated metabolites such as acetyl, lactate, fatty acid and monoamines. It is thus proposed that exercise training may affect PTM in brain proteins, thus modifying synaptic and neural network activities, for improving brain functions such as mental or cognition. Focusing on this specific field, studies have already revealed the mechanism of lactate molecules in modulating synaptic protein lactylation under exercise training, thus implying the potential metabolic-brain axis in exercise-mediated improvement of mental disorders. In future, one can deploy research to reveal the correlation between exercise training load and the effect of protein modifications, to identify more PTM of brain proteins at the downstream of exercise-related metabolites, and to establish a complete picture between whole body metabolic homeostasis and brain protein modification. These works add more knowledge on the peripheral-central pathway of exercise in improving brain health and facilitate the promotion of exercise intervention of brain diseases, or the future development of exercise mimics.<\/p>

【Keywords】exercise training; metabolic homeostasis; protein modification<\/p>


<\/p>

1 运动与脑健康<\/p>

运动是一种被广为接受的主动健康手段, 对于改善体质、降低慢性病风险、促进功能康复等均具有重要的意义。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)在其发布的《关于身体活动和久坐行为的指南》中提出, 成年人应保证每周至少150~300分钟的中等强度运动, 或是75~150分钟的剧烈强度有氧运动, 且额外的运动可带来更多的收益。除了能缓解心血管障碍、代谢异常等疾病外, 长期运动锻炼对于脑功能的改善效果也得到了大量人群研究的证实。如美国一项涵盖了120万人的5年横断面研究指出, 不同类型的体力活动均可以有效降低中长期的精神疾病风险[1]。而首都医科大学贾建平团队[2]通过连续10年的追踪, 同样发现了以坚持运动为标志的健康生活方式, 能有效减缓老年人口的认知衰退。<\/p>


<\/p>

神经科学和生理学界对运动改善脑功能的机制进行了长期的探索。GAGE等[3]率先系统性研究了跑轮运动对于啮齿动物海马成体神经发生的改善效果, 及其背后与脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的关联。在突触层面, 我们团队近年来通过在体双光子成像等手段, 提供了运动改善小鼠皮层突触发生的有力证据[4]。而运动后外周组织产生的各类特定分子, 或称为“运动因子”, 与脑功能的关联在近10年内得到了研究者的重视。如通过向非运动小鼠输注运动小鼠的血浆, 并结合蛋白组学研究, 学者发现了运动后循环中升高的抗炎因子对于阿尔阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)相关神经炎症的缓解效果[5]。香港大学苏国辉院士团队[6]则在大鼠脂肪组织中发现了脂联素(adiponectin)响应跑轮运动刺激, 通过改善海马成体神经发生, 发挥抗抑郁效果的作用机理。上述这些证据从人群研究和动物机制两个层面, 均充分说明了运动对脑功能的改善作用。<\/p>


<\/p>

2 运动与代谢稳态<\/p>

机体在进行较高强度运动训练时, 由于组织供能供氧需求的快速增加, 多器官的代谢模式会出现较大的改变, 从而引起一系列代谢产物的浓度变化。针对运动后代谢模式的系统性转变, 近期美国多所大学团队在运动后小鼠的不同外周–中枢组织中开展了代谢组学等研究[7], 其结果揭示了运动对于脑内氧化磷酸化等代谢通路的调控效果(图1)。这一系统性研究和其他类似工作, 都表明了运动后机体代谢稳态的显著改变, 进而提示其可能和机体健康收益的关联。<\/p>


<\/p>

运动对机体代谢通路的影响, 不可避免地会引起体内各类代谢物水平的改变, 其中我们较为熟知的, 包括葡萄糖、乳酸、脂肪酸等分子。这些分子主要作为组织能量来源, 通过分解代谢通路, 满足机体在运动状态下的高水平能量需求。但除了细胞供能外, 代谢物在体内同样参与了包括大分子合成、信号转导、表观遗传修饰等分子过程。以表观遗传调控为例, 包括DNA和RNA的甲基化修饰, 都高度依赖于以S-腺苷–甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)为代表的一类代谢中间产物[8]。我们团队在2022年发表的一项研究, 在国际上首次将运动与脑内的N6-甲基腺苷(m6A)修饰相结合, 发现14天慢性跑步机运动通过提升小鼠肝脏中SAM的合成代谢能力, 从而增强内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex, mPFC)的mRNA m6A修饰水平, 进而改善神经网络活动性, 发挥抗焦虑效果[9](图2)。这项研究也进一步提示了运动–代谢通路在其改善脑功能中的潜在机制。<\/p>


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\"ZL-1.jpg\"/<\/p>

图1 运动对机体代谢稳态的改变(改编自参考文献[7])<\/span><\/p>

Fig.1 The regulation of body metabolic homeostasis by exercise training (adapted from reference [7])<\/span><\/p>

\"ZL-2.jpg\"/<\/span><\/p>


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图2 运动通过代谢–表观遗传途径改善焦虑障碍(改编自参考文献[9])<\/span><\/p>

Fig.2 The improvement of anxiety disorders by exercise via the metabolic-epigenetic axis (adapted from reference [9])<\/span><\/p>


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3 运动相关代谢物与蛋白翻译后修饰<\/span><\/p>

运动相关的代谢分子除了可能影响DNA/RNA的修饰外, 其对于蛋白质的翻译后修饰(post-translationalmodification, PTM)也具有重要的影响。实际上,在目前已知的多种蛋白质PTM中, 绝大多数均需要代谢分子的参与, 包括磷酸化、乙酰化、甲基化等经典修饰, 以及巴豆酰化(crotonylation)、多巴胺化(dopaminylation)、乳酰化(lactylation)等新型PTM过程。近年来陆续有报道指出, 上述新型PTM和脑功能密切相关。例如组蛋白的多巴胺化修饰可调节动物的可卡因成瘾行为[10], 而组蛋白赖氨酸位点的巴豆酰化和脑发育中的关键性表观调控事件密切相关[11]。<\/p>


<\/p>

近年来, 赖氨酸乳酰化修饰在生命科学领域获得了广泛关注。自2019年首次报道其在巨噬细胞代谢重编程中发挥关键作用以来[12], 组蛋白乳酰化已被发现同心血管疾病[13]、肿瘤[14]等有着紧密联系。而在脑疾病中, 组蛋白乳酰化驱动的脑内小胶质细胞糖代谢也被发现可影响AD相关病理发生[15]。除了对组蛋白修饰相关的基因转录调控外, 乳酰化还可对非组蛋白的功能发挥广泛影响。如有研究指出多个代谢酶的乳酰化修饰可能影响肿瘤细胞的代谢适应性改变[16], 而脑内星形胶质细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1, LRP1)则可通过影响其他代谢酶的乳酰化, 改变胶质细胞–神经元间的线粒体传递过程[17]。<\/p>


<\/p>

4 运动调控突触蛋白乳酰化与改善焦虑<\/p>

基于上述对蛋白质乳酰化的研究成果, 加之运动与乳酸分子的密切联系, 我们开展了系列研究,着力阐明运动相关乳酸分子与脑内蛋白质乳酰化修饰的关系, 及其在脑网络和功能改善中的作用。我们利用基于乳酰化的蛋白组学研究, 并结合订制抗体, 首次发现了运动后mPFC区域中多个突触相关蛋白的乳酰化水平显著上升, 并确认了其中关键突触蛋白SNAP91(又名AP180)的乳酰化修饰改变,从而初步揭示了运动对脑内非组蛋白乳酰化的调控效果[18]。<\/p>


<\/p>

在上述工作的基础上, 我们进一步利用点突变手段, 对乳酰化关键性靶蛋白SNAP91的885赖氨酸位点进行选择性编辑(K885R), 从而抑制其乳酰化活性。借助Cas9-在体基因编辑手段, 我们建立了这一mPFC脑区特异性突变小鼠模型, 并发现其突触结构和功能均发生显著缺陷, 并伴随运动抗焦虑效果的抑制[18], 这些结果充分说明, 运动通过改变SNAP91-K885位点的乳酰化, 发挥改善皮层神经网络活动,缓解焦虑障碍的效果。<\/p>


<\/p>

5 未来展望与思考<\/p>

尽管我们的研究已经对运动适应性代谢稳态改变和脑内蛋白乳酰化修饰的关系进行了一定的解析, 但仍然存在一些亟待解决的问题。首先, 对于特定的运动方式或强度而言, 其对突触蛋白PTM的影响是否存在不同？我们已有的研究初步探讨了运动和乳酸的量–效关系, 发现跑步机训练在一定范围内可以剂量依赖性方式, 增加mPFC中SNAP91的乳酰化修饰水平, 并发挥抗焦虑效果[18]。但这一结果并未能解答不同运动方式的差异性调控。此前曾有一项研究显示, 小鼠的跑步机训练相较自主跑轮运动,能更为显著提升脑内的糖代谢通路相关分子, 如葡萄糖转运体(glucose transporter, GLUT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)等的表达水平[19]。在未来, 利用不同运动方式开展跨物种以及人群干预研究, 有望进一步系统性建立运动、代谢物和蛋白PTM的关系。<\/p>


<\/p>

除乳酸外, 运动相关的其他代谢物, 同样可能对蛋白质PTM产生广泛影响。有研究显示, 运动可促进白细胞内的氧连接-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰, 从而可能调节机体免疫功能[20]。运动调控的另一种关键代谢物, 2-羟基丁酸(2-hydroxybutyrate)也被发现和核蛋白的二磷酸腺苷核糖基化(ADPribosylation)有关, 并影响肌肉代谢疲劳[21]。华中科技大学陈建国团队[22]近期发现, 跑轮运动可通过下调基底外侧杏仁核(basolateral amygdala, BLA)脑区中抑制性突触蛋白Gephyrin的S-亚硝基化(S-nitrosylation),从而改善GABA能传导, 发挥抗焦虑效果。上述研究提示, 在脑内可能存在着乳酰化之外的其他PTM过程, 和运动后机体代谢适应性改变密切相关。后续的工作可在空间代谢组学数据的基础上,探究更多新型PTM与运动的关系。<\/p>


<\/p>

在继续探究运动干预和不同代谢物所介导的PTM事件的同时, 一个关键性问题是, 如何在生理和病理条件下无偏差分析各类代谢物及其相关PTM调控, 对于脑网络和脑功能的协同作用。在经典的分子生理学研究中, 更多采用还原论的方法开展, 即对于一种代谢物, 一般而言只聚焦其对于特定蛋白质PTM的调控效果。然而在真实细胞内更为普遍的情况是, 一种代谢物可能同时影响多个蛋白质修饰的过程。如乳酸分子既可以通过直接的乳酰化修饰,也可能通过影响包括组蛋白乙酰化等事件, 改变组织代谢模态[23]。更为重要的是, 运动所改变的代谢分子, 远不止乳酸一种。因此, 为全面解读运动对脑内蛋白质修饰的影响, 有必要结合转录组、蛋白组、代谢组等维度在时空序列上的信息, 采用大数据分析手段, 建立运动后外周–中枢代谢及脑功能互作模型(图3), 相信这一工作可以为我们更好地解释运动改善脑健康的机理, 以及在临床中推广运动干预、开发运动增效或替代物质提供强有力的证据。<\/p>


<\/p>

\"ZL-3.jpg\"/<\/p>

图3 运动–代谢轴改善脑功能的机制模式<\/span><\/p>

Fig.3 The mechanism of exercise-metabolic axis in improving brain functions<\/span><\/p>


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参考文献 (References)<\/span><\/p>

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张力, 粤港澳中枢神经再生研究院研究员, 博士生导师, 暨南大学杰出人才(A类),入选广东省重大人才计划青年拔尖人才。主要研究领域为: 运动改善脑功能的外周–中枢机制, 重点聚焦不同“运动因子”调节突触可塑性的机理。近5年的代表性成果发表于Cell Metabolism、Nature Communications、Science Advances、Molecular Psychiatry、National Science Review<\/em>等学术期刊。运动与脑健康成果获广东省科技进步二等奖; 作为负责人主持“科技创新2030-脑科学与类脑研究”重大专项青年科学家项目、国家自然科学基金等。<\/p>","cshort2":"
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张力, 粤港澳中枢神经再生研究院研究员, 博士生导师, 暨南大学杰出人才(A类), 入选广东省重大人才计划青年拔尖人才。主要研究领域为: 运动改善脑功能的外周–中枢机制, 重点聚焦不同“运动因子”调节突触可塑性的机理。近5年的代表性成果发表于Cell Metabolism、Nature Communications、Science Advances、<\/em>Molecular Psychiatry、National Science Review<\/em>等学术期刊。运动与脑健康成果获广东省科技进步二等奖; 作为负责人主持“科技创新2030-脑科学与类脑研究”重大专项青年科学家项目、国家自然科学基金等。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"运动通过代谢稳态调控蛋白质翻译后修饰进而改善脑功能","listseq":116,"seqno":"116","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"24-10-11-15-24-27-290"},{"caddress1":"(1清华–北大生命科学联合中心, 北京 100084; 2 动态免疫学实验室, 清华大学免疫所, 北京 100084; 3清华大学基础医学院, 北京 100084; 4昌平实验室, 北京 102206)","cauthor":"邵雯1,2,3,4 祁海1,2,3,4*","cintpic":"Upload/qianyan/24-07-30-09-48-18-305.pdf","clicktime":878,"clong1":"

表观遗传印迹记录的记忆B细胞免疫刺激历史决定记忆B细胞的再分化命运<\/span>
<\/p>

邵雯1,2,3,4<\/sup> 祁海1,2,3,4<\/sup>*<\/span><\/p>

(1<\/sup>清华–北大生命科学联合中心, 北京 100084; 2<\/sup>动态免疫学实验室, 清华大学免疫所, 北京 100084; 3<\/sup>清华大学基础医学院, 北京 100084; 4<\/sup>昌平实验室, 北京 102206)<\/span><\/p>


<\/p>

【摘要】记忆B细胞是长期体液免疫的重要组成部分。在再次被同样的病原体感染之后, 记忆B细胞可以迅速转变为产生抗体的浆细胞, 或者重新进入生发中心(GCs)进行进一步的抗体体细胞高频突变和亲和力成熟。记忆B细胞重新参与生发中心反应对于产生针对流感病毒和HIV等高度变异病毒的广谱中和抗体至关重要。有报道显示记忆B细胞在抗原再刺激后的分化命运与不同的抗体种型和表面分子相关。然而, 转录和表观遗传机制是否影响了这些记忆B细胞的命运尚不清楚。该研究发现, 记忆B细胞经历的每次刺激都会以依赖于干扰素调节因子4(IRF4)的方式在表观遗传学上进行记录, 这决定了B细胞中两个拮抗转录因子BLIMP1和BACH2的相对水平, 进而影响了记忆B细胞在重新刺激时进入生发中心或成为浆细胞的可能性。<\/p>

【关键词】记忆B细胞; 免疫记忆; 生发中心; 浆细胞; 细胞分化; 表观遗传调控<\/span><\/p>


<\/p>

Past Antigen Exposures are Epigenetically Imprinted and Determine the Memory B Cell Fate Upon Rechallenge<\/p>

SHAO Wen1,2,3,4<\/sup>, QI Hai1,2,3,4<\/sup>*<\/span><\/p>

(1<\/sup>Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Beijing 100084, China; 2<\/sup>Laboratory of Dynamic Immunobiology, Institute for Immunology, Beijing 100084, China; 3<\/sup>Department of Basic Medical Sciences, School of Medicine, Beijing 100084, China; 4<\/sup>Changping Laboratory, Beijing 102206, China)<\/span><\/p>


<\/p>

【Abstract】 Memory B cells are crucial components of long-term humoral immunity. Upon antigen reexposure, memory B cells can rapidly become antibody-producing plasma cells or they can re-enter GCs (germinal centers) to undergo further antibody somatic hypermutation and affinity maturation. Memory B cell re-participation in the GC reaction is thought to be important for generating broadly neutralizing antibodies against highly mutating viruses such as influenza virus and HIV. The fate of memory B cells into plasma cells or GC B cells following antigen re-stimulation is associated with distinct antibody isotypes and memory B cell surface phenotypes. However, whether these memory B cell fates are intrinsically programmed by transcriptional and epigenetic mechanisms was not understood. This study finds that each stimulation experienced by memory B cells is epigenetically recorded in an IRF4-dependent manner, which determines the relative levels of two antagonistic transcription factors BLIMP1 and BACH2 in B cells, and in turn dictates the likelihood that a memory B cell enters a germinal center or becomes a plasma cell upon re-stimulation.<\/p>

【Keywords】memory B cell; immune memory; germinal center; plasma cell; cell differentiation; epigenetic regulation<\/p>


<\/p>

1 记忆B细胞的命运决定<\/p>

记忆B细胞(memory B cell, MBC)在再次被同\r\n样的抗原刺激之后一部分细胞可以直接分化成浆细\r\n胞, 另一部分细胞则可以分化成生发中心(germinal \r\ncenter, GC) B细胞。有证据表明在被过继转移到受\r\n体小鼠中重新激活的记忆B细胞中, IgM型记忆B细\r\n胞倾向于分化形成GC B细胞, 而IgG型记忆B细胞则\r\n主要产生浆细胞(plasma cell, PC)[1-3]。这些看似由抗\r\n体种型决定的分化潜力不是由B细胞受体(B cell receptor, BCR)[4-6]的不同信号转导能力造成的, 而是取\r\n决于这些细胞参与免疫反应的历史[7]。类似地, 记忆\r\nB细胞也可以根据表面分子CD80和PDL2的表达水\r\n平而被分为不同的亚群, 其中CD80–\r\nPDL2–\r\n(DN)的记\r\n忆B细胞主要形成生发中心, 而CD80+\r\nPDL2+\r\n(DP)记\r\n忆B细胞则倾向于分化成浆细胞[8]。而这些表面分子\r\n如何影响细胞命运的分子机制仍不清楚, 是否存在\r\n内在的转录和表观遗传机制参与调控尚待探究。<\/p>


<\/p>

2 B细胞分化的转录调控网络<\/p>

转录因子BLIMP1对于浆细胞分化是必要且充\r\n分的[9-10], 而BACH2则是生发中心形成和维持所必\r\n需的[11-12]。BLIMP1、BACH2和其他几个关键的转\r\n录因子, 包括PAX5、BCL6和IRF4, 共同构成了B细\r\n胞命运决定的基因调控网络[13-14]。其中, IRF4位于\r\n此调控网络的上游, 它可以促进BLIMP1的表达, 并抑制BACH2的表达[15]。同时BACH2和BLIMP1之间\r\n存在拮抗作用[16-17]。这种双向负反馈基因调控网络\r\n往往会导致系统出现“开关”式的飞跃变化。当促进\r\n浆细胞方向分化的(即IRF4和BLIMP1)活性的增加\r\n超过某个阈值时, 对立侧的活性将被关闭, 细胞命运\r\n将直接切换到浆细胞状态。<\/p>


<\/p>

当我们将初始B细胞视为分化的起点时, 浆细\r\n胞则代表完全分化的终点。任何最终会参与抗体反\r\n应的B细胞都必须成为浆细胞。因此, 沿着这个假\r\n想从初始B细胞到浆细胞的分化轴, 记忆B细胞可以\r\n被视为这两个端点之间的中间状态, 而不同的记忆\r\nB细胞亚群则代表更精细的中间状态。同样地, 生\r\n发中心也代表初始B细胞和浆细胞之间的中间状态, \r\n因为任何生发中心B细胞克隆都必须分化为浆细胞\r\n状态, 才能有效地参与抗体反应。为了去探究这种\r\n可能性, 我们首先对NP-KLH免疫后14天的初始B细\r\n胞、生发中心B细胞、记忆B细胞和浆细胞进行了\r\n转录组分析[18]。通过主成分分析(principal compo\u0002nent analysis, PCA), 我们发现初始B细胞和浆细胞在\r\nPC1轴上处于两个相反的极端, 而GC B细胞和记忆\r\nB细胞则位于两者之间(图1A), 这暗示了GC B细胞\r\n和记忆B细胞在转录组层面是初始B细胞往浆细胞\r\n分化的中间态。通过对PC1中有贡献的基因进行分\r\n析, 我们发现BLIMP1有正向贡献, 而BACH2则有负\r\n向贡献。因此, 我们猜测随着B细胞不断受到刺激并向着浆细胞的分化的过程中, BLIMP1和BACH2之\r\n间的拮抗平衡可能逐步发生了变化。<\/p>

\"领域前沿-1.jpg\"/<\/p>


<\/p>

A: 在 B6小鼠 NP-KLH免疫后 14天 , 对分离出的指定亚群进行转录组主成分分析。B: BARBE小鼠在 NP-KLH免疫后第 14天指定细胞的\r\nBACH2-RFPhigh(%)和BLIMP1-EYFP+\r\n(%)的汇总数据。C、D: BARBE小鼠在NP-KLH免疫后第14天、第21天或第28天, 生发中心(C)和记忆B\r\n细胞(D)中BACH2-RFPhigh(%)和BLIMP1-EYFP+\r\n(%)的汇总数据。E、F: IgM+\r\n和IgG+\r\n记忆B细胞(E)或DN(CD80–\r\nPDL2–\r\n)、SP (PD-L2+\r\nCD80–\r\n)和\r\nDP(CD80+\r\nPDL2+\r\n)记忆B细胞(F)中BACH2-RFPhigh(%)和BLIMP1-EYFP+\r\n(%)的汇总数据。\r\nA: principal-component analysis of transcriptomes of indicated subsets, isolated 14 days after NP-KLH immunization of B6 mice. B: summary data \r\nof BACH2-RFPhigh(%) and BLIMP1-EYFP+\r\n(%) in indicated cells from BARBE mice on day 14 post NP-KLH immunization. C,D: summary data of \r\nBACH2-RFPhigh(%) and BLIMP1-EYFP+\r\n(%) in GCs (C) and MBCs (D) from BARBE mice on day 14, 21, or 28 post NP-KLH immunization. E,F: \r\nsummary data of BACH2-RFPhigh(%) and BLIMP1-EYFP+\r\n(%) in IgM+\r\n and IgG+\r\n MBCs (E) or DN, SP and DP MBCs (F). <\/span><\/p>

图1 不同B细胞和不同时间BLIMP1和BACH2表达的平衡变化(根据参考文献[18]修改) <\/span><\/p>

Fig.1 Changing balance of BLIMP1 and BACH2 expression in different B cells and at different times (modified from reference [18])<\/span><\/p>


<\/p>

3 BLIMP1和BACH2在活化后的B细胞\r\n中的表达变化<\/p>

为了在单细胞层面同时检测BLIMP1和BACH2\r\n的表达量, 我们首先将BACH2tdRFP/+敲入报告小鼠[19]\r\n和BLIMP1-EYFP转基因小鼠[20]交配, 获得的后代同\r\n时携带两种报告基因, 我们简称为BARBE(BACH2-\r\nRFP-BLIMP1-EYFP)(下划线代表缩写 BARBE来\r\n源)。通过免疫BARBE小鼠, 我们发现随着B细胞\r\n从初始B细胞到GC B细胞、记忆B细胞, 最后到浆\r\n细胞的分化过程中 , BLIMP1的表达量逐级增加 , \r\n而BACH2的表达量则逐步减少(图1B)。通过定义\r\nBLIMP1相对BACH2的表达量(BLIMP-1-to-BACH2, \r\nBLIBA)(下划线代表缩写BLIBA来源), 我们发现免\r\n疫反应后期的GC B细胞和记忆 B细胞中都比反应\r\n初期的同类型细胞具有更高的BLIBA值(图1C和图\r\n1D)。除此以外, 文献中报道的倾向于分化成浆细胞\r\n的记忆B细胞(IgG型或者CD80+\r\nPDL2+\r\n)表达更低水\r\n平的BACH2和更高水平的BLIMP1, 而倾向于分化\r\n成GC B细胞(如IgM型或CD80–\r\nPDL2–\r\n)则呈现相反的\r\n趋势(图1E和图1F)。<\/p>


<\/p>

4 BLIMP1和BACH2的相对表达量决定\r\n了记忆B细胞的再分化命运<\/p>

为了测试BACH2或BLIMP1的诱导是否能改\r\n变体内记忆B细胞亚群形成生发中心或浆细胞倾向性, 我们将单拷贝的TRE3G-BACH2-2A-tdTomato\r\n或TRE3G-BLIMP1-2A-tdTomato敲入Col1a1安全位\r\n点, 从而创建了Col1a1Teto-BACH2-tdTomato/+或Col1a1Teto\u0002BLIMP1-tdTomato/+小鼠。这些小鼠进一步与 GFP转基因\r\nRosa26LSL-rtTA3;Cd79aCre/+ B1-8hi小鼠杂交。所得品\r\n系中的B细胞持续表达GFP标记, 并可在强力霉素\r\n(Doxycycline)诱导下表达外源性BACH2或BLIMP1。\r\n我们将这种复合转基因品系称为 BRISKBACH2或\r\nBRISKBLIMP1小鼠(图2A)。<\/p>


<\/p>

表达GFP的BRISKBACH2或BRISKBLIMP1 B1-8hi细\r\n胞首先被过继转移到B6小鼠中激活以产生记忆B细\r\n胞。随后, 我们将这些细胞按照IgG和非IgG或PDL2–\r\nCD80–\r\n(DN)和PDL2+\r\nCD80+\r\n(DP)进行分类, 并将这些\r\n亚群转移到不同的B6受体中, 这些受体用OVA进行\r\n预处理并喂食强力霉素(图2B)。通过tdTomato荧光\r\n可以识别成功诱导BACH2或BLIMP1的细胞。<\/p>


<\/p>

如预期那样, 对照未诱导的IgG+\r\n记忆B细胞主\r\n要产生浆细胞, 而未诱导的非IgG(主要为IgM+\r\n)记忆\r\nB细胞则主要生成次级生发中心。然而, IgG+\r\n记忆B\r\n细胞在诱导了BACH2的表达后显著增加了GC的产\r\n生比例, 同时减少了浆细胞的生成, 展现出与非IgG\r\n记忆B细胞类似的分化趋势; 而在非IgG记忆B细胞中诱导BACH2后则进一步增强了GC的生成能力并\r\n减少了浆细胞的形成(图2C)。与此形成鲜明对比的\r\n是, 在非IgG记忆B细胞中诱导BLIMP1会使其命运\r\n转变为主要形成浆细胞, 而IgG+\r\n记忆B细胞过表达\r\nBLIMP1后则几乎全部生成浆细胞(图2D)。除此之\r\n外, BACH2的诱导还将使得PDL2+\r\nCD80+\r\n记忆B细胞\r\n从主要偏向产生浆细胞转变为主要产生GC(图2E)。\r\n相反, BLIMP1的诱导则将PDL2–\r\nCD80–\r\n记忆B细胞从\r\n生成GC的命运转变为形成浆细胞的命运(图2F)。因\r\n此, 在重新激活过程中改变BACH2和BLIMP1之间\r\n的平衡可以逆转记忆B细胞亚群本来的命运偏好。<\/p>

\"领域前沿-2.jpg\"/<\/p>

A: BRISKBACH2和BRISKBLIMP1小鼠系统的示意图。利用CRISPR/Cas9技术将表达盒敲入Col1a1安全位点, 生成Col1a1Teto-BACH2或Col1a1Teto-BLIMP1等位\r\n基因。B: 实验设计图。C: BRISKBACH2小鼠未诱导IgG+\r\n组、诱导IgG+\r\n组、未诱导非IgG+\r\n组和诱导非IgG+\r\n组B1-8high记忆B细胞来源的二次浆细胞或\r\n生发中心(GCs)的汇总数据。D: BRISKBLIMP1小鼠未诱导IgG+\r\n组、诱导IgG+\r\n组、未诱导非IgG+\r\n组和诱导非IgG+组B1-8high记忆B细胞来源的二次浆\r\n细胞或生发中心的汇总数据。E: BRISKBACH2未诱导DP组、诱导DP组、未诱导DN组和诱导DN组 B1-8high记忆B细胞来源的二次浆细胞或生发中\r\n心的汇总数据。F: BRISKBLIMP1未诱导DP组、诱导DP组、未诱导DN组和诱导DN组 B1-8high记忆B细胞来源的二次浆细胞或生发中心的汇总数据。\r\nA: schematic diagram of the BRISKBACH2 and BRISKBLIMP1 mouse systems. Col1a1Teto-BACH2 or Teto-BLIMP1 alleles were generated by knocking-in the expres\u0002sion cassette into the Col1a1 safe locus with CRISPR/Cas9. B: the experimental design. C: summary data of secondary PCs or GCs derived from un\u0002induced IgG+\r\n, induced IgG+\r\n, uninduced non-IgG, and induced non-IgG B1-8high MBCs of a BRISKBACH2 genotype. D: summary data of secondary PCs \r\nor GCs derived from uninduced IgG+\r\n, induced IgG+\r\n, uninduced non-IgG, and induced non-IgG B1-8high MBCs of a BRISKBLIMP1 genotype. E: summary \r\ndata of secondary PCs or GCs derived from uninduced DP (PDL2+\r\nCD80+\r\n), induced DP, uninduced DN (PDL2–\r\nCD80–\r\n), and induced DN B1-8high MBCs \r\nof a BRISKBACH2 genotype. F: summary data (d) of secondary PCs or GCs derived from uninduced DP (PDL2+\r\nCD80+\r\n), induced DP, uninduced DN (PDL2–\r\nCD80–\r\n), and induced DN B1-8high MBCs of a BRISKBLIMP1 genotype. <\/span><\/p>

图2 通过诱导BACH2/BLIMP-1改变记忆B细胞亚群的分化方向(根据参考文献[18]修改) <\/span><\/p>

Fig.2 Switching recall directions of MBC subsets by BACH2/BLIMP-1 induction (modified from reference [18])<\/span><\/p>


<\/p>

5 BLIMP1和BACH2的平衡与IRF4介导\r\n的表观遗传印迹相关<\/p>

在 B细胞分化为浆细胞的过程中, BLIMP1与\r\nBACH2之间的平衡逐渐偏向BLIMP1(图1)。虽然记\r\n忆B细胞中BACH2的下调是显而易见的, 但BLIMP1\r\n的上调确是相对微弱的。BACH2的下调本身并不\r\n能驱动浆细胞分化[21]。鉴于双向负反馈基因调控网\r\n络会导致系统出现“开关”式的飞跃变化, 虽然没有\r\nB细胞能够在保持B细胞特性的同时表达高水平的\r\nBLIMP1, 但我们猜测重新刺激后BLIMP1快速上调\r\n的潜力却可能通过表观遗传机制逐渐增加。<\/p>


<\/p>

为了验证这一假说, 我们对记忆B细胞中高表\r\n达BACH2(BACH2high)和高表达BLIMP1(BLIMP1+\r\n)\r\n的两群细胞进行了染色质开放程度高通量测序\r\n(transposase-accessible chromatin with sequenc\u0002ing, ATAC-seq), 这两群细胞在整个记忆 B细胞里\r\nBLIMP1和BACH2的相对表达量具有最大的差异。\r\n同时我们收集了初始B细胞、GC B细胞和浆细胞作\r\n为对照(图3A)。根据PCA分析我们发现, 在PC1轴上\r\nBACH2high的细胞在整体表观特征方面更接近GC B\r\n细胞(图3B)。而BLIMP1+\r\n细胞则更类似浆细胞, 并\r\n且在诸多浆细胞特异开放的位点相比较BACH2high\r\n细胞呈现更开放的趋势(图3B和图3C)。通过对差\r\n异开放位点的结合序列进行分析, 我们鉴定到了一\r\n系列的转录因子序列, 包括干扰素调节因子(IRF4和\r\nIRF8)、参与染色质环化的CCCTC结合因子(CTCF\r\n和CTCFLl)、Stat家族蛋白(STAT1和STAT2)以及\r\nPU.1相关蛋白(Spib和Spi1)的结合序列(图3D)。其\r\n中与IRF4报道的促进浆细胞分化的事实一致, IRF4\r\n的结合序列表现出最强的富集。<\/p>

\"领域前沿-3.jpg\"/<\/p>

A: 对EYFP+\r\n和RFPhigh B1-8high记忆B细胞的分选策略。B: 对不同细胞在生发中心和浆细胞特异性位点的ATAC-seq信号进行主成分分析。C: 生\r\n发中心特异性开放位点(左)或浆细胞特异性开放位点(右)处RFPhigh和EYFP+\r\n记忆B细胞的ATAC-seq信号比较。D: 对RFPhigh和EYFP+\r\n记忆B细胞\r\n差异开放位点的转录因子结合序列分析。E: 在包含IRF4和BACH2结合序列、仅包含IRF4结合序列或不含此类序列的浆细胞特异开放区域上\r\n指定细胞的相对ATAC-seq信号(以初始B细胞为基准进行归一化)。F: 浆细胞、EYFP+\r\n记忆B细胞、RFPhigh记忆B细胞和生发中心中不同IRF4结\r\n合序列的富集情况。G: 初始B细胞、生发中心、记忆B细胞和浆细胞中Prdm1和Cd28位点的ATAC-seq信号图。\r\nA: gating strategies for sorting EYFP+\r\n and RFPhigh B1-8high MBCs. B: principal-component analysis of ATAC-seq profiles of indicated subsets at GC and PC-specific peaks. C: metaplot analysis comparing ATAC-seq signals between RFPhigh and EYFP+ MBCs at GC-specific peaks (top) or PC-specific \r\npeaks (bottom). D: motif analysis of differentially accessible regions between RFPhigh and EYFP+ MBCs. E: relative ATAC-seq signals in indicated cells, \r\nnormalized against those in naïve B cells, at PC-specific peaks that contain both IRF4- and BACH2-binding motifs, or only IRF4-binding motifs or \r\nnone of such motifs. F: enrichment of different IRF4-binding motifs in PCs, EYFP+\r\n MBCs, RFPhigh MBCs, and GCs. G: IGV tracks showing ATAC-seq \r\nsignals at Prdm1 and Cd28 loci in naïve B cells, GCs, MBCs, and PCs. <\/span><\/p>

图3 B细胞分化过程中形成表观遗传印迹主要依赖IRF4(根据参考文献[18]修改) <\/span><\/p>

Fig.3 IRF4-dependent chromatin imprinting during B cell differentiation (modified from reference [18])<\/span><\/p>


<\/p>

已知 BACH2作为一个转录抑制因子 , 其靶向\r\n的基因与IRF4存在重叠, 在这些重叠的位点上(包括\r\nBLIMP1位点), BACH2可以通过限制IRF4的结合来\r\n抑制靶基因的表达[22]。通过将IRF4靶向的浆细胞\r\n特异性峰分离为仅包含 IRF4序列的区域和同时包\r\n含BACH2和IRF4序列的区域, 我们发现与仅由IRF4\r\n靶向的峰相比, 在这些共同靶向的峰中, RFPhigh和\r\nEYFP+\r\n记忆B细胞之间的染色质开放程度变化更显\r\n著(图3E)。这些数据与从RFPhigh记忆B细胞到EYFP+\r\n记忆B细胞的过程中BACH2表达量显著下降的事实\r\n一致, 说明BACH2抑制了IRF4介导的表观遗传印迹。<\/p>


<\/p>

IRF4表达或者形成复合物的差异性会导致其\r\n表现出对不同 DNA序列的结合偏好性 [23-25]。虽然\r\nIRF4作为同型二聚体与干扰素刺激反应元件(inter\u0002feron-stimulated response element, ISRE)结合时亲和\r\n力相对较低, 但它作为异型二聚体, 可以与Batf-JunB\r\n或Batf-c-Jun复合物共同结合到AP-1-IRF复合元件\r\n(AICE)上。有趣的是, 通过将IRF4结合位点分为包\r\n含ISRE、部分AICE和完整AICE三大类后, 我们发\r\n现ISRE序列在染色质开放区域的富集程度随着B细\r\n胞分化, 在不同类型B细胞中呈现出一个有序且逐\r\n渐变化的模式 : 它们在GC特异性峰中的富集程度\r\n最低, 在RFPhigh特异性峰中的富集程度逐渐升高, 在\r\nEYFP+\r\n特异性峰中进一步富集, 然后在PC特异性峰\r\n中富集程度达到最高(图3F)。这其中就包括了IRF4\r\n靶向的Prdm1基因附近的4个ISRE位点以及编码对\r\n浆细胞长寿至关重要的CD28受体的Cd28基因附近\r\n的3个ISRE位点[26-27](图3G)。在这些位点上, 从初始\r\nB细胞到GC, 再到RFPhigh和EYFP+\r\n记忆B细胞, 最后\r\n到浆细胞的分化过程中, 我们持续观察到染色质的\r\n开放程度呈现一个逐步但显著上升的趋势。相比之\r\n下, AICE位点并未显示出这种特质。<\/p>


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6 IRF4介导的表观遗传印迹记录免疫刺\r\n激历史<\/p>

Irf4是BCR信号下游的一个快速响应基因[28]。\r\n使用抗 Ig或抗 CD40抗体或 CpG激活 B细胞 , 会导\r\n致Irf4 mRNA表达以剂量依赖的方式迅速上调(图\r\n4A)。我们对用不同浓度抗Ig短暂刺激的B细胞进行\r\n了ATAC-seq分析, 该过程未发生任何细胞分裂。与\r\nIRF4表达逐级上调一致, IRF4靶向的浆细胞特异性\r\n基因位点也表现出逐渐增强的染色质开放性(图4B),包括Prdm1基因位点(图4C)。因此, 我们猜测BCR、\r\nCD40和细胞因子刺激的历史会累积产生IRF4介导\r\n的染色质印记, 进而在下次刺激时逐渐增强B细胞转变为浆细胞命运的能力。<\/p>

\"领域前沿-4.jpg\"/<\/p>

A: 用指定浓度的(μg/mL)抗IgM、抗CD40抗体和CpG刺激未成熟B细胞2 h后, Irf4 mRNA的表达情况。B: 未刺激和抗IgM刺激后的B细胞在\r\nIRF4靶向的浆细胞特异位点的ATAC-seq信号比较。C: 初始B细胞(刺激前vs刺激后)以及脉冲标记的GC B细胞在Prdm1和Cd28位点的ATAC-seq\r\n信号图。D: 实验设计图。E: 第10天和第21天亮区GC里IRF4的蛋白表达流式统计图。F: qPCR检测Blimp1和Bach2的mRNA相对表达比例。G: \r\n小提琴图显示了IRF4靶向的浆细胞特异性位点(n=4 477)、所有浆细胞特异性位点(n=12 574)、生发中心特异性位点(n=10 185)以及所有染色\r\n质开放位点(n=73 831)在第10天(D10)和第21天(D21)的亮区GC B细胞之间ATAC-seq信号的log2变化。H: 在浆细胞、第10天(D10)亮区GC B细胞、\r\n第21天(D21)亮区GC B细胞和总亮区GC B细胞中, 不同IRF4结合序列的富集情况。I: 第10天和第21天亮区GC B细胞在包含完整AICE序列位点、\r\n部分AICE序列位点和ISRE序列为点处的ATAC-seq信号比较。\r\nA: IRF4 mRNA expression following 2 h stimulation of naïve B cells with anti-IgM, anti-CD40 antibodies and CpG at indicated concentrations (μg/mL). \r\nB: metaplot analysis comparing ATAC-seq signals between untreated and stimulated B cells at IRF4-targeted PC-specific loci. C: IGV tracks show\u0002ing ATAC-seq signals at Prdm1 and Cd28 loci in indicated B cells. D: experimental design. E: IRF4 expression in D10 and D21 LZ GCs. F: ratios of \r\nBlimp1 and Bach2 mRNA expression by qPCR。G: violin plots showing log2 of fold changes of ATAC-seq signals between day 10 (D10) and day 21 \r\n(D21) LZ GC B cells at IRF4-targeted, PC-specific peaks (n=4 477), at all PC-specific peaks (n=12 574), at GC-specific peaks (n=10 185), and at all \r\npeaks (n=73 831). H: enrichment of different IRF4-binding motifs in PCs, D10 LZ GCs, D21 LZ GCs, and total GCs. I: metaplot analysis comparing \r\nATAC-seq signals between D10 and D21 LZ GCs at top 500 intact AICE peaks, partial AICE peaks and ISRE peaks, respectively. <\/span><\/p>

图4 在时间标记的GC B细胞中的染色质状态和IRF4印迹(根据参考文献[18]修改) <\/span><\/p>

Fig.4 Chromatin states and IRF4 imprints in time-stamped GC B cells (modified from reference [18])<\/span><\/p>


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基于这个IRF4介导的表观印迹模型, 即使在GC \r\nB细胞中, 那些经历过更长或更强刺激的细胞也应该会加强IRF4印迹。为了验证这一预测, 我们免疫\r\n了S1PR2-CreERT2;Rosa26-Ai14小鼠, 并在第6天至\r\n第8天通过灌胃他莫昔芬(Tamoxifen)对GC和GC衍\r\n生细胞进行脉冲标记, 并在免疫后第10天和第21天\r\n分析tdTomato+\r\n GC亮区(light zone, LZ)B细胞的染色\r\n质特征(图4D)。这两个时间点的tdTomato+\r\n细胞在表\r\n型上都是相同的GC LZ细胞, 并且来源于第6天至第8天标记的GC细胞。第21天的细胞平均而言应该经\r\n历了更长时间的抗原和T细胞辅助刺激过程。<\/p>


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第21天的tdTomato+\r\n GC LZ细胞表达的IRF4水平\r\n高于第10天的细胞(图4E)。与第10天的细胞相比, 第\r\n21天的GC LZ细胞中BLIMP1与BACH2的平衡明显\r\n向BLIMP1倾斜了约100倍(图4F), 这表明第21天的GC \r\nLZ细胞比第10天的细胞更接近浆细胞状态。通过ATAC-seq分析, 第21天的tdTomato+\r\n细胞的全局染色质\r\n可及性高于第10天的对应细胞, 这可能反映了长期参\r\n与免疫反应的影响, 而在浆细胞特异性开放位点的\r\n差异更为显著, 尤其是IRF4靶向的区域(图4G)。<\/p>


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在所有IRF4结合序列中, ISRE序列在第21天\r\n特异性区域中的富集程度高于第10天的tdTomato+\r\n对应细胞(图4H)。与第10天的细胞相比, 第21天的\r\ntdTomato+\r\n细胞中ISRE包含区域的染色质可及性显\r\n示出最大的增幅(图4I)。最后, 与第10天的tdTomato+\r\n细胞相比, 第21天的细胞中Prdm1和Cd28基因座附\r\n近的ISRE包含区域的可及性更高(图4C)。<\/p>


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综上所述, 我们的数据支持一个模型, 即B细胞的\r\n刺激历史部分地被记录为具有IRF4印迹的染色质特\r\n征, 这些特征进而决定了未来BLIMP1和其他浆细胞\r\n特异性基因上调的速度和程度, 并因此可以决定在重\r\n新激活过程中记忆B细胞向浆细胞分化的概率(图5)。<\/p>

\"领域前沿-5.jpg\"/<\/p>

由刺激历史印迹、表观遗传记录的浆细胞分化潜力决定的B细胞分化模型。IRF4读取刺激历史, 即抗原、T细胞辅助、先天刺激和细胞因子以\r\n剂量依赖的方式促进IRF4表达。IRF4通过在包含ISRE的位点处打开染色质, 以表观遗传的方式记录这一历史, 这些位点主要存在浆细胞分化\r\n相关基因上, 包括Prdm1位点。由于IRF4的持续作用, BLIMP1相对于BACH2的表达强度或下一次刺激后迅速上调表达的可能性逐渐增强。蓝\r\n色阴影的深浅代表细胞经历IRF4印记的程度、在从初始B细胞到浆细胞分化轴上与浆细胞状态的剩余距离或在下一次刺激中成为浆细胞的潜\r\n力。对初始B细胞的更强刺激可能导致直接生成浆细胞, 而较弱刺激则允许生发中心形成。IRF4印迹较少的记忆B细胞倾向于重新参与生发中\r\n心反应, 而IRF4印迹较多的记忆B细胞则倾向于产生浆细胞。IRF4印迹较少的生发中心B细胞更有可能产生记忆B细胞, 而IRF4印迹较多的生\r\n发中心B细胞则更有可能产生浆细胞。因此, 早期反应中生发中心的输出包含更多记忆B细胞, 而晚期初次反应中生发中心的输出则倾向于包\r\n含更多浆细胞。在由重新激活的记忆B细胞产生的次级生发中心中, 浆细胞输出占主导地位。\r\nA proposed model of the B cell response dictated by the stimulation history-imprinted, epigenetically recorded PC differentiation potential. The history \r\nof stimulation is read by IRF4 in that stimulation by antigen, T cell help, innate stimuli and cytokines promotes IRF4 expression in a dose-dependent \r\nmanner. IRF4 writes this history epigenetically by opening chromatins at ISRE-containing loci that specify the PC differentiation program, including the \r\nPrdm1 locus. As a result of continuous action of IRF4, the relative strength of BLIMP-1 over BACH2 is increased. Shades of the blue color represent \r\nthe degree to which cells have undergone IRF4 imprinting, the remaining distance to the PC state on the naïve-to-PC differentiation axis, or the poten\u0002tial to become plasma cells upon next episode of stimulation. Stronger stimulation of naïve B cells may result in direct generation of plasma cells, while \r\nweaker stimulation permits GC formation. Memory B cells that have undergone less IRF4 imprinting tend to re-participate in the GC reaction while \r\nthose that have undergone stronger IRF4 imprinting tend to produce plasma cells. GC B cells that have undergone less IRF4 imprinting are more likely \r\nto produce memory B cells while those that have undergone more are to produce plasma cells. As a consequence, output from GCs in the early response \r\ncontain more memory B cells, while output from GCs in the late primary response tend to contain more plasma cells. From secondary GCs produced by \r\nreactivated memory B cells, plasma cell output dominates. <\/span><\/p>

 图5 IRF4印迹模型及其对B细胞响应的影响(根据参考文献[18]修改) <\/span><\/p>

Fig.5 The IRF4 imprinting model and implications for the B cell response (modified from reference [18])<\/span><\/p>


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7 总结与展望<\/p>

我们发现的IRF4依赖性刺激历史印迹逐渐增\r\n强的现象支持了这样一种观点 , 即从初始状态到\r\n终末浆细胞状态的B细胞分化的连续过程中, 包括\r\n活化后的B细胞、生发中心B细胞、记忆B细胞及\r\n其亚群在内的后活化细胞都是中间产物。如果刺\r\n激作用足够强, 使得IRF4的诱导和随后的BLIMP1\r\n的诱导达到浆细胞分化的临界阈值, 那么活化的B\r\n细胞将发育成浆细胞 , 而不会经历生发中心或记\r\n忆 B细胞状态。这一通过 IRF4印迹逐渐增强的 B\r\n细胞效应分化模型统一解释了为什么生发中心中\r\n的浆细胞输出量从早期到晚期逐渐增加 [21,29]。它\r\n还解释了为什么与初始 B细胞相比, 记忆B细胞通\r\n常不会对二次免疫诱导的生发中心产生主要贡献\r\n[30]。它还解释了活化 B细胞在滤泡外浆细胞发育\r\n和生发中心形成之间的选择。<\/p>


<\/p>

我们尚不清楚IRF4是否以及如何与染色质重\r\n塑因子协同作用在 B细胞中引发这些染色质的变\r\n化。IRF4是如何在低水平的情况下改变生发中心B\r\n细胞染色质的状态的也仍需进一步研究。仍然存在\r\n其他可能促进或限制IRF4印迹的机制。这些机制可\r\n能是未来改进疫苗设计的方向。例如, 对于旨在诱\r\n导针对人类免疫缺陷病毒(HIV)的高度突变、广泛\r\n中和抗体的连续疫苗接种策略, 可能需要考虑通过\r\n抑制IRF4介导的表观遗传印迹, 以便在每个连续疫\r\n苗接种中产生的记忆B细胞能够重复参与生发中心\r\n反应。<\/p>


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参考文献(References)<\/span><\/p>

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祁海, 清华大学教授、清华医学(TM)常务副主任、“长江学者”特聘教授、霍华\r\n德休斯医学研究所国际学者。2014年获得国家自然基金委员会杰出青年科学基\r\n金项目资助, 2023年获首批新基石研究员项目资助。祁海教授长期研究高亲和\r\n力抗体免疫记忆, 在促进记忆生成的滤泡辅助T细胞发育、促进抗体亲和力成\r\n熟的生发中心筛选机制、长寿记忆细胞与浆细胞形成机制、神经调控免疫记忆\r\n等方面取得了国际领先水平的原创成果。研究成果在Nature、Science、Cell、\r\nNature Immunology、Immunity<\/em>等国际学术期刊上发表, 并入选“2020年中国生命\r\n科学十大进展”。荣获“教育部高等学校科学研究优秀成果奖—自然科学一等\r\n奖”、“吴阶平–保罗杨森医学药学奖”、“谈家桢生命科学奖”等。<\/p>","cshort2":"
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祁海, 清华大学教授、清华医学(TM)常务副主任、“长江学者”特聘教授、霍华\r\n德休斯医学研究所国际学者。2014年获得国家自然基金委员会杰出青年科学基\r\n金项目资助, 2023年获首批新基石研究员项目资助。祁海教授长期研究高亲和\r\n力抗体免疫记忆, 在促进记忆生成的滤泡辅助T细胞发育、促进抗体亲和力成\r\n熟的生发中心筛选机制、长寿记忆细胞与浆细胞形成机制、神经调控免疫记忆\r\n等方面取得了国际领先水平的原创成果。研究成果在Nature、Science、Cell、\r\nNature Immunology、Immunity<\/em>等国际学术期刊上发表, 并入选“2020年中国生命\r\n科学十大进展”。荣获“教育部高等学校科学研究优秀成果奖—自然科学一等\r\n奖”、“吴阶平–保罗杨森医学药学奖”、“谈家桢生命科学奖”等。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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利用双同源重组谱系示踪技术揭示肺损后肺泡干细胞再生起源<\/span>
<\/p>

刘扩 孟鑫凤 周斌*<\/span><\/p>

(多细胞体系结构与功能重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)<\/span><\/p>


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【摘要】肺脏修复再生是肺领域研究热点。在一些肺脏疾病中肺泡上皮结构受损, 需要肺泡上皮干细胞的参与才能完成修复。因此揭示肺泡上皮干细胞的再生起源对肺脏疾病的防治具有重\r\n要临床意义。领域内既往研究一致认为肺泡II型上皮细胞(AT2细胞)属于肺泡上皮干细胞, 不仅可\r\n以自我增殖还可以分化为AT1细胞。近年来有研究认为AT2还可以来源于支气管棒状细胞(club细\r\n胞)以及AT1细胞。然而这些研究中用来标记club细胞和AT1细胞的传统谱系示踪工具存在非特异\r\n性标记问题, 导致这些结论存在重大科学争议。为阐明科学争议, 该团队通过构建一系列更为精准\r\n的双同源重组谱系示踪新技术实现了对肺上皮细胞类型的特异性遗传靶向, 并结合多种肺脏损伤\r\n模型揭示了新生AT2细胞除来源于AT2细胞自我增殖外, 还可来源于club细胞、支气管肺泡干细胞\r\n(BASCs), 而不会来源于AT1细胞, 并阐明Notch信号通路参与调控club细胞和BASCs向AT2细胞命\r\n运转分化。阐明AT2细胞再生起源为肺部疾病研究提供重要研究基础, 新开发的双同源重组谱系\r\n示踪技术可被广泛应用于为发育生物学、遗传学和再生医学相关研究。<\/p>

【关键词】肺脏再生; 细胞遗传谱系示踪; 肺泡干细胞; Notch信号通路; Cre-loxP; Dre-rox<\/p>


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Dual Recombinases-Mediated Genetic Tracing Reveals the Cellular Origin of Alveolar Stem Cells after Lung Injury<\/p>

LIU Kuo, MENG Xinfeng, ZHOU Bin*<\/span><\/p>


<\/p>

(State Key Laboratory of Cell Biology, Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell \r\nBiology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)<\/span><\/p>


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【Abstract】 Lung repair and regeneration have emerged as a pivotal area of research in pulmonology. In \r\nsome lung diseases, the alveolar epithelial structure is damaged and requires the involvement of alveolar stem cells \r\nto regenerate the damaged areas. Consequently, elucidating the origins of alveolar stem cells holds immense clini\u0002cal importance for the prevention and treatment of lung diseases. Previous studies have consistently identified AT2 \r\ncells (alveolar epithelial type II cells) as alveolar stem cells, capable of self-renewal and differentiation into AT1 \r\ncells. Nevertheless, recent investigations have proposed an alternative hypothesis, suggesting that AT2 cells can also \r\noriginate from bronchiolar club cells and alveolar AT1 cells. However, the conventional lineage tracing techniques \r\nemployed in these studies have been plagued with non-specific labeling issues, resulting in inconclusive findings. \r\nTo address this controversy, This team has developed a suite of more precise dual recombinases-mediated genetic \r\ntools for the specific labeling of lung epithelial cell types. By integrating these tools with multiple lung injury models, this article has uncovered that new AT2 cells can originate from club cells and BASCs (bronchoalveolar stem \r\ncells), in addition to the self-renewal of AT2 cells, but not from AT1 cells. Furthermore, the study has revealed that \r\nthe Notch signaling pathway plays a crucial role in regulating the transition of club cells and BASCs into AT2 cells. \r\nElucidating the origins of AT2 cells during lung repair provides novel insights for the treatment of lung diseases. \r\nThe dual recombination lineage tracing technique established in this article holds vast potential for broader applications in the fields of developmental biology, genetics, and regenerative medicine.<\/p>


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【Keywords】lung regeneration; cell genetic lineage tracing; alveolar stem cell, Notch signaling pathway; \r\nCre-loxP; Dre-rox<\/p>


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1 细胞遗传谱系示踪技术<\/p>

细胞遗传谱系示踪(genetic lineage tracing)技\r\n术被广泛应用于发育生物学、遗传学、再生医学\r\n等领域研究。细胞谱系示踪主要基于同源重组酶\r\n系统, 目前已有多种同源重组酶系统被发现, 例如\r\nCre-loxP、Dre-rox、Flp-frt、Nigri-nox等[1]。它们\r\n的工作原理类似, Cre-loxP系统最为广泛使用。以a-Cre;Rosa26-loxP-stop-loxP-GFP<\/em>遗传工具为例介绍\r\n其工作原理(图1A)。Cre为同源重组酶, 受细胞基因\r\n启动子a驱动表达, loxP为Cre的识别位点, Cre可识\r\n别并介导两个同向loxP位点之间发生同源重组, 并\r\n切除loxP之间的基因序列。loxP-stop-loxP-GFP序列被插在管家基因Rosa26<\/em>位点, 当细胞核内无Cre存\r\n在时, 转录终止stop序列就会阻止基因转录, 后侧的\r\n荧光报告基因不会表达。当启动子a被激活后 Cre\r\n重组酶会表达并入核介导Cre-loxP重组, 切除stop序\r\n列, 进而激活绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, \r\nGFP)的表达。由于这种切割是发生在基因组水平, \r\n无论细胞发生增殖或分化, a+\r\n或Cre+\r\n细胞都会被永久\r\n性标记为GFP, 以此实现对靶细胞的谱系追踪(图1A\r\n和图1B)[2]。<\/p>


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传统遗传谱系示踪技术主要依赖于一种同源\r\n重组酶系统, 因此对靶细胞标记的特异性就取决于\r\n启动子表达的细胞特异性。如果启动子a特异性表\r\n达在A细胞, 那么通过谱系示踪实验我们可以明确\r\n得出结论: A细胞可以转分化为B细胞。如果启动子\r\na除了表达在A细胞还“非特异性”表达在B细胞, 那\r\n么我们无法准确区分B细胞是起源于A细胞还是起\r\n源于起始标记的B细胞。因此这种非特异性标记问\r\n题很容易导致谱系示踪假阳性结论(图1C)[2]。<\/p>


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我们研究团队长期致力于更为精准的谱系示\r\n踪新技术开发。若一种同源重组酶Cre-loxP无法实\r\n现对靶细胞的特异性标记, 那我们引入另一种同源\r\n重组酶系统Dre-rox, 通过构建双同源重组谱系示踪\r\n技术来实现对靶细胞特异性标记, 以此规避传统技\r\n术的非特异性标记问题。利用双同源重组谱系示踪\r\n技术我们已经解决包括心血管领域、肝脏再生及肺\r\n脏再生等领域多个重大科学争议, 有力地推动了学科发展[3-8]。接下来我们将以揭示肺泡上皮干细胞再\r\n生起源研究为例[5], 详细介绍双同源重组新技术的\r\n选择与应用, 以期为领域内相关研究提供技术指导。<\/p>


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\"ZB-1.jpg\"/A: 细胞遗传谱系示踪技术原理, 当发生Cre-loxP重组后细胞A被标记为GFP。B: 通过谱系示踪可以监测到细胞A分化为细胞B。C: 若细胞A特\r\n异性表达启动子a, 那么通过谱系示踪可以得出细胞B来源于细胞A的结论, 若启动子少量表达在细胞B, 那么无法得出细胞B来源于细胞A的结论。<\/span><\/p>

A: a schematic diagram showing the cell principle of genetic lineage tracing. After Cre-loxP recombination, cell A is labeled by GFP. B: the differentia\u0002tion of cell A into cell B can be monitored by genetic lineage tracing. C: if promoter a is specifically expressed in cell A, it can be concluded that cell B \r\nis derived from cell A. But if promoter a is non-specifically expressed in cell A, it cannot be concluded that cell B is derived from cell A.<\/span><\/p>

图1 Cre-loxP系统介导的细胞遗传谱系示踪技术(根据参考文献[2]修改)<\/span><\/p>

 Fig.1 Cre-loxP-mediated genetic lineage tracing (modified from reference [2])<\/span><\/p>


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2 肺脏上皮结构和功能<\/p>

肺脏作为多功能器官, 对维持人体正常生理功\r\n能至关重要。肺脏结构复杂, 从组织解剖位置上自\r\n近端至远端可划分为气道、支气管和肺泡结构 [9]。\r\n这些结构组成一个层级分支的树状结构, 共同负责\r\n空气的传输和气体交换。在这些不同结构区域分布\r\n着不同数目和类型的上皮细胞, 并且各自区域含有上\r\n皮干细胞或祖细胞, 共同维持着上皮结构的稳定[9-10]。\r\n小鼠肺脏结构与人类相似, 是进行肺脏研究的理想\r\n模型。以小鼠为例, 气道上皮为假复层上皮, 主要\r\n由基底细胞(basal cell)、棒状细胞(club cell)、纤毛\r\n细胞(ciliated cell)和神经内分泌细胞(neuroendocrine \r\ncell)等细胞类型构成。club细胞可以分泌黏液不仅\r\n具有排毒作用, 还可以维持呼吸道湿润, 减少外界刺\r\n激和损伤。纤毛细胞可以通过摆动利用纤毛结构清\r\n除黏附在气道表面的细菌、病毒、尘埃等异物, 从\r\n而维持呼吸道清洁。神经内分泌细胞可以通过分泌\r\n各种神经递质、神经肽等物质响应环境刺激例如机\r\n械刺激、氧气浓度和过敏原等。其中基底细胞作为\r\n气道上皮主要干细胞, 在稳态和气道受损后不仅可\r\n以自我增殖还可以分化为棒状细胞和纤毛细胞等功\r\n能细胞来维持上皮层稳定。有研究发现, 当利用白\r\n喉毒素将气道基底细胞清除后, club细胞可以作为\r\n干细胞转分化基底细胞, 进而再分化为其他功能性\r\n细胞来修复上皮结构[11]。这项研究指出当亲本细胞\r\n(parent cell)缺失时, 它的子代细胞(daughter cell)可以通过逆向去分化转变为亲本细胞类型去发挥干细\r\n胞职能[11]。支气管上皮主要由club细胞、纤毛细胞\r\n和神经内分泌细胞构成。其中club细胞是支气管上\r\n皮主要干细胞, 当支气管损伤后其可以自我增殖并\r\n分化为纤毛细胞促进再生修复[12]。神经内分泌细胞\r\n数目少, 虽然在肺稳态不会发生分化, 但在支气管损\r\n伤后也可以分化为club细胞和纤毛细胞从而参与上\r\n皮修复[13-14]。纤毛细胞属于终末分化细胞, 不会发\r\n生细胞命运转变, 因此其更新主要依赖于基底细胞、\r\nclub细胞或神经内分泌细胞分化[15]。<\/p>


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肺泡上皮是气体交换的主要场所, 主要由I型肺\r\n泡上皮细胞(alveolar type I cell, AT1 cell)和II型肺泡\r\n上皮细胞(alveolar type II cell, AT2 cell)构成。AT1细\r\n胞形态呈扁平状, 占肺泡表面积的95%, 主要负责气\r\n体交换。AT2细胞形态呈立方形或圆形, 占肺泡表\r\n面积的5%, 可以通过分泌表面活性物质降低肺泡表\r\n面张力、防止肺泡塌缩[16]。AT2细胞属于肺泡干细胞, \r\n当肺泡受损后, 可以增殖并分化为AT1细胞, 从而参\r\n与肺泡的修复再生[17-19]。<\/p>


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3 肺泡干细胞再生起源研究进展<\/p>

在一些肺部疾病, 例如特发性肺纤维化、肺炎、\r\n慢性阻塞性肺病、肺气肿等肺病中, AT2肺泡干细\r\n胞会持续受损, 导致肺部损伤修复障碍[10]。因此增\r\n强AT2细胞生存能力、寻找AT2细胞再生起源对恢\r\n复肺部功能结构具有重要意义。对于AT2细胞再生\r\n起源研究, 之前领域内认为AT2细胞主要来源于肺\r\n泡原位AT2干细胞的自我增殖[17]。有研究进一步发\r\n现AT2细胞群存在异质性, 其中有一亚群表达Axin2, \r\n并揭示Axin2+\r\n AT2细胞属于AT2干细胞, 在肺损伤\r\n(高氧损伤模型和流感损伤模型)后可以再生AT2细\r\n胞和AT1细胞进而参与肺泡上皮损伤修复[18-19]。近\r\n年来, 关于AT2细胞再生起源陆续有新的观点被提\r\n出。有研究发现在支气管末端存在一群p63+\r\nKrt5+\r\n干细胞, 称为支气管末端干细胞(distal airway stem \r\ncells, DASC)[20]。DASC在流感损伤模型中会迁移至\r\n肺泡区域并分化为AT1细胞和AT2细胞促进肺泡再\r\n生修复[20]。也有研究认为在稳态支气管末端存在一\r\n小群干细胞, 称为谱系阴性干细胞(lineage-negative \r\nepithelial stem/progenitors, LNEPs)。在一些肺脏\r\n损伤模型 (例如流感模型和博来霉素诱导模型 )中\r\nLNEPs会表达p63和Krt5, 并且会迁移至肺泡区域分化为成熟肺泡上皮细胞类型。这个过程需要Notch\r\n信号通路参与, 当Notch通路被抑制后会促进LNEPs\r\n分化为AT2细胞[21-22]。另外, 有研究提出在支气管和\r\n肺泡交界位置存在一群肺上皮干细胞, 称为支气管\r\n肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells, BASCs), 具\r\n有同时表达club细胞分子标记Scgb1a1和AT2细胞\r\n分子标记Sftpc的特点[23]。前人研究BASCs主要利\r\n用细胞分选和体外培养方式, 其在体内是否真实存\r\n在缺乏严格遗传学证据证明 [23]。利用双同源重组\r\n谱系示踪技术, 我们团队[6,24]以及其他团队[25]先后证\r\n明BASCs属于肺脏多潜能干细胞, 当支气管损伤后\r\nBASCs会分化为club细胞和纤毛细胞促进支气管上\r\n皮修复, 当肺泡损伤后BASCs又可以分化为AT2细\r\n胞和AT1细胞促进肺泡上皮再生修复。利用单细胞\r\n克隆分析技术, 我们也发现当给与支气管和肺泡两\r\n种损伤后, 单个BASC具有向支气管和肺泡双向分化\r\n潜能, 可以同时分化为club细胞、纤毛细胞、AT2细\r\n胞和AT1细胞促进支气管和肺泡再生修复[24]。<\/p>


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关于肺损后AT2细胞的再生来源一直属于领域\r\n内研究热点。最近有国际权威期刊提出了全新的概\r\n念, 认为AT1细胞和club细胞也可以通过转分化AT2细\r\n胞促进肺再生[26-29,31-33]。首先对于AT1细胞, PSTEIN团\r\n队[26]首先报道AT1细胞在肺切模型中可以转分化AT2\r\n细胞从而促进肺泡再生。随后, MORRISEY团队[27-28]\r\n先后报道在高氧损伤模型及左肺结扎诱导的肺泡\r\n张力缺失模型中同样可以观测到AT1细胞转分化为\r\nAT2细胞。细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle \r\n42, CDC42)蛋白在依赖于肌动蛋白细胞骨架的细胞\r\n过程中发挥重要作用, 例如细胞迁移、细胞极性和\r\n细胞命运决定等。蛋白酪氨酸激酶2(protein tyrosine \r\nkinase 2, PTK2)在介导细胞接触、细胞迁移方面同\r\n样发挥重要调控作用。MORRISEY团队[28]进一步发\r\n现, 在AT1细胞中敲除Cdc42或Ptk2基因后会导致细\r\n胞机械应力减小, 直接促使AT1细胞转分化为AT2细\r\n胞。Krüppel样因子5(Kruppel-like factor 5, KLF5)属\r\n于一种锌指转录调节因子, MORRISEY团队[29]同样\r\n发现在AT1细胞中敲除Klf5基因后也会诱导AT1细胞\r\n转分化为AT2细胞。对于肺癌起源, 以往研究发现\r\n在支气管club细胞和肺泡AT2细胞中过表达致癌基\r\n因KrasG12D均可以诱导其恶性扩增并发展为肺癌[30]。\r\n近期DESAI团队[31]在Nature期刊报道当在AT1细胞\r\n中过表达KrasG12D也可诱导其重编程为AT2干细胞,这项研究提出 AT1细胞是一种新的肺腺癌细胞起\r\n源。对于club细胞, CHAPMAN团队[32]通过类器官\r\n培养和细胞移植等技术发现club细胞存在一个H2-\r\nK1high干细胞亚群, 可以在肺损伤后分化为AT2细胞\r\n促进肺泡修复再生。LEE团队[33]进一步通过体内谱\r\n系示踪实验报道在博来霉素诱导的肺损伤模型中 , \r\nclub细胞会迁移至肺泡区域分化为AT2细胞促进肺\r\n泡再生。以上这些报道均属于肺脏干细胞研究突破\r\n性发现, 极大地推进了肺脏再生领域研究发展。然\r\n而, 这些研究中用来标记AT1细胞的遗传工具Hopx\u0002CreER和club细胞遗传工具Scgb1a1-CreER的特异性\r\n未被严格评估, 利用其所得出的实验结论存在质疑。\r\n然而, 我们前期研究发现这些遗传工具具有非特异\r\n性标记问题[5], 说明AT2细胞是否能来源于AT1细胞\r\n或club细胞确实存在科学争议, 领域内亟需构建更\r\n为精准的谱系示踪新技术对这些争议进行阐明。<\/p>


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4 肺损后AT1细胞不会转分化为AT2细胞<\/p>

为了阐明AT2细胞是否可以来源于AT1细胞或\r\nclub细胞, 我们首先对领域内普遍使用的AT1细胞标\r\n记工具Hopx-CreER, 进行了系统性鉴定[26-29,31]。对稳\r\n态下成体Hopx-CreER;R26-tdT工具小鼠进行肺脏切\r\n片及免疫荧光染色分析, 发现其除了标记AT1细胞外, \r\n还“非特异”标记约66% club细胞、约92% ciliated细\r\n胞、约12% BASCs和约0.24% AT2细胞。由于之前研\r\n究已经提出BASCs、club细胞和AT2细胞在肺脏损后\r\n可以贡献给AT2细胞, 因此这些“非特异性”标记细胞\r\n会对Hopx-CreER;R26-tdT的谱系示踪结果产生很大干\r\n扰[5]。同时我们也构建了Hopx-2A-DreER工具小鼠, 也\r\n验证在Hopx-2A-DreER;R26-RSR-tdT小鼠中同样发现\r\n非特异性标记问题。tdT除了标记AT1细胞外, 还“非\r\n特异”标记club细胞、ciliated细胞和少部分BASCs[5]。\r\n另外, 我们也发现领域内另一种AT1遗传工具Ager\u0002CreER除了标记AT1细胞也会“非特异性”标记一部分\r\nAT2细胞和少量BASCs[34]。通过这些实验, 我们揭示\r\n基于Hopx基因或Ager基因的传统单同源重组酶驱动\r\n的谱系示踪技术具有非特异性标记问题, 因此无法利\r\n用其对AT1细胞进行严格的谱系示踪研究。亟需构建\r\n谱系示踪新技术对其AT1细胞可塑性重新进行研究。<\/p>


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通过对比, 我们发现Hopx-2A-DreER与Ager\u0002CreER非特异性标记的细胞类型具有“互斥”特点, \r\n即Hopx-2A-DreER“非特异性”标记细胞类型主要是ciliated细胞和club细胞, 而Ager-CreER“非特异性”细\r\n胞类型主要是AT2细胞和BASCs。因此, 我们提出\r\n是否可以利用双同源重组酶驱动的谱系示踪新技\r\n术来解决此难题。基于这个“互斥”特点, 我们首先\r\n利用交叉标记策略(intersectional strategy)[6]尝试对\r\nHopx+\r\nAger+\r\n AT1细胞进行特异性标记(图2A)。这个\r\n交叉标记策略的双同源重组报告系统序列结构是\r\nRosa26-rox-stop-rox-loxP-stop-loxP-tdTomato(简称\r\n为R26-RSR-LSL-tdT)。在这个系统中, 只有细胞中同\r\n时发生Dre-rox和Cre-loxP重组, 后面的报告基因tdT\r\n才会表达(图2A)。通过小鼠配繁我们获得Hopx-2A\u0002DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT三基因型小鼠, \r\n注射他莫昔芬后收取肺脏样本进行体内验证, 成功\r\n证明其可实现对约80% Hopx+\r\nAger+\r\n AT1细胞特异性\r\n标记(图2B~图2D)。然而, 结合多种肺损伤模型(肺\r\n切、博来霉素和高氧损伤模型), 我们并未检测到肺\r\n损后AT1细胞转分化为AT2细胞(图2E~图2G)。<\/p>


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上述策略只是标记Hopx+\r\nAger+\r\n AT1细胞亚群, \r\n为了更高效率地标记所有AT1细胞, 我们尝试利用\r\n嵌套策略(nested strategy)来对AT1细胞进行研究[3]。\r\n这个嵌套策略双报告系统序列结构是Rosa26-loxP\u0002rox-stop-rox-ZsGreen-stop-loxP-tdTomato(简称为\r\nR26-NR2)。在这个系统中, rox识别位点位于内侧, \r\nloxP识别位点位于rox-stop-rox-ZsGreen外侧, 当细\r\n胞内发生Dre-rox重组后该细胞会被标记为ZsGreen, \r\n当再次发生Cre-loxP重组后ZsGreen和stop序列均会\r\n被切除, 细胞最终被标记为tdTomato(图3A)。我们\r\n前期实验已经证明Hopx-2A-DreER除了标记AT1细\r\n胞外, 还“非特异”标记club细胞、ciliated细胞、少\r\n部分AT2细胞和BASCs。而Sox2-CreER工具可以\r\n标记club细胞和ciliated细胞, Sftpc-CreER工具可以\r\n标记AT2细胞和BASCs, 因此为“封闭”这些“非特异\r\n性”标记细胞类型, 我们构建了双同源重组“嵌套策\r\n略”遗传工具: Hopx-2A-DreER;Sox2-CreER;Sftpc\u0002CreER;R26-NR2四基因型工具小鼠。在此策略中, \r\nHopx+\r\n AT1细胞发生Dre-rox重组后会被特异性标记\r\n为ZsGreen, 而在“非特异”标记的club细胞、ciliated\r\n细胞、BASCs及AT2细胞中由于再次发生Cre-loxP\r\n重组均会被统一标记为tdTomato(图3B)。通过验证, \r\n我们发现这一策略是可行的, 可以高效、特异性标\r\n记约98% AT1细胞, 而AT2细胞、club细胞、ciliated\r\n细胞和BASCs均被标记为tdTomato(图3C和图3D)。然而结合多种肺损伤(肺切损伤和博来霉素损伤)模\r\n型, 我们仍然未检测到新生AT2细胞来源于AT1细胞\r\n(图3E~图3G)。近期也有研究团队发现Hopx+\r\nIgfbp2+\r\nAT1细胞在肺切损伤模型中不会转分化为AT2细胞, \r\n我们的研究结论也与该报道一致[35]。因此, 通过构\r\n建两种双同源重组谱系示踪新技术, 我们揭示AT1\r\n细胞不具备可塑性, 在肺损伤修复中不会转分化为\r\nAT2细胞, 解决了这一重要科学争议。<\/p>


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\"ZB-2.jpg\"/<\/p>

A: 利用交叉标记策略对Hopx+\r\nAger+\r\n AT1细胞进行特异性标记。B: Hopx-2A-DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT小鼠他莫昔芬诱导后收取肺脏\r\n切片进行免疫荧光共染tdT、AGER或Scgb1a1。C: 统计tdT标记的肺上皮细胞类型。D: 卡通图表示利用交叉策略实现对AT1细胞特异性标记。E: \r\n对Hopx-2A-DreER;R26-RSR-tdT对照组小鼠和Hopx-2A-DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT实验组小鼠进行博来霉素损伤。4周后, 收取肺脏样\r\n本进行tdT和Sftpc免疫荧光染色。F: 统计tdT标记的AT2细胞比例。****P<0.000 1。G:卡通示意图展示AT1细胞不会转分化为AT2细胞。 <\/span><\/p>

A: a schematic diagram showing the intersectional genetic strategy for lineage tracing of Hopx+\r\nAger+\r\n AT1 cells. B: immunostaining of tdT, AGER, and \r\nScgb1a1 on lung sections of Hopx-2A-DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT mice after tamoxifen treatment. C: quantification of the percentage of pul\u0002monary epithelial cells that are labeled by tdT. D: schematic diagram illustrating the AT1 cells are specifically labeled by intersectional genetic strategy. \r\nE: immunostaining of tdT and Sftpc on lung sections of Hopx-2A-DreER;R26-RSR-tdT mice and Hopx-2A-DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT mice \r\nafter bleomycin injury. F: quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT. ****P<0.000 1. G: AT1 cells do not differentiate into AT2 cells \r\nafter bleomycin injury.<\/span><\/p>

图2 利用交叉标记策略揭示肺损后AT1细胞不会转变为AT2细胞(根据参考文献[5]修改) <\/span><\/p>

Fig.2 Intersectional genetics reveal that AT1 cells do not generate AT2 cells after lung injuries (modified from reference [5])<\/span><\/p>


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5 肺损后club细胞参与肺泡上皮再生修复<\/p>

针对领域内普遍使用的 club细胞遗传工具\r\nScgb1a1-CreER[12], 我们同样进行了系统验证。通过验\r\n证, 我们发现Scgb1a1-CreER;R26-tdT工具同样具有非\r\n特异性标记问题, 其除了标记club细胞外还会“非特异\r\n性”标记BASCs和少量AT2细胞, 这会对club细胞的谱\r\n系示踪结果产生干扰。因此我们基于Cre-loxP和Dre\u0002rox构建了另一种双同源重组报告系统, 结构为Rosa26-\r\nrox-stop-rox-ZsGreen-loxP-stop-loxP-tdTomato(简称为\r\nR26-TLR)\r\n[36]。在此系统中, 当细胞内发生Cre-loxP重\r\n组, 该细胞会被标记为tdTomato, 当细胞内发生Dre-rox\r\n重组, 该细胞会被标记为ZsGreen, 当细胞内同时发生\r\nCre-loxP和Dre-rox重组, 该细胞会被标记为tdTomato和\r\nZsGreen, 从而展现出黄色荧光标记(图4A)。因此利用\r\n此原理, 我们构建了Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-\r\nTLR三基因型工具小鼠。通过体内验证, 我们证实club\r\n细胞、BASCs和AT2细胞分别被特异性标记为tdTo\u0002mato+\r\n、tdTomato+\r\nZsGreen+\r\n和ZsGreen+\r\n, 分别称之为Club\u0002tracer、BASC-tracer和AT2-tracer。以此解决了传统技术\r\n的非特异性标记问题(图4B和图4C)。<\/p>


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结合多种肺损伤模型, 我们发现这三种细胞群\r\n对肺泡再生的贡献程度根据肺肺泡损伤的程度不同\r\n表现出显著性差异。在肺切损伤模型中, AT2细胞主\r\n要依赖于自我更新, club细胞和BASCs的贡献非常\r\n少, 两者贡献加起来低于2%。在博来霉素诱导的肺\r\n损伤模型中, 新生AT2细胞除自我更新外还来源于\r\nclub细胞(约27%)和BASCs(约11%)(图4D和图4E)。<\/p>


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为进一步挖掘club细胞对肺泡上皮修复的潜力, \r\n我们改进了双同源重组报告系统, 在rox-stop-rox序列后额外插入了p21基因序列, 可以在Dre-rox重组\r\n后同时诱导细胞过表达p21蛋白(图5A)。p21蛋白是\r\n细胞周期抑制因子, 我们前期研究发现细胞过表达\r\np21蛋白可抑制细胞增殖[37]。为封闭BASCs和AT2\r\n细胞的增殖能力, 使之不能参与再生修复, 以此激发\r\nclub细胞的可塑性潜力, 我们最终构建了双同源重\r\n组系统, 即Sftpc-DreER;R26-rox-p21-GFP;Scgb1a1-\r\nCreER;R26-LZL-tdT四基因型遗传工具。在这个系\r\n统内, club细胞内会发生Cre-loxP被标记为tdTomato, \r\nAT2细胞内会发生Dre-rox重组被标记为GFP并表达\r\np21蛋白, BASCs内同时发生Cre-loxP和Dre-rox重组\r\n会被标记为tdTomato和GFP并表达p21蛋白(图5B)。\r\n通过体内验证, 我们证明此策略是可行的。因此, 再\r\n结合博来霉素损伤模型, 我们尝试挖掘club细胞的\r\n可塑性潜能。收取博来霉素损伤4周后的肺脏进行\r\n分析, 发现AT2细胞和BASCs原本的修复能力成功\r\n被抑制, 并发现club细胞大量转分化为新生AT2细胞\r\n和AT1细胞, 统计显示损伤区域约47% AT2细胞起源\r\n于club细胞(图5C)。进一步, 收取损伤后8个月修复\r\n的肺脏进行分析, 我们惊奇地发现约82% AT2细胞\r\n起源于club细胞(图5C和图5D)。我们发现某些损伤\r\n严重的肺叶中, club细胞来源的肺泡上皮细胞可以\r\n覆盖绝大部分肺泡区域。通过以上实验, 我们揭示\r\n当AT2细胞和BASCs修复能力被抑制时, club细胞会\r\n成为新生AT2细胞主要来源, 参与肺泡上皮再生修\r\n复。通过以上多种双同源重组谱系示踪新技术, 我\r\n们阐明club细胞可作为干细胞参与肺泡上皮再生修\r\n复, 解决了这一重要科学争议。<\/p>


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\"ZB-3.jpg\"/A、B: 利用嵌套标记策略对AT1细胞进行特异性标记。C: 对Hopx-2A-DreER;R26-NR2小鼠和Hopx-2A-DreER;Sox2-CreER;Sftpc-CreER;R26-NR2\r\n小鼠肺脏切片进行ZsG和tdT免疫荧光染色。D: 卡通图表示利用嵌套策略实现对AT1细胞特异性标记。E: 对小鼠进行博来霉素损伤4周后收\r\n取肺脏样本进行tdT和Sftpc免疫荧光染色。F: 统计tdT和ZsG标记的AT2细胞比例。****P<0.000 1。G: 卡通示意图展示AT1细胞不会转分化为\r\nAT2细胞。 <\/span><\/p>

A,B: a schematic diagram showing the nested genetic strategy for lineage tracing of AT1 cells. C: immunostaining of tdT and ZsG on lung sections of \r\nHopx-2A-DreER;R26-NR2 mice and Hopx-2A-DreER;Sox2-CreER;Sftpc-CreER;R26-NR2 mice after tamoxifen treatment. D: schematic diagram il\u0002lustrating the AT1 cells are specifically labeled by ZsG and the non-AT1 cells are labeled by tdT with nested genetic strategy. E: immunostaining of tdT, \r\nZsG, and Sftpc on lung sections after bleomycin injury. F: quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT or ZsG. ****P<0.000 1. G: AT1 \r\ncells do not generate AT2 cells after bleomycin injury.<\/span><\/p>

图3 肺损后AT2细胞不会来源于AT1细胞(根据参考文献[5]修改)<\/span><\/p>

Fig.3 AT1 cells do not generate AT2 cells after lung injury (modified from reference [5])<\/span><\/p>


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6 Notch信号通路参与club细胞和BASCs\r\n向AT2细胞转分化<\/p>

利用谱系示踪新技术 , 我们揭示 club细胞和BASCs在博来霉素诱导的肺损伤模型中可以迁移至\r\n肺泡区域, 并分化为肺泡上皮细胞促进肺泡再生修\r\n复。那么在分子机制上, 是何种信号通路调控club\r\n细胞及BASCs向AT2细胞发生细胞命运转变呢？这\r\n两种分子调控机制之间又有什么区别？为了进一\r\n步探究这一科学问题, 我们对Scgb1a1-CreER;Sftpc\u0002DreER;R26-TLR工具小鼠进行博来霉素损伤, 修复\r\n4周后并分选Club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer\r\n标记细胞进行单细胞转录组测序(scRNA-seq)分析。\r\n分析显示Club-tracer标记的细胞可以被划分为多个\r\n细胞亚群(cell cluster), 包括起始标记的club细胞亚\r\n群, 还有细胞分化终点的AT2细细胞、AT1细胞亚群, \r\n以及多种中间态细胞亚群。这些细胞亚群具有不同\r\n的基因表达特点, 拟时序分析揭示这些细胞亚群之\r\n间具有紧密的谱系联系, 细胞命运转变路径从club\r\n细胞亚群经中间态细胞分化为AT2细胞和AT1细胞。\r\n另外, 根据基因表达BASC-tracer标记的细胞也可被\r\n划分为多个细胞亚群, 包括起始标记的BASC亚群, \r\n还有细胞分化后的AT2细细胞、AT1细胞亚群, 以及\r\n中间态细胞亚群。这些细胞亚群在基因表达谱系上\r\n同样具有连贯性, 拟时序分析显示细胞分化谱系起\r\n始于BASC-细胞, 然后经过中间态细胞可依次分化\r\n为AT2细胞和AT1细胞。进一步通过与Club-tracer对\r\n比, 我们发现BASC-tracer中的AT2细胞在基因表达\r\n上更接近于AT2-tracer中的AT2细胞。因为BASC的\r\n特征之一是同时表达club细胞和AT2细胞分子标记, \r\n我们前期研究也揭示BASC的基因表达位于club细\r\n胞和AT2细胞之间, 这暗示BASC可能会更快地响应损伤并转分化为更加成熟的AT2细胞。<\/p>


<\/p>

通过进一步生信分析, 我们发现在club细胞及\r\nBASCs向AT2细胞转分化过程中Notch信号通路表\r\n现下调趋势, 暗示Notch信号通路可能参与这两种细\r\n胞命运转变。我们构建的双同源重组谱系示踪新\r\n技术不仅可应用于细胞特异性遗传标记, 还可以结\r\n合条件性基因敲除技术进行细胞特异性基因敲除。\r\nRBPJ是Notch信号通路关键核转录因子, 敲除Rbpj\r\n可抑制Notch信号通路转导。因此, 为了进一步验证\r\nNotch信号通路在体内的调控作用, 我们结合Rbpjflox/\r\nflox条件性敲除小鼠, 构建了Scgb1a1-CreER;Sftpc\u0002DreER;R26-TLR;Rbpjflox/flox工具小鼠, 可实现在体内\r\n示踪club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer的同时\r\n实现在club细胞和BASCs中特异性敲除Notch信号\r\n通路(对照组小鼠基因型为: Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-TLR;Rbpjflox/+\r\n)(图6A和图6B)。对以上小\r\n鼠进行博来霉素损伤, 4周后收取肺脏组织进行切片\r\n免疫荧光分析及流式细胞分析, 我们发现与对照组\r\n相比, Notch信号通路敲除后会显著性抑制club细胞\r\n向AT2细胞转变, 反而会促进BASCs向AT2细胞转变\r\n(图6C)。我们的研究证实在肺损后club细胞可作为\r\n干细胞来源补充受损的AT2细胞, 并且首次在功能\r\n层面上揭示club细胞与BASCs属于两种不同细胞类\r\n型, 不仅具有不同基因表达特点, 而且在向AT2细胞\r\n转分化过程中受Notch信号通路相反的调控(图6D)。<\/p>


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\"ZB-4.jpg\"/A、B: 利用双同源重组谱系示踪同时对club细胞、BASCs和AT2细胞进行特异性标记。C: 对Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-TLR小鼠肺脏\r\n切片进行ZsG、tdT、Scgb1a1或Sftpc免疫荧光染色。D: 对小鼠进行博来霉素损伤后的肺脏样本进行tdT和Sftpc免疫荧光染色及统计分析。\r\n***P<0.001, ****P<0.000 1。E: 卡通示意图展示肺泡损伤后club细胞和BASCs会迁移至肺泡区域分化为AT2和AT1细胞促进肺泡修复再生。 <\/span><\/p>

A,B: schematic diagrams showing intersectional genetics for simultaneous and specific labeling of club cells, BASCs, and AT2 cells. C: immunostain\u0002ing of tdT, ZsG, Scgb1a1, and Sftpc on lung sections of Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-TLR mice after tamoxifen treatment. D: immunostaining \r\nof tdT, ZsG, and Sftpc on lung sections after bleomycin injury and quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT or ZsG. ***P<0.001, \r\n****P<0.000 1. E: cartoon image showing club cells and BASCs give rise to AT2 cells and AT1 cells after bleomycin injury.<\/span><\/p>

图4 club细胞参与肺泡再生修复(根据参考文献[5]修改) <\/span><\/p>

Fig.4 club cells contribute to alveolar epithelial cells during lung repair (modified from reference [5])<\/span><\/p>


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\"ZB-5.jpg\"/<\/span><\/p>

A、B: 利用双同源重组谱系示踪同时对club细胞、BASCs和AT2细胞进行特异性标记并在club细胞和BASCs中过表达p21蛋白。C、D: 对Sftpc\u0002DreER;R26-rox-p21-GFP;Scgb1a1-CreER;R26-LZL-tdT小鼠进行博来霉素损伤后4周和8个月的肺脏样本进行tdT和GFP免疫荧光染色及统计分\r\n析。**P<0.01, ****P<0.000 1。 <\/span><\/p>

A,B: schematic diagrams showing genetic labeling of club cells, BASCs, and AT2 cells and induce p21 expression in club cells and BASCs. C: immunostaining of tdT and ZsG on lung sections of Sftpc-DreER;R26-rox-p21-GFP;Scgb1a1-CreER;R26-LZL-tdT mice after 4 weeks and 8 months bleomycin injury. D: quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT or ZsG at 8 months post bleomycin injury. **P<0.01, ****P<0.000 1.<\/span><\/p>

图5 肺泡极端损伤下club细胞能再生大部分肺泡(根据参考文献[5]修改) <\/span><\/p>

Fig.5 Club cells regenerate the majority of alveolar epithelium after severe alveolar injury (modified from reference [5])<\/span><\/p>


<\/p>

7 总结与展望<\/p>

在器官发育与再生领域的研究主要包括体外\r\n细胞实验与体内细胞谱系研究。由于体外环境不可\r\n控, 无法准确模拟体内微环境, 因此将体外结论进行体内验证是一项重要且不可或缺的步骤。而对体内\r\n进行细胞研究往往不可避免地会使用到细胞遗传谱\r\n系示踪技术。我们已经指出传统遗传谱系示踪技\r\n术具有细胞靶向精度低的问题, 其对靶细胞的“非特\r\n异性”标记容易造成争议性结论。因此对遗传工具\r\n进行特异性标记检验是开展谱系示踪研究的重要前\r\n提。双同源重组谱系示踪新技术已被证明可以规避\r\n传统技术“非特异性”标记问题, 并揭示或阐明多个\r\n领域内重大科学争议, 彰显出新技术在谱系示踪领\r\n域巨大的应用潜力。<\/p>


<\/p>

由于传统技术的非特异性靶向缺陷, 导致领域\r\n内关于肺泡干细胞再生来源一直存在科学争议。利\r\n用更为精准的双同源重组谱系示踪新技术, 我们阐\r\n明了科学争议, 揭示肺损后新生AT2细胞除了自我\r\n更新外, 还可来源于club细胞和BASCs, 而不会来源\r\n于AT1细胞, 并阐明参与其中的分子调控机制。阐\r\n明肺泡干细胞再生来源不仅为临床肺脏疾病的诊治\r\n提供了新的研究基础和突破口, 新开发的谱系示踪\r\n新技术, 也为器官发育、再生医学及遗传学等研究\r\n提供了新的技术方法。<\/p>


<\/p>

\"ZB-6.jpg\"/<\/p>

A、B: 实验策略。对club细胞、BASCs和AT2细胞标记的同时在club细胞和BASCs中特异性敲除Notch信号通路。C: 取对小鼠进行博来霉素损\r\n伤后4周的肺脏样本进行tdT和ZsG免疫荧光染色及统计分析。*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1。D: 卡通图展示肺泡损伤后, 新生AT2细胞\r\n除了来源于AT2自我增殖外还来源于club细胞和BASCs, 而不会来源于AT1细胞。抑制Notch通路会减少club细胞向AT2细胞转分化, 而会促进\r\nBASCs向AT2细胞转分化。 <\/span><\/p>

A,B: schematic diagrams showing genetic labeling of club cells, BASCs, and AT2 cells and induce p21 expression in club cells and BASCs. C: immu\u0002nostaining of tdT and ZsG on lung sections and quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT or ZsG at 4 months post bleomycin injury. \r\n*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1. D: cartoon image showing after alveolar injury, the AT2 cells could originate from club cells and BASCs, but not \r\nfrom AT1 cells. Knock-out Notch signaling inhibits the transition of club cells into AT2 cells but promotes the transition of BASCs into AT2 cells.<\/span><\/p>

图6 Notch信号通路在club细胞和BASCs向AT2细胞转分化中承担相反的调控作用(根据参考文献[5]修改) <\/span><\/p>

Fig.6 Notch signaling distinct regulates the cell fate conversion of club cells and BASCs into AT2 cells (modified from reference [5])<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

参<\/span>考文献 (References)<\/span><\/p>

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周斌, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。2002年毕业于浙江大学医学院并获得MD; 2006年毕业于中国协和医科大学并获得PhD; 2006年至2010年在美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院从事博士后研究; 2010年9月起至今在中国科学院工作。周斌研究组主要开发遗传谱系示踪新技术, 研究哺乳动物体内细胞起源及命运调控机制, 代表性研究工作多次在Cell、Nature、Science<\/em>等国际学术期刊上发表。发现哺乳动物新生期心脏具有重新生成冠状动脉的能力, 该工作入选“中国科学十大进展”; 解决了国际心血管领域内关于心脏干细胞与心肌再生的重大科学争议; 建立了双重组酶介导的遗传学技术和邻近细胞遗传学技术, 从全新的角度揭示了器官发育与修复再生的调控机制。周斌研究员曾获得国际心脏研究会ISHR—“杰出研究员奖”、国家杰出青年科学基金资助、中国青年科技奖、科学探索奖、新基石研究员等。<\/p>","cshort2":"
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周斌, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。2002年毕业于浙江大学\r\n医学院并获得MD; 2006年毕业于中国协和医科大学并获得PhD; 2006年至2010\r\n年在美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院从事博士后研究; 2010年9月起至今在\r\n中国科学院工作。周斌研究组主要开发遗传谱系示踪新技术, 研究哺乳动物体\r\n内细胞起源及命运调控机制, 代表性研究工作多次在Cell、Nature、Science<\/em>等国际学术期刊上发表。发现哺乳动物新生期心脏具有重新生成冠状动脉的能力, \r\n该工作入选“中国科学十大进展”; 解决了国际心血管领域内关于心脏干细胞与心肌再生的重大科学争议; 建立了双重组酶介导的遗传学技术和邻近细胞遗传学技术, 从全新的角度揭示了器官发育与修复再生的调控机制。周斌研究员曾获得国际心脏研究会ISHR—“杰出研究员奖”、国家杰出青年科学基金资助、\r\n中国青年科技奖、科学探索奖、新基石研究员等。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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新型亚细胞结构血红蛋白小体增强软骨细胞的缺氧耐受<\/span><\/p>

张波1<\/sup> 孙强1,2,3<\/sup>*<\/span><\/p>

(1<\/sup>细胞工程研究室, 生物工程研究所, 军事医学研究院, 北京 100071; 2<\/sup> 细胞死亡机制创新单元(2021RU008),中国医学科学院, 北京 100071; 3<\/sup>南湖实验室, 嘉兴 314002)<\/span><\/p>


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【摘要】最近的研究显示, 作为氧气载体的血红蛋白在软骨细胞中大量产生, 并且可以通过液–液相分离(liquid-liquid phase separation, LLPS)的方式聚合成血红蛋白小体(hemoglobin body,hedy)这一全新的细胞结构。软骨细胞中血红蛋白的产生依赖于Klf1<\/em>而不是传统的Hif1/2α<\/em>途径。敲除软骨细胞中的血红蛋白会导致软骨生长板缺氧加剧以及软骨组织中心区域广泛的细胞死亡。这一工作揭示了软骨细胞耐受缺氧的新机制, 即hedy可作为氧气储备和应急供应结构促进软骨细胞的存活。<\/p>

【关键词】血红蛋白小体; 软骨细胞; 血红蛋白; Klf1<\/em>; 相分离<\/p>


<\/p>

Hemoglobin Body as a Novel Subcellular Structure EnhancesChondrocyte Hypoxia Adaption<\/p>

ZHANG Bo1<\/sup>, SUN Qiang1,2,3<\/sup>*<\/span><\/p>


<\/p>

(1<\/sup>Laboratory of Cell Engineering, Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100071,China; 2<\/sup>Research Unit of Cell Death Mechanism (2021RU008), Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100071, China; 3<\/sup>Nanhu Laboratory, Jiaxing 314002, China)<\/span><\/p>


<\/p>

【Abstract】 Recent study indicates that massive amounts of hemoglobin, a known carrier of oxygen in erythrocytes, is produced in chondrocyte, where it can form a new structure-Hemoglobin body (Hedy) by liquid-liquidphase separation. The production of hemoglobin in chondrocytes turns out to be dependent on Klf1<\/em> rather than theclassical Hif1/2α<\/em> pathway. Hemoglobin depletion leads to enhanced hypoxia that causes extensive cell death in thecenter of cartilaginous tissue. These results demonstrate uncover a heretofore unrecognized mechanism where by chondrocytes survive a hypoxic environment on hedy, an oxygen storage for emergency supply.<\/p>


<\/p>

【Keywords】hedy; hypoxia; chondrocyte; hemoglobin; Klf1<\/em>; phase separation<\/p>


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1 血红蛋白的既往研究和新发现<\/p>

血红蛋白为异源四聚体结构[1], 作为循环中最重要的携氧蛋白, 以往研究中认为除α地贫等疾病导致的病理性血红蛋白包涵体如Heinz小体[2]外, 血红蛋白均以可溶性蛋白的形式存在于红细胞中, 随血液循环为全身的组织细胞提供氧气。血红蛋白在红细胞中的表达受到HIF-EPO的经典内分泌调控通路[3-4]及红细胞内多因子调控网络的调节[5-6], 且随着红细胞的发育有序表达。过去血红蛋白被认为只在红细胞中表达, 但新近研究发现软骨细胞在缺氧条件下也会产生大量血红蛋白, 在细胞质内形成无膜的血红蛋白小体(hemoglobin body, hedy), 而血红蛋白小体则通过自身的储氧能力, 增强了软骨细胞对于缺氧环境的适应能力, 从而保证了软骨组织在无血管和无血液供氧条件下的正常发育和存活。<\/p>


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2 软骨细胞中血红蛋白小体的发现及形成机制研究<\/p>

通过组织切片, 研究者在人和小鼠的软骨细胞中观察到一种可以被伊红染料深着色的细胞结构 ,在电镜观察中 , 此结构形态与红细胞极为类似 [7]。进一步通过质谱分析和免疫组织染色等技术发现 ,此结构含有大量的血红蛋白β亚基(hemoglobin betasubunit, HBB)和一定量的血红蛋白α亚基(hemoglobin alpha subunit, HBA)[7]。这些结果表明, 软骨细胞中存在大量的血红蛋白, 并形成了类似红细胞的结构。<\/p>


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为了进一步探索此结构的性质, 研究者对其进行了透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察, 发现此结构是一种分布在软骨细胞胞质中的无膜小体而非红细胞, 提示血红蛋白可能通过相分离的方式形成了聚集体。与此相一致 ,研究者发现 HBB可以在多种细胞系的胞质中形成蛋白聚集物(图1A和图1B)。同时延时显微镜拍摄显示这些蛋白小体之间可以相互融合(图1C), 并且其荧光可以在光漂白后数分钟内快速恢复(图1D和图1E), 这表明蛋白小体的存在具有液相特征。此外,光电关联技术(correlative light and electron microscopy, CLEM)也确认了这些细胞质中的蛋白聚集物没有被膜包裹(图1F)。研究者通过序列分析确定了分别位于 HBB的氨基端和羧基末端的两个短的内在无序区(intrinsically disordered region, IDR), 能发生相分离的蛋白往往富含此类结构[8-9], 进一步实验发现通过突变其羧基端的IDR可以有效抑制聚集体的形成(图1G~图1I)。<\/p>


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\"SQ-1.jpg\"/<\/p>


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A: HepG2细胞中表达的EGFP和HBB-EGFP的荧光图像。白色箭头表示HBB-EGFP形成的聚集体。B: 不同细胞系中聚集体形成的量化结果。数据为3个视野的x_±s, 每个视野分析的细胞超过300个。C: 延时拍摄图像显示两个HBB-EGFP聚集体的融合过程。D: 延时拍摄图像显示HBBEGFP聚集体的光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleach, FRAP)实验的结果。E: HBB-EGFP聚集体的FRAP数据的量化结果(平均值±SEM, n=10)。F: 通过光电关联(CLEM)获得的HBB-EGFP聚集体的荧光(左)和电子透射显微镜图像(右)。G: 示意图展示了具有单个及多个无序区域(绿色框)缺失或者A139P点突变(红色条)的HBB突变体。H、I: 通过过表达EGFP标记的HBB突变体的细胞内形成聚集体的阳性率统计图(H)和显微拍摄图(I)。<\/span><\/p>

A: presentative images of EGFP and HBB-EGFP expressed in 293T cells. Arrow head indicates foci formed by HBB-EGFP. B: quantification of fociformation in different cell lines. Data are x_±s of 3 or more fields with more than 300 cells analyzed each. C: image sequence shows example of fusion oftwo HBB-EGFP foci. D: image sequence shows example of the FRAP experiment of HBB-EGFP foci. E: quantification of FRAP data (means ± SEM,n=10 experiments) for HBB-EGFP foci. F: fluorescence (left) and electron transmission microscopic images (right) of HBB-EGFP condensate by correlative light and electron microscopy (CLEM). G: schematic demonstration of HBB mutants with truncations in single or combined disorder motifs(green boxes) (∆N, ΔC, ΔN & ΔC), or with a point mutation of A139P (red bar). H,I: quantification (H) and representative images (I) of foci formationof the indicated HBB-EGFP mutants in 293T cells.<\/span><\/p>

图1 相分离促进了血红蛋白小体的形成(根据参考文献[7]修改)<\/span><\/p>

Fig.1 Phase separation promotes hedy formation (modified from reference [7])<\/span><\/p>


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为了进一步验证HBB的液液相分离特性, 研究者纯化了HBB-EGFP蛋白, 并且发现在特定的缓冲液中HBB-EGFP可以相互聚集形成液滴状分布, 且液滴之间可以相互融合(图2A)。进而研究者通过纯化无标记的 HBB进行体外实验得到了一致性的结果, 从而排除了EGFP对于蛋白液液相分离特性的影响, 同时发现只有在同时满足较高的蛋白浓度(大于250 ng/μL)和一定的离子浓度(0~150 mmol/L)的条件下才会形成明显的HBB液滴(图2B)。进一步实验发现在没有 HBB的情况下 , HBA不能单独形成液滴 (图 2C), 而且 HBB液滴之间也可以相互融合(图2D)。在体外, 相应的IDR区域突变同样可以有效抑制HBB液滴的形成, 与细胞内结果一致(图2E和图2F)。综合以上结果, 研究者发现血红蛋白具有液液相分离的特性 , 这促进了血红蛋白小体的形成。<\/p>


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\"SQ-2.jpg\"/<\/p>

A: 纯化后的HBB-EGFP蛋白在相应缓冲液(150 mmol/L KH2PO4/K2HPO4; pH=7.35; 10% PEG2000; 蛋白浓度为1 μg/uL)中的形成的荧光液滴和液滴融合过程的延时拍摄图像。红色和白色箭头表示融合前的两个液滴, 黄色箭头表示融合后的液滴。B: 不同蛋白浓度和缓冲液浓度条件下HBB形成的液滴显微拍摄图。C: HBB和HBA通过不同比例进行混合后液滴形成的显微拍摄图。D: 延时拍摄图像显示HBB液滴之间相互融合的过程。E: HBB及其IDR突变体在缓冲液中形成液滴的对比图。F: HBB, HBA及其突变体的蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳鉴定结果。<\/span><\/p>

A: liquid phase separation of HBB-EGFP (upper panel) in LLPS buffer (150 mmol/L KH2PO4/K2HPO4; pH 7.35; PEG2000 10% (w/v); HBB-EGFP 1 μg/μL) andtimelapse imaging of HBB-EGFP droplet fusion (lower panel), white arrows and red arrows indicate droplets before fusion, yellow arrow indicates fused droplet.B: droplet formation of the purified untagged HBB in different conditions. C: droplet formation of the purified untagged HBA, HBB and the mixture ofthem in the different proportion in phase separation buffer. D: timelapse imaging of the purified untagged HBB droplet fusion. E: droplet formation ofthe purified HBB and its IDR mutants in phase separation buffer. F: coomassie brilliant blue stained gels of the purified HBA, HBB and HBB mutants.<\/span><\/p>

图2 血红蛋白的体外液液相分离验证(根据参考文献[7]修改)<\/span><\/p>

Fig.2 Phase separation of hemoglobin in vitro (modified from reference [7])<\/span><\/p>


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3 乏氧对于血红蛋白的调节依赖于Klf1而非Hif1/2<\/span><\/p>

软骨组织为无血管组织 , 因其缺乏血液供应 ,氧气只能通过体液扩散进入软骨组织, 软骨细胞长期处于乏氧环境中。而乏氧则是公认的血红蛋白表达的诱导因素[10-12], 研究者通过对分离得到的软骨组织和细胞进行乏氧处理发现乏氧可以有效地诱导血红蛋白的表达。但是在敲除小鼠软骨细胞中的Hif1/2后, 血红蛋白的表达未有明显的变化, 这说明血红蛋白的表达不依赖于缺氧激活的HIF信号调节。因此, 研究者进一步对于红细胞及软骨细胞发育过程中发挥重要作用的分子[13-15]在乏氧处理后的表达变化进行检测, 发现只有Klf1的转录水平在乏氧处理后显著上调。Klf1作为转录因子在珠蛋白亚型转换中发挥着重要作用, 有研究发现其确实可以导致小鼠的β-地中海贫血[15-16]。在小鼠软骨细胞中特异性敲除klf1后, 血红蛋白的表达被显著抑制, 并且chip实验证明, KLF1蛋白直接结合血红蛋白的增强子和转录调控区域, 表明乏氧依赖于klf1调节血红蛋白的表达。<\/span><\/p>


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最近发表于Science杂志上的一项研究阐明了一种不依赖于Hif1基因的乏氧响应机制, 缺氧介导的去甲基化酶KDM5A水平下降通过提高基因区域的H3K4me3水平造成Klf10的上调[17]。巧合的是, 生物信息学分析在Klf1基因中预测到了H3K4me3的修饰位点, 表明Klf1是乏氧通过Kdm5a进行修饰调控的潜在靶点。进一步实验发现敲低Kdm5a即使在常氧条件下也显著提高了Klf1的H3K4me3修饰水平,同时上调了Klf1的表达。<\/span><\/p>


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4 hedy作为储氧结构增强细胞缺氧耐受保证细胞存活<\/span><\/p>

通过软骨细胞特异性敲除血红蛋白, 研究者发现血红蛋白的缺失会破坏hedy的形成, 造成软骨组织尤其是生长板中心区域的缺氧程度加剧, 同时使大量软骨细胞死亡 [7]。为了探究内源表达的血红蛋白与细胞供氧的关系, 研究者测定了小鼠软骨细胞和红细胞的氧离曲线, 发现野生型软骨细胞具有和红细胞相似的氧离曲线, 证明其本身具有结合和释放氧气的能力, 同时野生型软骨细胞具有更低的P50, 说明相较于红细胞, 软骨细胞对于氧气的亲和力更强, 相应地敲除血红蛋白后, 软骨细胞则失去了此项能力(图3A)。为了进一步证实hedy可以作为缺氧时的供氧结构, 研究者将hedy分离出来与对乏氧高度敏感的PC12细胞在密闭小室中共培养, 发现hedy可以显著降低PC12细胞中缺氧响应分子HIF1的转录水平(图3B~图3D)。进一步, 通过在软骨细胞系ATDC5中过表达血红蛋白, 发现在乏氧条件下内部存在hedy的细胞的胞核中HIF1信号强度显著低于周围细胞(图3E和图3F), 说明存在hedy的细胞更耐受缺氧。因此, 这些数据支持hedy作为局部储氧结构这一观点, 该结构通过提供细胞所需的氧气, 以维持软骨细胞在缺氧环境中的生存。<\/span><\/p>

\"SQ-3.jpg\"/<\/span><\/p>

A: 红细胞(RBCs)、野生型(WT)和Hbb敲除(Hbb-cKO)的软骨细胞的氧离曲线。Hbb-cKO的软骨细胞的氧结合能力几乎丧失。B: 从共表达HBA-mCherry和HBB-EGFP的293T细胞中收集的血红蛋白小体的代表性图像(左图为低倍大视野, 右图为高倍放大视野)。C: 密闭小室中的共培养实验示意图, 其中缺氧反应性细胞在中心小皿中培养, 而RBC或血红蛋白小体放置在小皿之外, 整体密闭24 h以制造缺氧环境。D: 通过定量PCR检测上述密闭小室实验中不同条件下Hif1α的表达。E: ATDC5细胞中HIF-1α染色的代表性图像。HIF-1α标记为深粉红色, 细胞核标记为蓝色, HBA-mCh为红色, HBB-EGFP为绿色。白色虚线描绘的是细胞轮廓, 蓝色虚线描绘的是细胞核。F: ATDC5细胞核中HIF-1α信号的荧光强度定量分析结果。n=33个存在血红蛋白小体的细胞, 341个不存在血红蛋白小体的细胞。<\/span><\/p>

A: oxygen dissociation curves of red blood cells (RBCs), wild-type (WT) and Hbb-cKO chondrocytes. The chondrocytes of Hbb-cKO displayed pooroxygen binding capability as indicated by fluctuated curve. B: representative images of RBC (right panel) and hemoglobin condensates collected from293T cells co-expressing HBA-mCherry and HBB-EGFP (left panel for low magnification view, right panel for zoomed view). C: schematic diagramfor the nest coculture experiment, where the hypoxia-responsive cells were cultured in the inner dish while the RBCs or the hemoglobin condensateswere placed in the outer dish that were sealed for 24 h to create a hypoxia condition. D: expression of Hif1α under the indicated conditions of nestcoculture as examined by quantitative PCR. E: representative images for HIF-1α staining in ATDC5 cells. HIF-1α in deep pink, nuclei in blue, HBAmCh in red, HBB-EGFP in green. White dashed lines indicate outlines of foci positive cells, blue dashed lines indicate nulei of foci positive cells. F:quantification of the nuclear HIF-1α intensities in ATDC5 cells. n=33 for foci positive cells, 341 for foci negative cells.<\/span><\/p>

图3 血红蛋白小体的供氧功能验证(根据参考文献[7]修改)<\/span><\/p>

Fig.3 Oxygen supply function of hemoglobin body (modified from reference [7])<\/span><\/p>


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5 总结与展望<\/span><\/p>

在既往研究中 , 血红蛋白在红细胞之外的组织细胞(包括血管内皮细胞[18]、气道上皮细胞[19]、系膜细胞[20]、神经元和神经胶质细胞[8]等)中表达偶有报道。但是大部分研究对于红细胞外血红蛋白的生物学功能的探究都基于推断 , 缺乏确凿的体内证据, 对于其调控机制更是缺乏深入研究。本研究通过体外生化实验和体内遗传修饰模型 , 发现并验证了血红蛋白小体作为储氧结构提供应急氧气供应从而保证细胞存活和软骨的正常发育, 与以上发现一致的是, 地中海贫血综合征患者常见关节疼痛 [21], 软骨相关疾病的患者中也多见低血红蛋白症状 , 如类风湿性关节炎 (rheumatoidarthritis, RA, 30%~70%)[22-23]和软骨发育不全 (约73%)[24]。此外, 血红蛋白较低的RA患者往往存在更严重的关节病变 [25], 而且关节症状可以在贫血纠正后得到缓解 [26]。这提示软骨细胞中的血红蛋白可能在疾病过程中发挥着重要作用。<\/span><\/p>


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本研究首次揭示了血红蛋白在正常组织中发挥的重要生物学功能 , 而且发现了血红蛋白独立于 HIF之外的表达调控新机制。同时在本研究中,研究者发现了血红蛋白组成的新型细胞结构—血红蛋白小体(hedy), 这是除病理性血红蛋白聚集形成包涵体[2]之外, 首次发现的细胞内具有生理性功能的血红蛋白聚集结构。血红蛋白的体外研究发现 , 血红蛋白多聚体往往存在着更高的氧气亲和力[27-28], 这与本文的研究结果相一致, 也说明血红蛋白的存在形式和结构可以影响血红蛋白的功能特性。而且通过详尽的实验, 研究者证明了血红蛋白液液相分离特性有助于 hedy的形成 , 同时发现了 IDR区域对于血红蛋白液液相分离的调控作用, 这说明血红蛋白聚集和小体形成是可控的, 为通过控制血红蛋白的聚集对体内部分生理或者病理过程实现调控这一构想提供了可能性。<\/span><\/p>


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参考文献 (References)<\/span><\/p>

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孙强研究员, 博士生导师, 军事科学院军事医学研究院研究员、研究室主任, 中国医学科学院“细胞死亡机制”院外创新单元主任。中国细胞生物学学会细胞死亡分会常委, 中国细胞生物学学会–细胞工程与转基因生物分会委员; 中国抗癌协会肿瘤分子医学专业委员会委员; Cell Death Differ<\/em>期刊执行编委。承担国家自然科学基金、重点研发计划等多项课题。以通讯作者身份在Nature、Cell Res、Cell Death Diffe、Adv Sci、Cell Discov、Cell Rep、Signal Transduct TargetTher、Nucleic Acids Res<\/em>等国际专业顶级杂志发表SCI论文50余篇。<\/p>","cshort2":"
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孙强研究员, 博士生导师, 军事科学院军事医学研究院研究员、研究室主任, 中国医学科学院“细胞死亡机制”院外创新单元主任。中国细胞生物学学会细胞死亡分会常委, 中国细胞生物学学会–细胞工程与转基因生物分会委员; 中国抗癌协会肿瘤分子医学专业委员会委员; Cell Death Differ<\/em>期刊执行编委。承担国家自然科学基金、重点研发计划等多项课题。以通讯作者身份在Nature、Cell Res、Cell Death Diffe、Adv Sci、Cell Discov、Cell Rep、Signal Transduct TargetTher、Nucleic Acids Res<\/em>等国际专业顶级杂志发表SCI论文50余篇。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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相分离介导细胞内短距离囊泡运输<\/strong><\/p>

吴先登1<\/sup>\r\n 裘骅1<\/sup>\r\n 张明杰2<\/sup>*<\/p>

(1<\/sup>香港科技大学生命科学部, 香港; 2<\/sup>南方科技大学生命科学学院, 深圳 518055)<\/p>


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[摘要] 细胞内的囊泡运输大致分两类, 一类是经典的马达蛋白与细胞骨架依赖性的长距离\r\n运输, 另一类是局域的短距离运输。短距离运输也有明确的方向, 却不依赖马达蛋白或细胞骨架, \r\n长期以来科研人员对短距离囊泡运输原理缺乏清晰的理解。以突触囊泡(synaptic vesicle, SV)的\r\n定向转运为例, 该研究发现了一种新的由相分离介导的、钙信号调控的、定向的运输方式。具体来讲, 一个名为Pclo(Piccolo)的支架蛋白, 通过与囊泡发生受钙信号调控的相分离, 一方面介导囊泡从储备池的提取, 另一方面促进囊泡在活性区的栓系。此外, 该研究还发现, 在普通的动物细胞\r\n中, TFG(Trk-fused gene)的相分离可以介导COPII(coat protein complex II)囊泡从内质网(endoplasmic \r\nreticulum, ER)到内质网–高尔基体中间体(ER-Golgi intermediate compartment, ERGIC)的转运。因此, \r\n相分离提供了一种普适的介导短距离囊泡定向运输的方式。<\/p>

[关键词] 相分离; 无膜细胞器; 囊泡运输; 突触囊泡循环<\/p>


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国家自然科学基金委基础科学中心项目(批准号: 82188101)、国家重点研发计划(批准号: 2019YFA0508402)和深圳市孔雀计划(批准号: KQTD20210811090115021)<\/p>

资助的课题<\/p>

*通信作者。Tel: 0755-88015947, E-mail: zhangmj@sustech.edu.cn<\/p>

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.82188101), the National Key R&D Program of China (Grant<\/p>

No.2019YFA0508402), and the Shenzhen Talent Program (Grant No.KQTD20210811090115021)<\/p>

*Corresponding author. Tel: +86-755-88015947, E-mail: zhangmj@sustech.edu.cn<\/p>


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Phase Separation Mediates Short-Distance Vesicle Transport in Cells<\/strong><\/p>

WU Xiandeng1<\/sup>, QIU Hua1<\/sup>, ZHANG Mingjie2<\/sup>*<\/p>

(1<\/sup>Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong, China<\/em>; <\/p>

 2<\/sup>School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, Shenzhen 518055, China<\/em>)<\/p>


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[Abstract] Cellular vesicles are moved via two distinct routes: the canonical motor-powered transport, \r\nwhich moves along cytoskeletons typically over long distances, and local and short-distance transport. The short-distance transport is also with directions but does not involve molecular motors and cytoskeletons. The molecular \r\nmechanisms underlying short-distance vesicle transport are totally unknown. Using SV (synaptic vesicle) transport \r\nas a paradigm, this study discovers a new way of short-distance vesicle transport mediated by phase separation in \r\na Ca2+-regulated and directional manner. Specifically, a scaffold called Pclo (Piccolo) in the presynaptic bouton un\u0002dergoes phase separation with SV. On the one hand, Pclo can extract SVs from the reserve pool, on the other hand, \r\nPclo can facilitate SV tethering on the active zone. In addition, this study further finds a protein called TFG (Trk-fused \r\ngene) can facilitate COPII (coat protein complex II) vesicles transport from ER (endoplasmic reticulum) to the \r\nERGIC (ER-Golgi intermediate compartment) via phase separation. Therefore, phase separation may be a general \r\nmechanism for short-distance vesicle transport in cells.<\/p>

 [Keywords] phase separation; membraneless organelles; vesicle transport; synaptic vesicle cycle<\/p>


<\/p>

1 细胞内短距离囊泡运输的需求<\/strong><\/p>

 囊泡运输是细胞中物质运输的一种不可或缺的\r\n方式。通常来讲, 囊泡以货物的形式被马达蛋白识别, \r\n并沿着细胞骨架进行定向运输[1-2]<\/sup>。细胞内也有局域\r\n的短距离运输囊泡的需求, 但是我们对这种运输方式\r\n的原理几乎一无所知。比如高尔基体不同腔室之间\r\n的囊泡运输, 只经历数百纳米的路程[3-4]<\/sup>。又如在突触\r\n前膜, 突触囊泡(synaptic vesicle, SV)需要从突触小结\r\n内部转运到细胞膜附近以实现囊泡与质膜的融合以\r\n及神经递质的释放, 这个距离也只有数百纳米[5-7]<\/sup>。对\r\n这种局部的、短距离的定向运输, 基于马达蛋白与细\r\n胞骨架的运输方式可能并不参与其中。一方面, 马达\r\n蛋白依赖性转运的条件比较苛刻, 除了马达蛋白和细\r\n胞骨架外, 通常还需要接头蛋白、小G蛋白、ATP等\r\n因子的协调[2,8]<\/sup>, 对短距离运输来说, 这可能并不是一\r\n种经济有效的方式; 另一方面, 如上描述的两种场景, \r\n细胞骨架似乎并未涉及其中[9-11]<\/sup>, 对马达蛋白的抑制\r\n也并未导致运输异常[12]<\/sup>。自由扩散是另一种潜在的\r\n运输方式, 却无法满足方向性的需求。因此, 我们推\r\n理应该有其他的方式来介导短距离囊泡运输。<\/p>


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2 突触前膜——研究蛋白质相分离与囊\r\n泡互作的经典模型<\/strong><\/p>

    突触前膜是研究囊泡运输的一个经典模型。SV可被马达蛋白(驱动蛋白)带动沿着细胞骨架(微\r\n管)从胞体转运到轴突末梢(突触小结)[13-14]<\/sup>。对 SV\r\n沿着轴突转运过程的研究直接促成了驱动蛋白的发现[15]<\/sup>, 以及对马达蛋白依赖性的长距离囊泡运输\r\n的原理的发掘[1-2,8]<\/sup>。那么对SV在突触小结内部的组\r\n织与移动的研究, 很可能推动我们揭开短距离囊泡\r\n运输的神秘面纱。<\/p>

    在一个成熟的突触小结中, SV被组织成三个亚\r\n群, 形成三个不同的功能区[16-19]<\/sup>, 它们分别是: 维持\r\n在轴突内部远离细胞膜的储备池(reserve pool), 其中\r\nSV数目占比达SV总数的80%以上; 锚定在突触前膜\r\n活性区(active zone)的即刻可释放池(readily releas\u0002able pool, RRP), SV数目占比<5%; 以及在储备池和\r\nRRP之间穿梭的循环池(recycling pool)。SV在突触\r\n小结中循环, 静息状态下处于储备池中的SV需要经\r\n历栓系(tethering)、锚定(docking)、启动(priming)才\r\n能到达活性区, 构成RRP。 只有RRP中的SV才能直\r\n接响应突触激活后流入的钙信号, 实现与细胞膜的\r\n融合(fusion)以及神经递质的释放[7,20]<\/sup>。膜融合后, 活\r\n性区的RRP需要被储备池中的SV及时补充。<\/p>

    SV在突触小结中并非孤立存在, 一方面SV本\r\n身包被着许多蛋白, 另一方面SV所处的空间环境充\r\n满着拥挤的蛋白质[21-22<\/sup>]。虽然不同亚群的SV在组\r\n成上并没有太大区别, 但是不同亚群的SV与不同的\r\n蛋白质相偶联, 而且不同蛋白质也参与到不同亚群\r\n的SV的维持当中。比如, 对突触蛋白(synapsin)进\r\n行遗传敲除或者抗体封闭都会特异性地导致储备\r\n池的减少, 而不影响已经定位在活性区的SV的数量[17,23<\/sup>]。\r\n相反地, 如果对活性区的支架蛋白, 如Rab3互作蛋\r\n白(Rab3 interacting molecule, RIM)、RIM结合蛋白\r\n(RIM binding protein, RIMBP)、 ELKS(a protein rich \r\nin glutamate, leucine, lysine and serine)等进行遗传\r\n干扰, 则会使SV不能定位到活性区, 而储备池的SV\r\n不受影响[24-25]<\/sup>。<\/p>

    突触是一个高度特化的结构, 突触内部有着非\r\n常精细的结构和功能分区[26-27]<\/sup>。传统的观点认为, \r\n生物膜包裹的细胞器是将细胞进行分区的基本方式。近些年大分子相分离和无膜细胞器的发现极大地扩充了我们对细胞分区的认识[28-31]<\/sup>, 这种不依赖\r\n于生物膜的大分子凝聚体更加灵活, 既能特异性地\r\n富集分子形成结构和功能性区室, 又能快速响应细\r\n胞信号进行动态调控。<\/p>


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\"zjm-1.png\"/<\/p>

A: 突触相分离总结; B: 相分离视野下的突触囊泡循环。 <\/p>

A: phase separation at the synapse; B: synaptic vesicle cycle in the view of phase separation. <\/p>

图1 突触前膜相分离总结(根据参考文献[32-33]修改) <\/p>

Fig.1 Phase separation at presynaptic boutons (modified from the references [32-33]) 
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    在突触前膜中, 不同的大分子凝聚体相继被报道[32-33]<\/sup>(图1)。有意思的是, 这些无膜细胞器以不同\r\n的方式特异性地与有膜的SV相互作用, 例如, 突触\r\n蛋白形成的蛋白凝聚体可以与SV形成共定位的凝\r\n聚体[34]<\/sup>; 而由RIM、RIMBP和ELKS形成的活性区凝\r\n聚体, SV则贴附在其表面[35-36]<\/sup>。因此, 不同的突触前\r\n膜蛋白质凝聚体可以将SV组织到不同亚群中, 从而\r\n定义具有不同功能的SV。我们此前在体外重构了\r\nSV的这两种亚群和类突触小结的多层结构, 揭示了\r\n相分离如何实现SV区室化的原理[36]<\/sup>。以介观尺度的蛋白质凝聚体而非微观尺度的单个蛋白质分子来\r\n理解突触, 为我们提供了新的视角来检视无膜凝聚\r\n体与有膜的SV的相互作用, 以及无膜细胞器对SV运\r\n动与区室化的调节。<\/p>


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3 Pclo相分离介导突触囊泡定向转运<\/strong><\/p>

    Pclo(Piccolo)和Bassoon是脊椎动物特异性的巨\r\n型支架蛋白(Pclo全长超过5 000个氨基酸, Bassoon\r\n近4 000个氨基酸)[37]<\/sup>。此前的超分辨显微成像结果\r\n显示, Pclo呈现细长拉伸的状态, 且一端朝向活性区, \r\n另一端伸向轴突内部的储备池, 整体构象正好使它\r\n成为非常理想的连接储备池和活性区的桥梁[38]<\/sup>。遗\r\n传学上, Pclo与Bassoon的敲除导致总SV数量减少, \r\n贴附在活性区的RRP与穿梭的循环池SV数目都显著降低[39-42]<\/sup>。而突触蛋白只负责储备池的维持, 活\r\n性区的蛋白只参与RRP的形成。Pclo和Bassoon同时对多个SV亚群的影响提示这两种支架蛋白可能协\r\n调SV不同亚群之间的交流。<\/p>

    我们采用体外重构的策略, 纯化了Pclo蛋白的\r\n截短体, 分别从储备池和活性区两方面探究了Pclo\r\n在SV转运中的作用[43]<\/sup>。<\/p>

    一方面 , Pclo可以富集到突触蛋白的凝聚体\r\n当中, 与突触蛋白和小单层囊泡(small unilamellar \r\nvesicle, SUV)形成共定位的凝聚体(图2A)。在钙信\r\n号的刺激下, Pclo通过相分离驱动凝聚体的所有组\r\n分的重新分配(图 2B)。这时 SUV从原来的突触蛋\r\n白中分离, 转而与Pclo形成共定位的凝聚体。这个\r\n过程完全由钙信号诱发, 囊泡的提取效率与Ca2+浓\r\n度呈正相关, 只需要生理浓度的Ca2+[44-45]<\/sup>就可以诱\r\n导囊泡的部分提取 (图 2D)。这一体外发现与在突\r\n触小结中只要少量SV的调动就足以补充RRP相符\r\n合。Ca2+诱导的囊泡重新定位过程是可逆的, 过量\r\nEDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)处理可以使\r\n得凝聚体的所有组分重新共定位在一起(图2C)。从\r\n大鼠脑内纯化得到的SV也有类似的性质(图2E和图\r\n2F): 在Ca2+诱导前, 突触蛋白、SV和Pclo共定位在\r\n均一的凝聚体中; Ca2+刺激后, SV与Pclo共定位在突\r\n触蛋白之外的凝聚体中。考虑到SV自身携带大量蛋白, 我们用胰蛋白酶消化去除SV表面蛋白, 余下\r\n的不含表面蛋白的 SV也同样经历 Ca2+诱导的重定\r\n位(图2G和图2H)。以上结果提示我们: Pclo可以响\r\n应Ca2+, 将SV从储备池中调动和提取出来。<\/p>


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\"zjm-2.png\"/<\/p>

A~C: 突触蛋白、PcloC、SUV在基础情况(A)、Ca2+刺激(B)或EDTA处理(C)下的分布, 虚线方框选中的凝聚体用于放大分析, 斜线所示位置的荧\r\n光强度用来表征凝聚体不同组分的浓度; D: 不同浓度Ca2+诱导的SUV被PcloC提取的情况比较; E、F: 鼠脑纯化的SV被Ca2+依赖的PcloC提取的情\r\n况; G、H: 胰蛋白酶消化后的SV被Ca2+依赖的PcloC提取的情况。Syn: 突触蛋白; ITSN: 交叉蛋白; PcloC: Pclo的C-端截短体。 <\/p>

A-C: synapsin, PcloC, and SUV distribution under basal (A), Ca2+ (B) or EDTA (C) conditions. A dashed box is selected for zoom in, and dash lines are \r\nused to profile fluorescence intensities and concentrations of different components in the condensate; D: SUV extraction by PcloC induced by different \r\nconcentration of Ca2+; E,F: rat brain derived SV extraction by PcloC in a Ca2+-dependent manner; G,H: trypsin digested SV extraction by PcloC in a Ca2+-\r\ndependent manner. Syn: synapsin; ITSN: intersectin; PcloC: C-terminal fragment of Pclo. <\/p>

图2 Ca2+诱导PcloC将囊泡从储备池里提取出来(根据参考文献[43]修改) <\/p>

Fig.2 PcloC extracts SVs from the reserve pool condensates in response to Ca2+ (modified from the reference [43])<\/p>


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    机制上 , Pclo本身含有两个磷脂结合结构\r\n域—C2A和C2B[46-47](图3A和图3B)。其中C2B能\r\n不依赖Ca2+结合脂质, 而C2A只有在Ca2+诱导条件下\r\n才能结合脂质。也就是说, 在基础情况下, Pclo有一\r\n定结合囊泡的能力, 这种能力会随着Ca2+的涌入而放\r\n大。我们进而发现, 在简单体系下, Pclo有与SUV发\r\n生相分离的能力(图3C)。这种能力可以被钙信号放\r\n大, 且高度依赖Pclo与脂质的结合, 如果用中性的磷\r\n脂或者Pclo的突变体阻断Pclo与脂质的结合, Pclo与\r\nSUV的相分离则会被破坏(图3C)。相应地, 这种突变\r\n体也无法再从突触蛋白中提取出SUV(图3D~图3G)。<\/p>

    另一方面 , Pclo直接与多种活性区蛋白(如\r\nRIMBP、 ELKS)相互作用[37,48]<\/sup>, 我们定量剖析了Pclo\r\n与RIMBP或ELKS的直接结合, 并验证了结合的特\r\n异性和选择性(图4A)。如RIMBP通过SH3结构域与\r\nRIM互作[35]<\/sup>, 但是RIMBP有3个SH3结构域, RIM与\r\nPclo分别选择不同的SH3结构域结合, 从而确保它们形成统一的整体。我们解析了Pclo与ELKS复合\r\n物的晶体结构, 这是ELKS这个长的卷曲螺旋(coiled \r\ncoil)蛋白的首个晶体结构, 也从结构上确定了Pclo的\r\n第三段卷曲螺旋结构域是单体而非以前猜测的二聚体。疏水相互作用和静电相互作用共同参与到Pclo\r\n与ELKS复合物的形成与稳定中。<\/p>

    通过与RIMBP、ELKS的直接相互作用, Pclo可\r\n以被特异性地富集到由RIM、RIMBP和ELKS形成\r\n的活性区凝聚体中(图4B)。重要的是, Pclo的引入可\r\n以极大地增强囊泡在活性区表面的贴附(图4C和图\r\n4D), 且Ca2+可以进一步提高囊泡的贴附效率(图4E)。\r\n考虑到Pclo可以从储备池中攫取SV, 已经与Pclo形成共凝聚体的SV还能否被有效传递到活性区？我\r\n们预先准备了Pclo/囊泡凝聚体和活性区凝聚体, 再\r\n将它们混合在一起。通过动态监察, 我们可以清晰\r\n地看到: 一旦两种凝聚体相互接触, Pclo可以迅速进\r\n入到活性区并与活性区组分形成均匀的共凝聚体 , \r\n而囊泡则滞留并富集在活性区表面(图4F), 这契合\r\n了SV栓系在活性区表面的状态。<\/p>

    因此, 钙信号诱导的Pclo与囊泡的相分离可以\r\n将囊泡从一种凝聚体中提取出来, 并将其定向地交\r\n付给另一种凝聚体。我们充分利用体外重组的优势, \r\n在试管中实现了这一过程。这种自下而上的方法可\r\n以使我们清晰了解这一过程的必要条件, 在整个过\r\n程中, 既没有马达蛋白或者细胞骨架的引入, 也没有\r\n额外注入能量。完全靠着蛋白质与囊泡的自组装以\r\n及细胞内第二信使(Ca2+)的驱动, 实现了囊泡的定向\r\n运输。这提示我们, 除了以往熟知的马达蛋白赋能\r\n的运动外, 还有其他囊泡运输方式的存在, 这种以相分离介导囊泡转运的方式对局域的、短距离的囊泡\r\n运输可能尤其重要。相分离除了能指导分子组装外, \r\n还有着广泛的功能应用, 而这些受到细胞信号调控\r\n的动态过程更值得将来深入研究。<\/p>


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4 相分离介导的囊泡运输的普适性<\/strong><\/p>

    至此 , 我们以突触前膜为样板 , 揭示了SV是如何在相分离的介导下从储备池定向转运到活性\r\n区的。这种由相分离驱动的囊泡定向转运很可能\r\n是在细胞内广泛存在的, 比如COPII囊泡在内质网\r\n(endoplasmic reticulum, ER)与内质网–高尔基体中间\r\n体(ER-Golgi intermediate compartment, ERGIC)之间的运输。支架蛋白TFG聚集在ER-ERGIC之间, 可能\r\n参与到COPII囊泡的早期分泌过程[49-52]<\/sup>。通过活细\r\n胞高分辨显微成像, 我们确定了TFG与COPII囊泡形\r\n成共定位的凝聚体, 它们可以一起经历移动、融合、\r\n分裂(图5A)。进一步体外实验也验证了TFG相分离\r\n的倾向以及TFG凝聚体对囊泡的富集能力(图5B~图5E)。此外, 光电联用技术使我们直接观察到了TFG\r\n凝聚体里的COPII囊泡(图5F)。与SV的定向转运类\r\n似, COPII囊泡随TFG凝聚体的运输也不依赖于细胞\r\n骨架(图5G)。因此, 由相分离介导的短距离囊泡运\r\n输可能具有比较普适的意义。<\/p>


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\"zjm-3.png\"/<\/p>

A: Pclo的结构域; B: Pclo与突触蛋白和脂质等的相互作用网络; C: Pclo与SUV发生特异性相分离; D~E: 2DAC2A(Pclo的C2A结构域突变体, 同时\r\n含 D4651A和D4657A双突变)不能从储备池中提取SUV; F~G: 2KEC2B(PcloC的C2B结构域突变体, 同时含K4992E和K4994E双突变)在Ca2+条件\r\n下只能从储备池中提取少量SUV, 左下角为代表性凝聚体的3倍放大图。 Syn: 突触蛋白; ITSN: 交叉蛋白。 <\/p>

A: domain organization of Pclo; B: interaction network among Pclo, synapsin, and lipid, etc.; C: Pclo undergoes phase separation with SUV in a specific \r\nand regulated manner; D-E: 2DAC2A (PcloC with C2A domain mutations D4651A and D4657A) fails to extract SUV from the reserve pool condensate; \r\nF-G: 2KEC2B (PcloC with C2B mutations K4992E and K4994E) slightly extracts SUV from the reserve pool condensate after Ca2+ stimulation, image at \r\nthe left corner shows a representative zoom in condensate with 3× magnification. Syn: synapsin; ITSN: intersectin. <\/p>

图3 Pclo与带负电囊泡发生Ca2+调控的相分离(根据参考文献[43]修改) <\/p>

Fig.3 Pclo undergoes phase separation with negatively charged vesicles in a Ca2+-regulated manner \r\n(modified from the reference [43])<\/p>


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\"zjm-4新.png\"/<\/p>

A: Pclo与其他活性区主要支架蛋白的相互作用网络; B: Pclo被特异性富集到活性区凝聚体中; C: 囊泡贴附在活性区凝聚体表面; D: Pclo促进囊\r\n泡在活性区凝聚体表面的贴附; E: Ca2+进一步增强囊泡在活性区凝聚体表面的贴附; F: 预先形成的Pclo/SUV凝聚体传递SUV到活性区凝聚体表面。 <\/p>

A: interaction network among Pclo and other active zone scaffold proteins; B: Pclo can be specifically enriched into the active zone condensate; C: \r\nvesicle coating on the active zone condensate; D: Pclo promotes vesicle tethering on the active zone condensate; E: Ca2+ further enhances vesicle tether\u0002ing on the active zone condensate; F: preformed Pclo/SUV condensates deposit SUVs to the surface of the active zone condensate. <\/p>

 图4 Pclo促进囊泡在活性区凝聚体表面的栓系(根据参考文献[43]修改) <\/p>

Fig.4 Pclo promotes vesicle tethering on the surface of the active zone condensate (modified from the reference [43])<\/p>


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\"zjm-5.png\"/<\/p>

A: TFG与COPII囊泡的标志物SEC23A在COS7细胞里共定位, 左下角为4倍放大图; B: 同源重组的TFG在体外发生相分离(3% PEG8000诱导); C: \r\nTFG凝聚体发生融合; D: TFG凝聚体富集SUV; E: TFG在有或无SUV情况下的荧光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP); F: \r\n光电联用显微镜下TFG与COPII囊泡的共定位, 下方图片为上方红色虚线框放大图, 黄色箭头所指为COPII囊泡; G: 微丝与微管的解聚都不影响\r\nTFG凝聚体的形成与COPII囊泡的共定位, 以及它们的动态特征, 白色箭头所指为代表性凝聚体。\r\nA: TFG and COPII vesicle marker SEC23A form colocalized puncta in COS7 cells, the left corner shows a 4× zoom in image; B: recombinant TFG un\u0002dergoes phase separation in the presence of 3% PEG8000; C: TFG droplets fusion in vitro; D: TFG droplets enrich SUV; E: FRAP of TFG in the pres\u0002ence or absence of SUV; F: CLEM (correlative light-electron microscopy) imaging showing colocalization of COPII vesicles within TFG condensates, \r\nthe lower images are magnified from the red dash lines selected regions in the upper panels, and the yellow arrows indicate COPII vesicles; G: disas\u0002sembly of actin filament or microtubule does not affect TFG condensation and clustering of COPII vesicles, as well as their mobilities, white arrows \r\nindicate representative condensates. 
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 图5 TFG凝聚体介导COPII囊泡的组织与运输(根据参考文献[43]修改) <\/p>

Fig.5 TFG condensates mediate COPII vesicles organization and trafficking (modified from the reference [43])<\/p>


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5 总结与展望<\/strong><\/p>

    我们通过突触前膜SV从储备池到活性区的定\r\n向运输和动物细胞COPII囊泡的早期分泌两个案例, \r\n揭示了相分离对短距离囊泡运输的作用(图6)。与经典的马达蛋白和细胞骨架介导的运输方式相比, 相\r\n分离的方式同样具有方向性, 且受到细胞信号(如钙信号)的调控, 但不依赖于更加苛刻的其他多种分子。\r\n需要指出的是, 相分离介导的定向转运有其适用范\r\n围, 可能对短距离的运输尤为重要; 而对长距离的运\r\n输, 马达蛋白与细胞骨架的组合仍然起到主导作用。<\/p>

    对于相分离介导的短距离运输, 一个关键的问\r\n题是方向性的决定。以SV为例, Pclo与活性区相较\r\n于储备池有着更高的结合强度 , 这决定了 SV的流\r\n向。而关于COPII囊泡在ER与ERGIC之间的转运, \r\n这里只是初步展示了TFG与COPII囊泡的协同运动, \r\n至于TFG在ER和ERGIC中分别与哪些分子相互作\r\n用, 是否有着结合强度的差异, 是否受到以及受到何\r\n种细胞信号的调控, 这些都是将来需要解决的问题。<\/p>

    此外, 细胞里还有很多短距离囊泡运输的情况, \r\n比如COPI(coat protein complex I)囊泡在高尔基堆\r\n(Golgi stack)之间的转运等。一类被称作高尔基体蛋\r\n白(golgin)的支架蛋白也跟Pclo具有相似之处, 它们都具有长长的卷曲螺旋结构, 也都具有捕捉囊\r\n泡的能力。因此, 将来一个可能的方向是探究高尔\r\n基体蛋白是否以及如何参与到相分离介导的高尔基\r\n堆间的囊泡运输中, 以及相分离在更加广阔的细胞\r\n生物学过程中的应用。<\/p>


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—致谢<\/strong> <\/p>

    我们衷心感谢中国科学院生物物理研究所张宏院士课题组及清华大学生命科学学院葛亮教授课\r\n题组在此课题研究过程中的帮助。<\/p>


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图6 相分离介导短距离囊泡运输的模型(根据参考文献[43]修改) 
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Fig.6 Short-distance vesicle transport via phase separation (modified from the reference [43])<\/p>


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参考文献 (References)<\/strong> <\/p>

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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/24-05-28-10-26-23-255.jpg","cshort":"

张明杰, 博士生导师, 讲席教授, 南方科技大学生命科学学院创院院长, 中国科学院院士, 香港科学院创院院士。实验室长期从事神经信号转导中重要蛋白质复\r\n合体的生物化学和结构学研究, 以及神经细胞极性产生和维持的机制研究。近年在突触相分离领域做出一系列开创性成果。研究论文在Science<\/em>、Cell<\/em>、Mol\r\nCell<\/em>、Neuron<\/em>、Nat Neurosci<\/em>、Cell Res<\/em>等期刊上发表。曾荣获香港裘槎基金会\r\n优秀学者奖、国家自然科学奖二等奖、何梁何利基金科学与技术奖、谈家桢生\r\n命科学成就奖。<\/p>","cshort2":"


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张明杰, 博士生导师, 讲席教授, 南方科技大学生命科学学院创院院长, 中国科学\r\n院院士, 香港科学院创院院士。实验室长期从事神经信号转导中重要蛋白质复\r\n合体的生物化学和结构学研究, 以及神经细胞极性产生和维持的机制研究。近\r\n年在突触相分离领域做出一系列开创性成果。研究论文在Science<\/em>、Cell<\/em>、Mol\r\nCell<\/em>、Neuro<\/em>n<\/em>、Nat Neurosci<\/em>、Cell Res<\/em>等期刊上发表。曾荣获香港裘槎基金会\r\n优秀学者奖、国家自然科学奖二等奖、何梁何利基金科学与技术奖、谈家桢生\r\n命科学成就奖。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"相分离介导细胞内短距离囊泡运输","listseq":111,"seqno":"111","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"24-05-28-10-26-23-255"},{"caddress1":"(多细胞体系结构与功能重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)","cauthor":"童欣媛 薛云 张宁霞 季红斌*","cintpic":"Upload/qianyan/24-04-08-14-13-59-053.pdf","clicktime":482,"clong1":"

肺腺鳞癌转分化驱动KRAS靶向治疗耐药<\/span><\/p>

童欣媛 薛云 张宁霞 季红斌*<\/span><\/p>

(多细胞体系结构与功能重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)<\/span><\/p>


<\/p>

【摘要】KRASG12C抑制剂(Adagrasib和Sotorasib)在靶向治疗KRASG12C<\/em>突变的肺癌中已显示出较好的临床效果, 然而耐药现象普遍存在。因此, 探究KRAS抑制剂耐药机制极为重要。丝氨酸–苏氨酸激酶11(STK11)/LKB1<\/em>通常在人肺腺癌中与KRAS<\/em>共突变, KRAS/LKB1<\/em>突变亚群对标准治疗响应较差。该研究发现治疗前已富集鳞癌特征的KRASG12C肺腺癌患者具有较短的Adagrasib治疗持续时间, 且这一相关性在STK11/LKB1<\/em>共突变的亚群中尤为显著。通过建立KRAS抑制剂耐药小鼠模型和腺鳞癌转分化类器官模型, 该研究证明KRAS/LKB1<\/em>突变的肿瘤细胞可以通过腺鳞癌转分化驱动KRAS抑制剂耐药。机制上, Elf5-ΔNp63转录轴可以调控腺鳞癌转分化过程并影响肿瘤细胞对KRAS抑制剂的药物响应。值得注意的是, 在腺鳞癌转分化过渡状态中高表达的KRT6A<\/em>基因与较差的Adagrasib响应显著相关。该研究揭示了肺腺鳞癌转分化是驱动KRAS抑制剂耐药的重要机制, 且KRT6A<\/em>有望成为新的生物学标志物预测患者对KRAS靶向治疗用药的响应。<\/p>


<\/p>

【关键词】腺鳞癌转分化; KRAS抑制剂; LKB1; KRT6A<\/p>


<\/p>

Adeno-to-Squamous Transition Leads to Resistance to KRAS Inhibitor in Lung Cancer<\/p>

TONG Xinyuan, XUE Yun, ZHANG Ningxia, JI Hongbin*<\/span><\/p>


<\/p>

(Key Laboratory of Multi-Cell Systems, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Center for Excellence in Molecular Cell Science, University of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)<\/span><\/p>


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【Abstract】 KRASG12C inhibitors, including Adagrasib and Sotorasib, have shown clinical efficacy in targeting KRASG12C-mutated lung cancers. However, most patients develop resistance to these therapies, and it is important to explore the mechanism of KRAS inhibitor resistance. STK11 (serine/threonine kinase 11)/LKB1 is frequently co-mutated with KRAS in non-small cell lung cancer. Loss of tumor suppressor gene LKB1 decreases sensitivity to drug treatment. In KRAS/LKB1 mutant lung adenocarcinoma (ADC) patients treated with Adagrasib monotherapy (KRYSTAL-1), enrichment for a squamous gene signature in the pre-treatment biopsy is significantly correlated with shorter treatment duration. Furthermore, integrative analysis of KCL (KRASLSL-G12C/+;Lkb1flox/flox) mouse model and KDL (KrasLSL-G12D/+;Lkb1flox/flox) organoid model of lung cancer demonstrates that AST (adeno-to-squamous transition) is a prominent mechanism of acquired resistance to KRAS inhibition. The transcriptomic and epigenomic analyses further reveal that Elf5-ΔNp63 axis regulates AST and modulates response to KRAS inhibition. Importantly, high expression of KRT6A in high-plasticity cell state during AST is associated with poor Adagrasib response. Taken together, the study demonstrates that AST is one of the mechanisms of KRAS inhibitor resistance and provides potential biomarkers for KRAS-targeted therapies in lung cancer.<\/p>


<\/p>

【Keywords】AST (adeno-to-squamous transition); KRAS inhibitor; LKB1; KRT6A<\/p>


<\/p>

1 肺腺鳞癌转分化与靶向治疗耐药的相关性<\/p>

肺癌是全世界致死率极高的癌症之一, 其亚型分类复杂。传统的肺癌治疗方式为手术治疗、放射疗法以及化学疗法。随着精准医疗概念的出现, 针对不同患者的不同基因突变谱, 分子靶向治疗也成为较为普遍的治疗方式。中国肺癌患者中, 表皮生长因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变较为普遍, 针对EGFR突变的分子靶向治疗药物已发展到第四代。虽然靶向药物临床治疗取得了一定的疗效, 但仍有较多病例报道患者在治疗后出现耐药。在第三代靶向EGFR突变药物奥西替尼耐药后, \r\n7%~9%的EGFR突变肺腺癌患者在二次活检时表现出肺鳞癌的病理学特征[1], 提示靶向治疗耐药过程中存在肺腺鳞癌转分化现象。肺腺癌及肺鳞癌是肺癌中占比较高的亚型, 它们具有不同的病理特征, \r\n对于药物响应也大不相同。在肺癌的不同亚型之间的转变可能是肿瘤细胞逃脱药物治疗的途径之\r\n一, 根据肺癌谱系的变化及时调整治疗方案极为重要。<\/p>


<\/p>

KRAS是肺腺癌中除 EGFR以外最常见的致癌基因之一, 长期以来被认为是不可成药靶点, 而最近开发的 KRASG12C抑制剂 (Sotorasib和 Adagra\u0002sib)在肺癌、胰腺癌和结直肠癌中显示出较好的治疗效果 [2-5]。此外, 靶向KRASG12D突变的抑制剂MRTX1133也正处于临床试验之中[6]。虽然KRAS靶向治疗展示出一定的临床前景, 但随着临床试验的深入开展, 耐药性的问题也随之出现。在KRAS抑制剂Adagrasib的KRYSTAL-1临床试验中, Andrew J AGUIRRE团队[7]发现9例肺腺癌耐药患者中就有2例患者的再活检样本表现出肺鳞癌的病理学特征 , 提示肺腺鳞癌转分化(adeno-to-squamous transition, AST)可能与KRAS抑制剂耐药具有潜在关联。但是, 肺腺鳞癌转分化是否驱动了KRAS抑制剂耐药还有待深入研究。<\/p>


<\/p>

2 腺鳞癌特征与Adagrasib药物响应相关性<\/p>

KRYSTAL-1是一项 I/II期临床研究 , 116名KRASG12C突变非小细胞肺癌患者参与该临床试验并接受了Adagrasib单药治疗。为了探究KRASG12C突变肺腺癌样本中腺癌或鳞癌特征与药物响应之间的关系, 我们分析了这项研究中68例患者治疗前活检样本的全转录组数据以及这些患者对应的Adagrasib治疗持续时间、无进展生存期和总生存期信息。我们对每个患者的肿瘤进行了腺癌和鳞癌相关基因以及鳞癌特征通路的评分, 并评估了与临床变量的相关性。患者样本中鳞癌相关基因的高表达与患者接受Adagrasib治疗的持续时间呈负相关, 而腺癌相关基因高表达则与治疗持续时间呈正相关。值得注意的是, 我们观察到在高表达鳞癌特征的患者队列中Adagrasib治疗持续时间明显缩短。考虑到STK11/LKB1突变经常与肺腺癌中的KRASG12C突变同时发生, 我们研究了鳞癌特征与STK11/LKB1突变患者对药物响应之间的关系。我们发现, 只有在STK11/LKB1突变组中, 富集鳞癌特征的患者具有显著缩短的Adagrasib治疗持续时间。这些数据表明, 相比于STK11/LKB1野生型的肺腺癌患者, 高表达鳞癌特征的STK11/LKB1突变型肺腺癌患者接受Adagrasib单药治疗的效果更差。<\/p>


<\/p>

3 KRAS抑制剂耐药小鼠模型和腺鳞癌转分化类器官模型的建立<\/p>

为了进一步研究腺鳞癌转分化与 KRAS抑制剂耐药相关性, 我们结合相关临床数据, 利用小鼠模型、类器官模型及多组学测序技术进行深入分析(图1)。基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse models, GEMMs)可以很好地模拟临床肺癌的发生发展[8]。基于KRASG12C突变, 我们建立了两个肺癌转基因小鼠模型: KRASLSL-G12C/+;Trp53flox/flox(KCP)和KRASLSL-G12C/+;Lkb1flox/flox(KCL)来深入研究KRAS抑制剂耐药与肺腺鳞癌转分化的关系。我们用Adagrasib对KCL和KCP小鼠进行药物处理, 发现在处理初期肿瘤均明显消退, 而经过长期治疗后残留肿瘤产生耐药并复发。有意思的是, 只有在Adagrasib耐药后的KCL肿瘤中, 我们观察到鳞状病理特征和鳞癌标志物ΔNp63(p40)的表达。而不管是KCL小鼠模型还是KCP小鼠模型, 在没有药物干预的情况下肺肿瘤均显示腺癌病理特征。这些研究结果提示LKB1突变而非P53突变可激活肿瘤表型可塑性, 而腺鳞癌转分化是Adagrasib获得性耐药的重要机制。<\/p>


<\/p>

除了 Adagrasib等 KRASG12C抑制剂外 , 针对KRASG12D突变的MRTX1133目前也进入临床试验。KRASG12D在肺癌中是除KRASG12C外常见的KRAS基因突变之一。KrasLSL-G12D/+;Lkb1flox/flox(KDL)小鼠模型是已建立的成熟的肺腺鳞癌转分化模型[9-10]。考虑到小鼠体内模型不利于我们实时观察肿瘤变化情况 , 我们利用类器官体系在体外进行建模。结果显示一半比例的肺腺癌类器官在体外培养过程中从中空形态向实心形态转变, 并伴随着ΔNp63的表达水平增加。不同于原位肿瘤显示腺癌特征, 这些类器官原位注射回肺部的移植瘤显示出鳞状细胞特征, 证明了类器官模型中腺鳞癌转分化现象的产生。另一半肺腺癌类器官则在长期培养过程中保留了中空形态, 相应的同种异体移植瘤显示了腺癌病理特征。基于以上结果, 我们建立了腺鳞癌转分化类器官模型, 并观察到在具有同样的基因背景(Kras/Lkb1)下, 存在具有/不具有转分化潜能的肺腺癌亚型, 我们将其分别称为可塑型类器官(plastic organoids)和稳定型类器官(stable organoids)。这两类类器官对KRAS\u0002G12D抑制剂MRTX1133药物响应有所差异, 相比于稳定型类器官, 可塑型类器官对MRTX1133药物处理不敏感。我们通过建立耐药小鼠模型和类器官模型证明了Kras/Lkb1突变的肺腺癌具有腺鳞癌转分化的潜能, 并且腺鳞癌转分化是KRAS抑制剂耐药的重要驱动力。<\/p>


<\/p>

\"JHB-1.jpg\"/<\/p>

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卡通图展示整合临床数据、小鼠及类器官模型及多组学测序策略进行腺鳞癌转分化在KRAS抑制剂耐药过程中的相关机制探究。<\/span><\/p>

The cartoon showed the working model of the integrated analyses of the clinical data of KRYSTAL-1 trial, the phenotype of Adagrasib-resistant KCL GEMMs, the sequencing data of AST KDL organoid models to explore the potential mechanism of AST during KRAS inhibitors resistance.<\/span><\/p>

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图1 腺鳞癌转分化在KRAS抑制剂耐药过程中的相关研究的图解摘要(根据参考文献[11]修改)<\/span><\/p>

Fig.1 Schematic illustration of studying the role of AST during KRAS inhibitor resistance (modified from reference [11])<\/span><\/p>


<\/p>

4 谱系转录因子调控肺腺鳞癌转分化介导的KRAS抑制剂耐药<\/span><\/p>

在前期工作中, 我们已研究的腺鳞癌转分化机制中重要的调控因素包括: (1) 胞外基质重塑; (2) 活性氧水平(reactive oxygen species; ROS); (3) 关键基因变化(Yes-associated protein, YAP)等[9,12-15]。但腺鳞癌转分化如何调控肿瘤细胞对KRAS靶向药物响应的分子机制尚不清楚。为了明确腺鳞癌转分化的潜在机制, 我们收集了连续代数的可塑型类器官样本并进行了转录组测序(RNA-seq)和转座酶可及染色质测序(ATAC-seq)。我们发现Elf5在腺鳞癌转分化过程的早期代数中特异表达。ELF5可结合在 NKX2-1的启动子区域并正向调控 NKX2-1的RNA和蛋白水平表达, 其过表达还可增加可塑型类器官对 MRTX1133药物响应的敏感性。在 KRYS\u0002TAL-1临床数据中 , ELF5高表达与较长的治疗持续时间呈正相关。这些数据表明 , ELF5通过促进NKX2-1的表达来维持腺癌谱系的稳定及其对药物的敏感性, 对于腺鳞癌转分化过程具有一定的抑制作用(图2)。<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

\"JHB-2.jpg\"/<\/span><\/p>


<\/p>

卡通图展示在腺癌状态下, Elf5促进Nkx2-1表达同时抑制Vezf1表达, 并促进肿瘤细胞对KRAS抑制剂的响应。在过渡状态下, Elf5表达水平下降, 而Vezf1表达上调, Vezf1通过C40增强子促进ΔNp63表达同时抑制Nkx2-1表达。在鳞癌状态下, C40增强子进一步促进ΔNp63表达从而促进KRT家族成员表达上调。ΔNp63表达增加会促进腺鳞癌转分化、Krt6a表达及对KRAS抑制剂的耐受。<\/span><\/p>

In ADC state, Elf5 promoted the expression of Nkx2-1 and inhibited the expression of Vezf1. Meanwhile, Elf5 promoted the sensitivity of tumor cells to KRAS inhibitor treatment. In intermediate state, the expression of Elf5 was downregulated and the expression of Vezf1 was upregulated. Vezf1 promoted C40 enhancer mediated upregulation of ΔNp63. In SCC state, C40 enhancer was important for promoting the expression of ΔNp63 and Krt5/6/14. The upregulation of ΔNp63 promoted AST process, the expression of Krt6a and KRAS inhibitor resistance.<\/span><\/p>

图2 Elf5-ΔNp63转录轴调控腺鳞癌转分化及对KRAS抑制剂药物响应(根据参考文献[11]修改)<\/span><\/p>

Fig.2 Elf5-ΔNp63 axis regulates AST and response to KRAS inhibitor (modified from reference [11])<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

我们进一步分析潜在的促进腺鳞癌转分化的转录因子, 结果显示ΔNp63的表达及其Motif富集程度在可塑型类器官中特异性增加, 表明ΔNp63可能是腺鳞癌转分化的驱动基因。我们在早期代数的KDL类器官中过表达ΔNp63, 结果显示实心形态的类器官的比例增加了20%~60%。同时ΔNp63的过表达促进了肿瘤细胞对MRTX1133药物耐受。Trp63基因区域在转分化过程中存在表观重塑, 相比于早期类器官或腺癌样本, 晚期类器官或鳞癌样本中C40增强子的染色质可及性和H3K27ac信号增加。在功能上, 我们发现C40敲除导致了实心形态类器官比例的减少和ΔNp63表达水平的降低。值得注意的是, 我们发现 C40敲除可以部分恢复可塑型类器官对MRTX1133的敏感性, 而敲除另一个增强子C15则不影响其对MRTX1133的敏感性。在人的肺腺癌细胞系NCI-H1373中过表达ΔNp63也促进了肿瘤细胞对KRAS抑制剂的耐药。值得注意的是, ΔNp63的激活引起了KRAS信号通路富集程度下降, 表明在腺鳞癌转分化过程中ΔNp63可导致细胞不再依赖KRAS信号通路, 从而对KRAS抑制剂不响应。<\/span><\/p>


<\/p>

由于Elf5可以维持腺癌谱系基因表达, 我们推测Elf5可能作为上游转录因子抑制ΔNp63表达。我们在可塑型类器官中过表达了Elf5, 结果显示ΔNp63表达水平下降。此外在腺鳞癌转分化过程中Elf5的表达与ΔNp63呈负相关。我们构建了Trp63、Nkx2-1和Elf5的基因调控网络, 结果表明Elf5和ΔNp63之间并无直接调控关系, 但我们在C40增强子区域发现了Elf5下游靶点Vezf1的Motif。为了进一步探索Elf5如何调控ΔNp63表达, 我们在C40敲除的类器官中过表达Elf5, 结果表明ΔNp63的表达和类器官形态没有明显变化, 提示Elf5可能通过与C40结合从而调控ΔNp63的表达。Vezf1结合在C40增强子区域, Elf5过表达导致Vezf1的表达水平减少, 而敲除Elf5则促进了Vezf1的表达, 证明了Elf5是Vezf1的抑制因子。进一步实验显示Vezf1敲除导致ΔNp63表达下降及NKX2-1表达增加。这些结果与基因调控网络结果一致, 证明在腺鳞癌转分化过程中, Elf5通过调控Vezf1来调节ΔNp63的表达, 并影响肿瘤细胞对KRAS抑制剂的响应(图2)。<\/p>


<\/p>

5 多组学分析确定腺鳞癌转分化介导耐药的生物学标志物<\/p>

借助单细胞测序技术(scRNA-seq)和基因模块分析, 我们在可塑型类器官中定义了高表达Sftpb的肺泡细胞2型(AT2)亚群, 高表达Krt5和Krt14的鳞癌亚群, 以及同时表达不同细胞类型特征的高可塑性亚群(HPCS)。通过RNA velocity算法分析, 我们证明了AT2亚群可以转变为高可塑性亚群, 最终向鳞状细胞转变(图2)。<\/p>


<\/p>

为了进一步鉴定腺鳞癌转分化驱动 KRAS抑制剂耐药的重要的标记基因 , 我们在 HPCS亚群、ΔNp63调控基因集和Adagrasib耐药肿瘤的转录组数据中挖掘共同表达上调的重叠基因。我们发现了6个重叠基因, 包括Krt6a、Aqp3、Wnt4等, 我们将这6个重叠基因定义为腺鳞癌转分化特征通路。在KRYSTAL-1数据中, 我们观察到高表达腺鳞癌转分化特征的肿瘤患者往往具有较短的治疗持续时间。6个重叠基因中KRT6A的表达与治疗持续时间的负相关最为显著。我们进一步根据KRT6A的表达高低对患者进行分类, 观察到KRT6A高表达患者的总生存率明显低于KRT6A低表达患者。这些数据提示了KRT6A是一个广谱的腺鳞癌转分化介导KRAS耐药的生物学标志物, 这一发现将有助于临床上筛选患者进行精准治疗。<\/p>


<\/p>

6 总结与展望<\/p>

腺鳞癌转分化是分子靶向治疗耐药的潜在机制之一[16]。然而, 腺鳞癌转分化在KRAS抑制剂耐药中的作用尚不清楚。KRAS基因存在多种突变, 不同突变亚型可激活不同程度的下游信号并影响肿瘤表型。相比于中国人群, KRAS基因突变在欧美人群中比例较高, 意味着在欧美有更大的几率招募患者(包括KRAS/LKB1共突变亚群)并追踪患者对KRAS抑制剂的响应。9例靶向耐药的KRASG12C患者中2例肺腺鳞癌转分化患者的出现促使我们探索腺鳞癌转分化是否直接驱动KRAS抑制剂耐药。我们分析KRASG12C突变患者的临床数据, 发现表达鳞癌特征的肺腺癌患者往往具有较短的药物持续治疗时间。Adagrasib耐药的小鼠模型和腺鳞癌转分化类器官模型研究结果则进一步证明具有腺鳞癌转分化潜能的肺腺癌对KRAS抑制剂有一定的耐药性。通过转录组学和表观组学分析, 我们发现了Elf5-ΔNp63转录轴在腺鳞癌转分化及KRAS耐药过程中的调控作用。通过多组学多数据整合分析, 我们也首次鉴定出了与腺鳞癌转分化和KRAS抑制剂耐药相关的生物学标志物。<\/p>


<\/p>

临床前和临床研究表明, 肿瘤细胞的可塑性和肿瘤内部基因水平的异质性是药物响应差异的主要原因。STK11/LKB1突变使肺腺癌具有一定的表型可塑性, 部分肿瘤可通过腺鳞癌转分化逃脱药物治疗。而开发针对KRAS/LKB1突变腺癌中高表达鳞癌特征的亚型的新型联合治疗策略, 将有助于最大限度地发挥KRAS抑制剂的疗效。筛选出新的腺鳞癌转分化相关的生物学标志物也将有助于临床治疗过程中患者的筛选并推进精准治疗。<\/p>


<\/p>

参考文献 (References)<\/span><\/p>

[1] <\/span>SCHOENFELD A J, CHAN J M, KUBOTA D, et al. Tumor anal\u0002yses reveal squamous transformation and off-target alterations as \r\nearly resistance mechanisms to first-line osimertinib in EGFR\u0002mutant lung cancer [J]. Clin Cancer Res, 2020, 26(11): 2654-63. <\/p>

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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/24-04-08-14-13-59-053.jpg","cshort":"

季红斌, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。国家杰出青年科学基金获得者, 国家重点研发计划项目首席科学家。长期从事肺癌发病分子机理研究, 在肺癌驱动基因的鉴定、肺腺鳞癌转分化及小细胞肺癌化疗耐药等研究领域取得了国际前沿的成果。在 Nature、Cell、Cancer Cell、Nature Genet、Nat\r\nCancer 、J Clin Oncol<\/em>等期刊发表论文180余篇, 被引19 000余次。<\/p>","cshort2":"
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季红斌, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。国家杰出青年科学基金获得者, 国家重点研发计划项目首席科学家。长期从事肺癌发病分子机理研究, 在肺癌驱动基因的鉴定、肺腺鳞癌转分化及小细胞肺癌化疗耐药等研究领域取得了国际前沿的成果。在 Nature、Cell、Cancer Cell、Nature Genet、Nat\r\nCancer 、J Clin Oncol<\/em>等期刊发表论文180余篇, 被引19 000余次。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"肺腺鳞癌转分化驱动KRAS靶向治疗耐药","listseq":106,"seqno":"106","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"24-04-08-15-01-51-081"},{"caddress1":"(中国科学院武汉病毒研究所, 病毒学国家重点实验室, 武汉 430207)","cauthor":"徐智圣 王延轶*","cintpic":"Upload/qianyan/24-03-05-15-15-39-992.pdf","clicktime":1053,"clong1":"

克里米亚–刚果出血热病毒受体LDLR的发现<\/span><\/p>

徐智圣 王延轶*<\/span><\/p>

(中国科学院武汉病毒研究所, 病毒学国家重点实验室, 武汉 430207)<\/span><\/p>


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【摘要】克里米亚–刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)是一种布尼亚病毒目内罗病毒科正内罗病毒属、蜱虫传播的负链RNA病毒, 能引起严重的出血热, 病死率约为30%。目前临床上尚无针对CCHFV的疫苗和抗病毒药物, 因此, 各国普遍将CCHFV列为生物安全风险等级最高的病原之一, 世界卫生组织也连续多年将其列入优先研究病原名录。然而, 自1956年CCHFV被发现以来, 其受体一直未被鉴定。该研究团队根据CCHFV感染细胞的特点进行分析,通过筛选发现低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)是CCHFV的一个入侵受体。该受体的发现, 对CCHFV感染致病机制的理解和防控策略的研发具有重要的科学意义和应用价值。<\/p>


<\/p>

【关键词】 CCHFV; LDLR; 受体<\/p>


<\/p>

Identification of LDLR as an Entry Receptor of CCHFV<\/p>

XU Zhisheng, WANG Yanyi*<\/span><\/p>

(State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430207, China)<\/span><\/p>


<\/p>

【Abstract】 CCHFV (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), a member of the Orthonairovirus genus inthe Nairoviridae family of the Bunyavirales order, is a tick-borne RNA virus that causes severe hemorrhagic disease in humans, with fatality rates around 30%. It has been shortlisted as a priority pathogen according to the WHOR&D Blueprint. So far, there is no effective antivirals or vaccines for CCHFV infections. For more than 60 years since the discovery of CCHFV, the cellular entry receptor(s) have not yet been identified. In this study, WANG andcolleagues have identified LDLR (low density lipoprotein receptor) as an entry receptor for CCHFV. This study willnot only shed light on the mechanism of CCHFV infection, but also provide antiviral targets and potential therapeutic strategies against CCHFV.<\/p>


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【Keywords】CCHFV; LDLR; receptor<\/p>


<\/p>

1 克里米亚–刚果出血热病毒<\/p>

克里米亚–刚果出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagic fever virus, CCHFV)是一种蜱虫传播病毒, 广泛分布在亚洲、非洲、欧洲等地区的30多个国家[1]。CCHFV于1956年在刚果被首次发现, 在1969年被确认为引起克里米亚–刚果出血热的病原体[2]。在我国, CCHFV最早在新疆被发现, 因此, 该病毒在我国也被称为新疆出血热病毒 [3]。CCHFV感染可以引起出血热疾病 , 临床主要表现为头痛、发热、呕吐、出血、休克等症状 , 严重时可导致死亡 , 病死率约为 30%[4-5]。目前临床上尚无预防CCHFV的疫苗以及针对CCHFV的抗病毒药物, 因此, CCHFV被很多国家列为生物安全风险等级最高的病原之一, 也连续多年被世界卫生组织列入优先研究病原名录[6]。<\/p>


<\/p>

CCHFV是布尼亚病毒目(Bunyavirales)内罗病毒科(Nairoviridae)正内罗病毒属(Orthonairovirus)的成员, 其病毒粒子呈球形, 直径大约为80~100 nm。CCHFV的基因组为单股负链RNA, 含有L、M和S三个片段, 分别编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶L蛋白、包膜糖蛋白前体(glycoprotein precursor, GPC)和核衣壳蛋白(nucleoprotein, NP)[5,7]。病毒的NP蛋白能结合病毒基因组, 与L蛋白组成核糖核蛋白复合体, 参与病毒基因组的复制和病毒基因的转录。病毒的GPC在细胞的内质网和高尔基体上被合成, 进一步被加工为病毒包膜蛋白Gn、Gc和其他一些非结构蛋白[8-10]。Gn与Gc形成异源二聚体, 构成病毒表面的刺突, 介导病毒的入侵[7]。<\/p>


<\/p>

CCHFV具有较广的感染谱, 在体外和体内可以感染多种细胞[11]。CCHFV与未知的细胞受体结合后,以网格蛋白介导的内吞途径进入宿主细胞, 随后被依次转运到早期内吞体(early endosomes, EEs)和多囊泡体内(multivesicular bodies, MVBs), 并在MVBs内发生膜融合[12-14]。在这个过程中, 定位于EE上的小GTPase Rab5和内吞体分选转运复合物(endosomalsorting complex required for transport, ESCRT)起重要作用。此外, 有研究发现Gc的单抗具有能够中和病毒感染的能力, 提示Gc可能负责病毒与细胞受体的结合[15-17]。然而, CCHFV的细胞受体一直未被发现。因此, 鉴定CCHFV的入侵受体是目前亟待解决的关键科学问题。<\/p>


<\/p>

2 LDLR是CCHFV入侵细胞的受体<\/p>

鉴定CCHFV的受体是CCHFV研究领域的一个难点。此前有研究人员将体外表达的病毒包膜蛋白 Gc和 Gn与细胞裂解液进行孵育, 通过免疫共沉淀实验和质谱技术鉴定出了可以与 Gc互作的蛋白Nucleolin[18], 但目前仍不清楚Nucleolin在CCHFV感染过程是否发挥功能。此外, 也有研究人员利用水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)假病毒包装系统构建出CCHFV假病毒, 并发现DC-SIGN能够促进CCHFV假病毒的感染, 提示DC-SIGN可能是一个潜在的CCHFV的受体[19]。然而, DC-SIGN在CCHFV活病毒感染过程中的功能, 未被进一步确定。另外, 考虑到CCHFV广泛的嗜性、DC-SIGN的特异性表达谱以及DC-SIGN可以非特异性结合病原微生物表面的糖链, DC-SIGN作为CCHFV的入侵受体还有待进一步验证。<\/p>


<\/p>

我们团队前期尝试通过表达克隆的方法进行筛选CCHFV的受体。我们在细胞中过量表达膜蛋白cDNA克隆, 利用基于VSV假病毒包装系统包装出来的能表达GFP的CCHFV假病毒(VSV-∆G/GFPGPCCCHFV)进行感染, 以期筛选得到影响CCHFV入侵的候选蛋白或受体。遗憾的是, 我们未能得到功能显著的候选分子。随后, 我们检测了一些CCHFV的中和抗体对CCHFV假病毒和活病毒的中和效果, 发现某些中和抗体对CCHFV假病毒和活病毒感染的抑制效果存在差异, 提示CCHFV假病毒和活病毒的包膜蛋白的构象可能存在差异。这些结果促使我们利用CCHFV活病毒开展后续的研究。<\/p>


<\/p>

在寻找受体的研究过程中, 我们关注到CCHFV感染途径和特性。已有的研究报道, 在极化的上皮细胞如 MDCK-1等细胞中 , CCHFV主要是通过细胞基底部进行感染的[20-21]。而有研究报道LDLR在MDCK-1细胞基底部的表达水平显著高于顶端部分[22]。此外, VSV也被报道主要是从极化细胞的基底部进行感染[23-24], 而LDLR及其家族蛋白被鉴定为VSV的受体[25]。这些前期的发现促使我们探究LDLR及其家族蛋白在 CCHFV感染复制过程中的功能。我们建立 LDLR及其家族蛋白敲除的细胞系, 并利用CCHFV进行感染, 结果发现, 敲除LDLR和LDLRAP1可显著抑制CCHFV感染[26]。LDLR是一个膜蛋白, 主要介导胆固醇内吞; 而LDLRAP1则主要在细胞质内, 可以与LDLR的胞质区结合, 促进LDLR的内吞。通过流式染色分析, 表明细胞膜上的LDLR表达水平与CCHFV的感染效率呈正相关。在人、猴子和小鼠来源的多种细胞中敲除LDLR均可以显著抑制CCHFV的感染, 但对其他布尼亚病毒如RVFV、EBIV的感染没有影响。此外, 在感染较差的DLD1细胞中过量表达LDLR则可以促进CCHFV的感染。这些结果表明, LDLR是CCHFV的一个关键宿主因子[26]。<\/p>


<\/p>

由于LDLR是一个膜蛋白, 我们设想LDLR可能在病毒入侵过程中发挥功能。敲除LDLR可以抑制CCHFV的吸附和内化, 而敲除LDLRAP1则只抑制病毒的内化。进一步的实验发现, 靶向LDLR的阻断抗体和可溶性LDLR蛋白均能显著抑制CCHFV的感染。我们也发现LDL也能显著抑制CCHFV的感染, 这可能是因为LDL可以与LDLR结合, 从而竞争性抑制了CCHFV与LDLR的结合。随后我们检测了LDLR是否可以与病毒直接相互作用。我们通过pull-down和ELISA实验发现, LDLR可以与CCHFV的病毒粒子直接结合。此外, 我们也检测了LDLR是否与CCHFV的包膜蛋白Gc和Gn存在直接相互作用。Pull-down和BLI实验发现, LDLR可以与Gc以依赖Ca2+的方式直接相互作用, 而且两者之间具有较高的亲和力。这些结果表明, LDLR通过与病毒包膜蛋白Gc相互作用, 介导CCHFV入侵[26]。<\/p>


<\/p>

为了研究LDLR在CCHFV感染致病过程的功能, 我们利用LDLR敲除小鼠, 并建立小鼠感染模型。结果发现, 敲除LDLR的小鼠在感染CCHFV后, 体重下降, 致死率、体内病毒滴度和组织病变程度均明显降低。此外, 利用靶向LDLR的阻断抗体处理小鼠也能有效降低CCHFV复制能力, 显著减少组织病变, 降低致死率。这些结果表明, LDLR在CCHFV感染致病过程中起重要作用[26]。<\/p>


<\/p>

3 意义和展望<\/p>

受体是病毒入侵宿主的决定性因子, 受体在组织细胞中的分布决定了病毒的嗜性。长期以来, 人们一直不知道CCHFV的受体。我们通过敲除、抗体阻断、可溶性 LDLR蛋白封闭等实验在体外和小鼠体内证明LDLR是CCHFV的一个受体(图1)。LDLR在人体组织中广泛表达, 主要在肝脏、肺、脾脏、肾脏等组织中较高表达, 这与CCHFV在人体组织中嗜性相一致。此外, LDLR在人、猴、小鼠、牛、羊、野兔等动物中非常保守。CCHFV的自然宿主蜱虫也具有LDLR的同源类似物VgR[27], 说明LDLR可能在CCHFV的跨物种传播中起重要作用。然而, 我们也在实验中发现, 在某些类型的细胞中敲除LDLR并不能完全抑制CCHFV的感染, 说明CCHFV还存在其他的(共)受体或感染方式[26]。这些科学问题还需要进一步研究。尽管如此, 本研究发现LDLR作为CCHFV的关键受体, 对CCHFV的感染至关重要。本研究将推动对CCHFV感染和致病机制的了解, 同时也为CCHFV的防治提供了关键靶标和策略。<\/p>


<\/p>

\"1.jpg\"/<\/p>

CCHFV的包膜蛋白Gc可以与LDLR结合, 介导病毒通过内吞进入细胞。靶向LDLR的抗体、LDL和可溶性的LDLR蛋白可以分别与LDLR和病毒结合, 抑制CCHFV的感染。<\/span><\/p>

Binding between LDLR and the glycoprotein Gc of CCHFV leads to CCHFV entry into the cell. The anti-LDLR antibodies, LDL and soluble LDLR,which bind to LDLR or the virions respectively, inhibit CCHFV infection.<\/span><\/p>

图1 LDLR是CCHFV的入侵受体(根据参考文献[26]修改)<\/span><\/p>

Fig.1 LDLR is the entry receptor for CCHFV (modified from reference [26])<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

参考文献 (References)<\/p>

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王延轶, 中国科学院武汉病毒研究所研究员。国家杰出青年科学基金获得者, 国家重点研发计划项目首席科学家。主要从事病毒与宿主相互作用研究, 在Mol Cell、Cell Host Microbe、Cell Res、PNAS<\/em>等期刊发表SCI论文近60篇。曾获中国青年女科学家奖、中国科学院杰出青年、中国免疫学青年学者奖等荣誉。<\/p>","cshort2":"
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王延轶, 中国科学院武汉病毒研究所研究员。国家杰出青年科学基金获得者, 国家重点研发计划项目首席科学家。主要从事病毒与宿主相互作用研究, 在Mol Cell、Cell Host Microbe、Cell Res、PNAS<\/em>等期刊发表SCI论文近60篇。曾获中国青年女科学家奖、中国科学院杰出青年、中国免疫学青年学者奖等荣誉。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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基于胚胎补偿技术在猪体内再造人源中肾<\/span><\/p>

王教伟 栗楠 戴祯 赖良学*<\/span><\/p>

(中国科学院再生生物学重点实验室, 广东省干细胞与再生医学重点实验室,中国科学院广州生物医药与健康研究院, 中国科学院大学, 广州 510530)<\/span><\/p>


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【摘要】肾脏移植是针对终末期肾脏疾病的首选治疗手段。但供体肾源短缺严重限制了这一有效疗法的临床应用。基于胚胎补偿技术的器官异种体内再造策略已被视为解决器官短缺问题的理想方案。然而, 能否借助该策略在大动物体内获得可用于移植的人源肾脏尚未可知。本研究首先向人诱导多能干细胞中转入促增殖基因MYCN<\/em>及抗凋亡基因BCL2<\/em>, 随后利用先前开发的可用于高效获取人类早期胚胎样干细胞的培养体系4CL对其培养, 获得了可用于进行异种胚胎嵌合的理想人源供体细胞, 并针对该细胞的特性, 对胚胎补偿技术体系进行了全方位优化。同时, 该研究成功构建了中肾缺陷、后肾完全缺失的新型肾脏缺陷猪模型。依赖于上述研究基础, 本研究首次在异种大动物猪体内实现了人源中肾再造。经检测, 嵌合中肾内的人源细胞占比高达70%, 其参与构成的中肾小管占比可达58%。更为重要的是, 这些细胞会表达与肾脏发育相关的重要功能性基因,表明其能够分化成为具有肾脏发育功能的细胞类型, 具有支持后肾形成的潜能。该项研究是世界范围内首次成功实现的人源功能性实质器官异种体内再造, 为解决供体器官严重短缺问题开辟新方向。<\/p>


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【关键词】 胚胎补偿技术; 器官异种再造; 人多能干细胞; 肾脏缺陷猪模型<\/p>


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Generation of a Humanized Mesonephros in Pigs via Embryo Complementation<\/p>

WANG Jiaowei, LI Nan, DAI Zhen, LAI Liangxue*<\/span><\/p>


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(CAS Key Laboratory of Regenerative Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine,Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510530, China)<\/span><\/p>


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【Abstract】 Organ transplantation is the best way for treating end-stage kidney diseases, but is limited bythe shortage of donor organs. Generating human organs in large mammals through embryo complementation holdsgreat potential to solve it. However, it remains unknown whether it is feasible to grow human kidneys in largemammals through this approach. In this study, hiPSCs were transferred with proliferation-promoting gene MYCNand the anti-apoptotic gene BCL2 to enhance the competitiveness and survival ability of cells in pig embryos, andthen were induced into naïve state with a special medium (4CL), created an ideal donor cell type for chimeric integration. Besides, the embryo complementation technique was comprehensively optimized and a novel pig modelwith partial mesonephric-deficient and complete metanephros deficiency was generated. Based on above efforts,human mesonephros kidneys were grown inside nephric-deficient pigs. The proportion of human-derived cells inthe chimeric mesonephros reached up to 70%, and the proportion of the mesonephric tubules reach a maximum of58%. Importantly, these cells expressed functional markers for kidney development, indicating that human donorcells could differentiate into functional cells and hold potential for the formation of metanephros. For the first time,this study validates the feasibility of generating a humanized solid organ in organogenesis-disabled pigs, opening anew avenue to solve the shortage of human organs for transplantation.<\/p>


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【Keywords】embryo complementation technology; xenogeneic organogenesis; human pluripotent stemcells; nephric-defective pig model<\/p>


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1 基于胚胎补偿技术实现肾脏异种体内再造的研究背景<\/p>

基于胚胎补偿技术的器官异种体内再造是再生医学领域的研究热点, 这一策略的基本思路是将患者自体来源的细胞诱导为具有多向分化潜能的人多能干细胞(human pluripotent stem cells, hPSCs),之后再将其注射到组织或器官缺陷的大动物胚胎中。伴随着胚胎的发育, 人源供体细胞会增殖、分化, 并对缺陷动物提供的空缺生态位进行富集补偿,进而可在器官缺陷大动物体内再造相应的功能性组织或器官[1-2]。大小鼠的相关研究已证明基于胚胎补偿技术实现肾脏异种体内再造的可行性[3]。但若要获得可用于人体移植的肾脏, 则最终需要在器官缺陷大动物模型中实现[4]。相较于其他大动物而言, 猪因其自身优势而被视为是用于人源器官异种体内再造的理想动物载体。一方面, 猪具有与人类相似的遗传背景、解剖结构、器官体积及免疫机制, 可为再造的人源器官提供理想的体内发育环境[5-6]。基于此, 再造的人源器官能够发育更加成熟, 功能也会更加完善。另一方面, 基因缺陷猪模型的构建技术已十分成熟, 应用基因编辑工具结合体细胞核移植技术可以高效地获得多基因突变的器官缺陷猪模型[7]。最近的两项基于猪的器官异种体内再造相关研究分别报道利用ETV2敲除的血管内皮缺陷猪模型, 以及MYF5/MYOD/MYF6三基因敲除的肌肉缺陷猪模型,成功实现了人源血管内皮组织及肌肉组织的异种体内再造[8-9], 为应用大动物获取人源肾脏奠定了重要的理论及技术基础。然而, 基于猪等大动物模型的实质器官异种体内再造尚未能实现。人干细胞在猪体内的异种嵌合还存在诸多问题有待解决, 例如: 由于物种差异、进化距离等原因, 大量的人源细胞将伴随着胚胎的发育出现无法增殖乃至凋亡的现象[10]; 分化潜能不足的人源供体细胞将无法在异种胚胎中支持如肾脏等具有更为复杂细胞类型的功能性实质器官的形成; 基于人源干细胞的胚胎补偿技术体系尚不成熟, 有待进一步优化; 对于发育过程复杂的器官, 单一基因缺陷不足以构建具有充足生态位空缺的器官缺陷猪模型[1]。因此, 基于多能干细胞结合胚胎补偿技术的实质器官异种体内再造仍然具有挑战性。<\/p>


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2 高分化潜能、强增殖及抗凋亡能力的人诱导多能干细胞(4CL/N/B)的建立<\/p>

人多能干细胞是再生医学中的种子细胞, 其具有分化成为多种类型细胞的能力, 这种分化潜能也是实现器官异种体内再造的重要先决条件[1-11]。伴随着研究的不断深入, 研究人员发现在不同体外培养体系下获得的hPSCs会表现出不同的转录、表观遗传和代谢特征。而这些不同的分子表型特征也将决定hPSCs在异种动物中的分化潜能[12]。为了获得具有更高分化潜能的人源供体细胞, 我们首先利用前期获得的新型干细胞培养基4CL对DsRed荧光蛋白标记的人多能干细胞进行培养, 并通过单细胞RNA测序(single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq), 将其与利用mTSeR1培养基, 以及多种已经报道可获得早期胚胎样细胞的培养基(包括基于NHSM的商业培养基RSeT培养基[13]、PXGL培养基[14]以及5iLA[15]培养基)培养获得的hPSCs进行比较。利用先前报道的人不同时期植入前胚胎scRNA-seq数据作为参照[16], 对4CL培养基培养获得的供体细胞所处细胞状态进行更为全面的分析。结果表明, 通过4CL培养基培养获得的细胞与植入前E5胚胎具有更为接近的转录组表达模式, 说明其可被定义为早期胚胎样的hPSCs(图1A和图1B)。多能性标志基因的表达情况是评估干细胞分化潜能的重要指标[1]。为了进一步评估利用不同培养基培养获得的供体细胞所具有的分化潜能, 我们也基于scRNA-seq数据对来源于不同培养体系获得的hPSCs进行了多种多能性相关基因表达情况分析。其中, 利用4CL培养基获得的早期胚胎样细胞具有更为完善的多能性基因表达谱, 说明其将具有更好的分化潜能(图1C)。<\/p>


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除了细胞多能性外, 供体细胞早期凋亡以及与宿主细胞的竞争也极大地阻碍了嵌合体的形成[17-19]。在前期研究中, 我们发现通过在hPSCs中过表达促增殖基因MYCN及抗凋亡基因BCL2, 有效地提高了人源供体细胞的竞争及抗凋亡能力, 并成功应用其在血管发育缺陷的小鼠体内再造人的造血细胞[20]。因此, 在本研究中, 我们也将包装有Tet-on诱导MYCN/BCL2基因表达系统以及嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转染定点敲入DsRed基因的hPSCs。通过向转染后的细胞培养基中添加嘌呤霉素对细胞进行药物筛选, 从而获得阳性细胞。随后, 我们利用4CL培养基对阳性hPSCs进行培养, 进而获得了转入MYCN/BCL2基因的新型hPSCs, 我们将该细胞命名为4CL/N/B细胞[21]。经Dox诱导3天后, 4CL/N/B细胞中MYCN与BCL2均具有较高表达水平(图1D)。<\/p>


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为了检测过表达MYCN及BCL2是否会对细胞多能性产生影响, 我们对4CL/N/B细胞与4CL培养基诱导获得的hPSCs进行单细胞转录组测序。分析结果显示, 二者的多能性相关基因表达情况基本一致(图1E)。同时, 通过对二者的差异基因进行GO富集分析可发现, 表达量上调的差异基因主要与细胞周期、细胞分裂、核糖体生物合成、纺锤体组装、DNA复制及凋亡信号通路调节等生物过程相关(图1F)。此外, 基于scRNA-seq数据的细胞周期分析表明, 相较于4CL培养的hPSCs而言, 更多的4CL/N/B细胞处于G2/M期(图1G), 表明MYCN及BCL2的过表达能够通过加速细胞周期促进细胞增殖分裂, 这将有益于4CL/N/B细胞在异种胚胎中的生存能力。<\/p>

\"LLX-1.jpg\"/<\/p>

A、B: 基于scRNA-seq数据, 利用UMAP降维对4CL、5iLA、PXGL、RSeT培养基培养的naïve细胞及primed细胞与不同时期人植入前胚胎进行聚类分析; C: 基于scRNA-seq数据, 分析利用4CL、5iLA、PXGL、RSeT培养基培养获得的naïve细胞, 及primed细胞中的多能性相关基因表达情况;D: Western blot检测4CL/N/B细胞中MYCN、BCL2的表达情况; E: 基于scRNA-seq数据分析的4CL、4CL/N/B、5iLA、PXGL、RSeT和primedPSC间差异基因表达情况热图; F: GO分析显示4CL/N/B细胞中细胞周期、细胞通路等相关基因上调; G: 与4CL培养的naïve细胞相比, 4CL/N/B细胞处于G2/M期的细胞比例更高。<\/span><\/p>

A,B: UMAP comparing scRNA-seq datasets of the human preimplantation embryos with human PSCs cultured in 4CL, 5iLA, PXGL, RSeT and primedconditions; C: the expression patterns of pluripotency-related genes based on scRNA-seq datasets of human PSCs cultured in 4CL, 5iLA, PXGL, RSeTand primed conditions; D: Western blot of MYCN and BCL2 expression in 4CL/N/B iPSCs with or without Dox induction; E: heatmap of differentiallyexpressed genes (DEGs) among 4CL, 4CL/N/B, 5iLA, PXGL, RSeT, and primed PSCs based on scRNA-seq datasets; F: GO analysis showed cellcycle, cell pathway and other related genes were upregulated in 4CL/N/B cells; G: 4CL/N/B cells had a higher proportion of cells in the G2/M phasecomparing to 4CL cultured naïve cells.<\/span><\/p>

图1 scRNA-seq数据表明4CL/N/B细胞为早期胚胎样细胞并具有较强的增殖能力(根据参考文献[21]修改)<\/span><\/p>

Fig.1 scRNA-seq datasets indicate that 4CL/N/B cells exhibit characteristics of early embryonic-like cellsand possess strong proliferative capacity (modified from reference [21])<\/span><\/p>


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3 胚胎补偿技术体系的优化<\/span><\/p>

嵌合胚胎在体外培养至囊胚阶段再进行移植,在体外培养期间, 异种嵌合胚胎的培养基同时影响着猪胚胎及人源供体细胞的发育。为此, 我们分别尝试应用猪胚胎培养基PZM、人源细胞培养基4CL以及PZM与4CL等比例混合培养基(PZM׃4CL=1׃1(对猪孤雌胚胎进行培养, 并依照胚胎补偿的技术流程, 分别选取4-8细胞期及桑葚胚期的孤雌胚胎进行测试。结果显示, 在单独应用4CL培养基培养4-8细胞期的猪胚胎时, 猪胚胎发育发生严重阻滞, 在E6.5没有获得胚胎。而应用等比例混合培养基培养的4-8细胞猪胚胎的囊胚率有所提高, 但也仅为30%。对于桑葚胚组而言, 利用4CL培养的猪胚胎, 其胚胎发育率相较于PZM组仍然较低, 但利用等比例混合培养基培养的猪胚胎, 其胚胎发育率已可达90%以上,基本接近PZM培养体系中的正常胚胎发育水平(图2A和图2B)。这说明PZM׃4CL=1׃1混合培养基可以中和单独4CL培养基对猪胚胎发育的影响。<\/span><\/p>


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为了进一步探索PZM׃4CL=1׃1培养体系是否适合用于嵌合胚胎的体外培养, 我们在桑葚胚时期对孤雌胚胎进行了人源供体细胞的注射 , 之后利用PZM及PZM׃4CL=1׃1培养基对嵌合胚胎进行培养。体视荧光观察结合免疫荧光染色结果显示, 利用PZM培养基培养的嵌合胚胎中DsRed阳性细胞数量极少。而从PZM׃4CL=1׃1培养体系中得到的嵌合胚胎囊胚率大大高于PZM(图2C)。因而我们后续将应用PZM׃4CL=1׃1的混合培养基对嵌合胚胎进行培养。<\/span><\/p>


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人源细胞的注射数目也是影响嵌合效率以及胚胎发育率的重要因素之一。为此, 我们也对人源细胞初始注射数量进行了摸索。起初, 我们依据已报道的啮齿类动物的相关研究数据, 向孤雌猪胚胎中注射7~10个人源供体细胞。我们发现人源供体干细胞数量过多时, 大量嵌合重构胚胎会出现发育异常停滞, 嵌合胚胎的囊胚发育率会严重下降。之后, 我们将注射数目控制在3~5个, 在此情况下, 多数胚胎可以正常发育并能够获得更多阳性嵌合胚胎(图2D)。<\/span><\/p>


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综合上述结果, 我们优化了适用于构建人–猪嵌合胚胎的胚胎补偿技术体系, 并将基于这套技术体系, 结合4CL/N/B细胞进行接下来的研究。<\/span><\/p>

\"LLX-2.jpg\"/<\/span><\/p>

A: 4-8细胞期及桑葚期胚胎在不同培养体系下培养至囊胚阶段(E6.5)的照片; B: 4-8细胞期及桑葚期胚胎在不同培养体系下的囊胚率统计; C: 不同培养体系下培养桑葚期人–猪嵌合胚胎最终获得的嵌合囊胚、未嵌合囊胚以及非正常囊胚数目的比例统计; D: 注射不同人源供体细胞数目的人–猪嵌合胚胎最终获得嵌合囊胚、未嵌合囊胚以及非正常囊胚数目的比例统计。<\/span><\/p>

A: representative bright field images of 4-8 cell stage and morula stage cultured to E6.5 pig blastocysts under different culture conditions; B: quantification of blastocyst formation proportion in the conditions from panel A; C: proportional statistics of the number of chimera, non-chimera, and abnormalblastocysts obtained from the culture of human-pig chimeric morula-stage morula-stage embryos in different culture systems; D: proportional statisticsof the number of chimera, non-chimera, and abnormal blastocysts obtained from human-pig chimeric embryos injected with different numbers of human donor cells.<\/span><\/p>

图2 人–猪胚胎补偿技术体系的优化(根据参考文献[21]修改)<\/span><\/p>

Fig.2 Optimization of human-pig embryo complementation technology system (modified from reference [21])<\/span><\/p>


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4 4CL/N/B细胞在体外宿主猪胚胎中的嵌合情况分析
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如上文所述, 人源供体细胞早期在异种胚胎内会发生严重的凋亡进而影响嵌合效率。为了评估4CL/N/B细胞在异种猪胚胎中的抗凋亡能力及存活情况。我们将Dox诱导后的4CL/N/B细胞注射到猪孤雌胚胎内, 之后通过TUNEL及Annexin V凋亡试剂对发育至囊胚的嵌合重构胚胎进行染色, 从而检测4CL/N/B是否发生凋亡。结果显示, 重构胚胎内只有极少的4CL/N/B细胞表现为TUNEL阳性, 且未见明显Annexin V阳性4CL/N/B细胞(图3A)。这表明4CL/N/B具有较强的抗凋亡能力。接下来, 我们对嵌合胚胎中的4CL/N/B细胞是否与猪细胞建立细胞间连接进行检测。通过对细胞间黏附分子E-cadherin进行免疫荧光染色发现, 4CL/N/B细胞与猪细胞间产生很好的连接(图3B)。同时, 我们针对存活的4CL/N/B细胞是否能够与猪细胞之间存在有效的功能性连接进行了进一步检测。我们预先用钙黄素(Calcein AM)和Dil染色剂对4CL/N/B细胞进行孵育。将处理过的细胞注入到猪桑葚胚中, 24 h后对重构胚胎进行荧光检测。当细胞间建立有效连接时, 钙黄素能够通过细胞间隙扩散, 而对于活细胞而言, Dil染料不会扩散,因此我们将Dil作为对照, 排除因4CL/N/B细胞凋亡导致的染料泄漏。通过体视荧光检测, 我们发现嵌合胚胎中钙黄素能够从4CL/N/B细胞扩散至邻近的猪细胞中, 而Dil未出现泄漏(图3C)。这说明4CL/N/B细胞不仅能够在胚胎中高效存活, 并可与猪供体细胞建立有效的功能性连接, 进行分子或信号交流。<\/span><\/p>


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接下来, 为了评估猪胚胎中4CL/N/B细胞的发育潜能 , 我们对嵌合胚胎的 SOX2及 CDX2进行免疫荧光。SOX2是调控细胞多能性的主要转录调控因子, 也被认为是内细胞团(inner cell mass, ICM)的典型marker基因。转录因子CDX2则是滋养外胚层(trophectoderm, TE)的主要调节分子之一, 鉴于滋养层将在哺乳动物发育过程中形成胎盘及卵黄囊等胚外组织, 因此CDX2可用于指示滋养外胚层细胞。我们注意到, 一些接近内细胞团的4CL/N/B细胞表达SOX2, 并且4CL/N/B细胞也会分布到滋养层中表达CDX2(图3D和图3E), 说明4CL/N/B细胞能够伴随胚胎发育贡献到猪内细胞团和滋养层中, 并有能力参与胎儿、胎盘及卵黄囊的形成。<\/span><\/p>


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上述体外胚胎水平的实验结果显示4CL/N/B细胞可在人–猪嵌合胚胎中存活、增殖, 同时与宿主细胞建立功能连接, 并伴随胚胎发育分化为胚内和胚外谱系细胞。这说明我们构建的4CL/N/B细胞是一种具有高分化潜能、强增殖及抗凋亡能力的人多能干细胞, 是可用于进行肾脏异种体内再造的理想人源供体细胞。<\/span><\/p>

\"LLX-3.jpg\"/<\/span><\/p>

A: TUNEL及Annexin V染色指示4CL/N/B细胞在嵌合囊胚中无明显凋亡情况; B: E-cadherin染色显示4CL/N/B细胞与猪细胞产生黏附; C: calcein染色剂指示4CL/N/B细胞与猪细胞建立功能连接; D: SOX2免疫荧光染色指示4CL/N/B细胞可分化成为内细胞团细胞; E: CDX2免疫荧光染色指示4CL/N/B细胞可分化成为滋养外胚层细胞。<\/span><\/p>

A: TUNEL and Annexin V staining indicated that 4CL/N/B cells had no significant apoptosis in chimeric blastocysts; B: E-cadherin staining showed adhesion of 4CL/N/B cells to pig cells; C: calcein stain indicated the establishment of functional connections between 4CL/N/B cells and pig cells; D: SOX2immunofluorescence staining indicated that 4CL/N/B cells could contribute to ICM; E: CDX2 immunofluorescence staining indicated that 4CL/N/B cellscould contribute to TE.<\/span><\/p>

图3 针对嵌合胚胎中4CL/N/B细胞的存活能力、与宿主间连接及分化潜能的检测(根据参考文献[21]修改)<\/span><\/p>

Fig.3 Detection of the viability, host integration, and differentiation potential of 4CL/N/B cells in chimeric embryos(modified from reference [21])<\/span><\/p>


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5 双基因修饰肾脏缺陷猪模型的建立
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与其他大多数器官的发育过程不同, 肾脏会经历三个连续的发育阶段[22]。后肾作为哺乳动物永久肾脏, 由输尿管芽和后肾间质相互诱导产生。利用小鼠PSCs在敲除肾脏发育关键基因Sall1的大鼠中虽然成功地再造了小鼠肾脏, 但该异种肾脏中的部分输尿管仍来源于大鼠[3]。这就说明, 单一的肾脏发育关键基因缺失可能不足以构建理想的器官缺陷猪模型。<\/span><\/p>


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在先前的研究中, 我们利用CRISPR/Cas9技术成功获得了SIX1–/–阳性猪胎儿成纤维克隆。并利用阳性成纤维克隆结合核移植技术成功构建了SIX1–/–的肾脏缺陷猪模型, 与野生型(wild type, WT)猪胎儿后肾相比, SIX1–/–胎儿的肾脏表现为肾小管严重空泡化变性, 但未出现后肾缺失的表型(图4A和图4B)。在本研究中, 我们首先借助体细胞核移植技术, 利用分离获得的SIX1–/–原代猪胎儿成纤维细胞构建了克隆胚胎。之后对1细胞期的克隆胚胎注射靶向SALL1的sgRNA和胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)的mRNA(CBE通过将胞嘧啶脱氨变为尿嘧啶, 进而对应胸腺嘧啶, 从而将sgRNA中谷氨酰胺CAA变为终止密码子TAA, 提前终止突变SALL1基因)。之后, 我们将注射了mRNA的重构胚胎移植到代孕母猪体内,并在E35剖取猪胎儿(图4C)。H&E染色结果显示, 与对照胎儿相比, SIX1/SALL1双基因纯合敲除胎儿表现出明显的中肾发育缺陷(中肾尾部的小管数目大量减少)及后肾的完全缺失(图4D)。鉴于该双基因敲除猪模型理论上可为人源供体细胞提供更为充足的器官生态位空缺, 我们将在后续以此模型为载体, 进行人源肾脏异种体内再造的研究。<\/span><\/p>

\"LLX-4.jpg\"/<\/p>

A: SIX1–/–胎儿基因型sanger测序峰图; B: H&E染色显示E51 SIX1–/–胎儿后肾肾小管空泡化变性; C: 双基因纯合敲除胎儿的SALL1基因sanger测序峰图; D: WT与SIX1/SALL1双基因敲除E35胎儿肾脏部位H&E染色, 右侧为胎儿中肾局部放大, 黄色虚线圈出位置为后肾部位。<\/span><\/p>

A: sanger sequencing chromatograms of SIX1–/– fetuses; B: H&E staining showed vacuolar degeneration of E51 SIX1–/– renal tubules; C: sanger sequencing chromatograms of SALL1 gene in double-gene homozygous knockout embryo; D: H&E staining images of mesonephros in WT and SIX1/SALL1-null embryos at E35. The right side was the local enlargement of the mesonephros and the yellow dotted line in the WT embryo delineated the metanephros.<\/span><\/p>

图4 肾脏缺陷猪胎儿的基因型检测及表型分析(根据参考文献[21]修改)<\/span><\/p>

Fig.4 Genotype detection and phenotype analysis of nephric-defective pig fetuses (modified from reference [21])<\/span><\/p>


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6 基于胚胎补偿技术在猪体内再造人源中肾
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如上所述, 我们已经获得了新型人源供体干细胞4CL/N/B以及多基因修饰的肾脏缺陷猪模型。接下来我们将基于二者, 利用优化的胚胎补偿技术体系, 尝试在肾脏缺陷猪模型体内再造人源肾脏器官。依据上述方案构建SIX1及SALL1双基因敲除的核移植胚胎。待重构胚胎发育到桑葚胚时期, 依据优化的胚胎补偿技术体系向其中注射3~5个DsRed荧光蛋白标记的4CL/N/B细胞。24 h后, 我们将含有红色荧光的阳性囊胚移植到代孕母猪体内。移植两周后,对代孕母猪进行B超检测。对于确定怀孕的代孕母猪, 分别在E25和E28终止妊娠, 并剖取胎儿。我们最终获得E25嵌合胎儿2只, E28嵌合胎儿3只。在体式荧光镜下, 我们可在嵌合胎儿的中肾部位观察到明显的红色荧光。通过进一步的免疫荧光染色检测, 我们发现这些嵌合胎儿的中肾内均存在大量的DsRed阳性人源细胞, 并且这些人源细胞参与了中肾小管的形成(图5A)。我们对含有人源细胞的中肾小管在中肾内所占的比例进行统计, 其占比为38%~58%(图5B)。为了进一步验证红色荧光细胞为人源细胞, 我们利用人核特异性抗体(h-nuclei)与DsRed进行免疫荧光共染。结果显示h-nuclei与DsRed蛋白共定位表达, 证明嵌合胎儿中肾内红色荧光细胞确为人源细胞。针对中肾部位DsRed及h-nuclei双荧光细胞的量化统计结果表明, 人源细胞占比为50%~70%(图5C)。同时, 我们也通过组织学染色来检测胎儿的中肾是否结构完整。H&E染色结果显示, 不同于缺陷胎儿的中肾发育缺陷, 嵌合胎儿的中肾具有与WT胎儿相同的致密结构,中肾尾部小管数目较缺陷胎儿明显增多(图5D), 这一结果再次证明, 4CL/N/B细胞可伴随胚胎发育填补肾脏缺陷猪模型的生态位空缺, 并将形成人源中肾小管,进而在其体内参与形成结构相对完整的人源中肾。<\/span><\/p>


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在明确 4CL/N/B细胞可在肾脏缺陷猪模型体内支持中肾形成后, 接下来我们希望进一步确定中肾内的4CL/N/B细胞是否能够进一步支持后续的肾脏形成。为此, 我们通过免疫荧光染色检测了人源细胞中肾脏发育功能相关基因的表达情况, 以期验证4CL/N/B细胞是否已在真正意义上转化为肾脏细胞。我们首先针对敲除的SIX1及SALL1基因进行了免疫荧光染色。结果表明, 嵌合胎儿中人源细胞表达的h-nuclei或DsRed能够与SIX1或SALL1共定位,说明中肾内的 4CL/N/B细胞已分化成为能够表达SIX1及SALL1的功能性细胞(图5E和图5F)。同时,我们也对另外两个肾脏早期发育关键功能性基因PAX2和WT1进行了免疫荧光共染。PAX2基因编码的蛋白表达于肾管、中肾小管及后肾间质等部位[23],该基因对肾脏的早期发育至关重要, 其缺陷已被证明会导致中肾小管及后肾发育缺陷。而WT1是间质向上皮细胞转变所必需的关键转录因子, 其缺陷被证明会引起尾部中肾小管发育缺失[24]。针对二者的免疫荧光染色表明, PAX2、WT1同样能够与人源细胞中的h-nuclei共定位。这也能够进一步说明嵌入肾脏缺陷胎儿中肾内的4CL/N/B细胞, 能够分化成为具有肾脏发育功能的细胞, 这也预示着, 其将在胎儿后续发育中支持人源后肾的形成。<\/span><\/p>

\"LLX-5.jpg\"/<\/span><\/p>

A: WT、E25和E28胎儿明场、体式荧光镜及免疫荧光染色图片; B: WT、E25和E28胎儿DsRed阳性人源中肾小管占比统计; C: WT、E25和E28胎儿中肾内h-nuclei、DsRed双阳性细胞占比统计; D: WT、SIX1/SALL1双基因敲除、E25和E28胎儿中肾区域H&E染色; E: E25和E28胎儿中肾区域SIX1及h-nuclei免疫荧光染色; F: E25和E28胎儿中肾区域SALL1及DsRed免疫荧光染色。<\/span><\/p>

A: representative bright-field, stereo fluorescence and immunofluorescence images of WT, E25, and E28 embryos; B: quantification of DsRed positivemesonephric tubules of WT, E25, and E28 embryos; C: quantification of DsRed and h-nuclei double-positive mesonephric cells of WT, E25, and E28embryos; D: H&E images of mesonephros of WT, SIX1/SALL1-null, E25, and E28 embryos; E: immunofluorescence staining of SIX1 and h-nuclei inmesonephros of E25 and E28 embryos; F: immunofluorescence staining of SALL1 and DsRed in mesonephros of E25 and E28 embryos.<\/span><\/p>

图5 针对嵌合胎儿中人源细胞的嵌合情况进行分析(根据参考文献[21]修改)<\/span><\/p>

Fig.5 Analysis of chimerism of human cells in chimeric embryos (modified from reference [21])<\/span><\/p>


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7 总结与展望<\/span><\/p>

基于胚胎补偿技术的器官异种体内再造是再生医学研究的前沿领域。该项技术旨在利用患者自体来源的人多能干细胞, 对器官缺陷大动物模型提供的生态位空缺进行补偿, 进而在异种动物体内再造人源化器官。理论上, 应用这一技术手段获得的再造器官将具有完善的细胞类型、结构及功能, 也可有效避免免疫排斥等诸多问题。因此, 该项技术也被视为用于获取人源化器官, 解决供体器官短缺问题的最具前景途径之一。<\/span><\/p>


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在本项工作中, 我们基于具有高分化潜能、强增殖及抗凋亡能力的人多能干细胞4CL/N/B, 优化的胚胎补偿技术体系及多基因修饰的肾脏缺陷猪模型,成功实现了在猪体内再造人源中肾。我们共获得胎龄25天的嵌合胎儿2只, 胎龄28天嵌合胎儿3只。经检测这些嵌合胎儿中肾内人源细胞占比高达70%。在此基础上, 嵌合猪胎儿体内形成了结构完整的人源中肾。更为重要的是, 人源细胞也能够表达多种肾脏发育关键的功能性基因, 说明这些嵌合胎儿体内的人源供体细胞能够分化成为具有支持肾脏发育的功能性细胞, 在条件允许的前提下, 这些细胞将可能伴随着胚胎发育在肾脏缺陷的胎儿体内支持人源后肾的再生。本研究不仅是世界范围内首次成功实现的人源功能性实质器官异种体内再造, 也首次证明了借助胚胎补偿技术实现功能性实质器官异种体内再造的可行性。这一重要突破将为器官异种体内再造奠定重要的理论及技术基础, 也势必将对未来解决供体器官短缺这一世界级难题具有重要价值。<\/span><\/p>


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参考文献 (References)<\/span><\/p>

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赖良学, 中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员。1998年在美国密苏里大学从事博士后研究; 2002年任美国密苏里大学研究助理教授; 2007年起在中国科学院广州生物医药与健康研究院工作, 任研究员、博士生导师。实验室长期开展基因编辑人源化大动物模型培育与应用研究。以第一或通讯作者的身份在Science、Cell、Nat Biotechnol、Cell Stem Cell<\/em>等国际期刊发表研究论文多篇。<\/p>","cshort2":"
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赖良学, 中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员。1998年在美国密苏里大学从事博士后研究; 2002年任美国密苏里大学研究助理教授; 2007年起在中国科学院广州生物医药与健康研究院工作, 任研究员、博士生导师。实验室长期开展基因编辑人源化大动物模型培育与应用研究。以第一或通讯作者的身份在<\/span>Science、Cell、Nat Biotechnol、Cell Stem Cell<\/em>等国际期刊发表研究论文多篇。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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<\/p>","ctitle":"基于胚胎补偿技术在猪体内再造人源中肾","listseq":104,"seqno":"104","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"24-01-31-17-29-58-895"},{"caddress1":"(东南大学, 生命科学与技术学院, 发育与疾病相关基因教育部重点实验室, 南京 210096)","cauthor":"方海同 罗卓娟* 林承棋*","cintpic":"Upload/qianyan/23-12-01-16-28-00-852.pdf","clicktime":770,"clong1":"

ELL3结合的LINE-1作为增强子调控小鼠胚胎干细胞原始多能性<\/span><\/p>

方海同 罗卓娟* 林承棋*<\/span><\/p>

(东南大学, 生命科学与技术学院, 发育与疾病相关基因教育部重点实验室, 南京 210096)<\/span><\/p>


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【摘要】逆转录转座子占据了小鼠基因组的40%以上, 并对宿主基因组的结构和进化产生重要影响。LINE-1是一类具有自主转座能力的逆转录转座子。尽管存在导致基因组不稳定的潜在风险,但LINE-1在胚胎早期阶段高度活化。该团队发现ELL3结合的年轻LINE-1亚家族, L1Md_Ts, 在小鼠原始态胚胎干细胞中起到增强子的作用。当ELL3缺失时, L1Md_Ts 5hmC水平下降, H3K27ac水平上升, 并促使L1Md_Ts附近的基因表达上调。特别是, ELL3结合并抑制了位于Akt3基因内的基于L1Md_T的增强子活性, 而Akt3基因编码了AKT信号通路的关键调控因子。在小鼠胚胎干细胞和着床前胚胎发育过程中, ELL3通过抑制AKT3来调控ERK信号通路的适当激活。该研究揭示了ELL3介导的L1Md_T增强子活性在胚胎干细胞多能性调控中的重要意义。<\/span><\/p>


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【关键词】 ELL3; LINE-1; AKT3; 原始态胚胎干细胞<\/span><\/p>


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ELL3 Marked LINE-1 Serve as Enhancers to Regulate Naïve Pluripotency in Mouse ESC<\/span><\/p>

FANG Haitong, LUO Zhuojuan*, LIN Chengqi*<\/span><\/p>


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(Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, School of Life Science and Technology, Southeast University, Nanjing 210096, China)<\/span><\/p>


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【Abstract】 Retrotransposons make up more than 40% of the mouse genome and have a significant impacton the evolution and structure of the host genome. LINE-1s are a major group of retrotransposons that have theability to autonomously transpose. Despite the potential for gene toxicity, LINE-1s are highly activated during the early stages of embryo development. In the study, LIN and colleagues have identified a subset of youngLINE-1s, called L1Md_Ts, that are marked by ELL3 and function as enhancers in naïve mouse ESCs (embryonicstem cells). Depletion of ELL3 results in a loss of 5hmC, an increase in H3K27ac, and an up-regulation of genesnear the L1Md_Ts. Specifically, ELL3 occupies and represses an enhancer within Akt3, which is a key regulatorof the AKT pathway. ELL3 is essential for proper ERK activation in both mouse ESC and pre-implantation embryos. This study reveals the significance of ELL3 in governing the enhancer function of L1Md_Ts in the regulation of pluripotency in ESC.<\/span><\/p>


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【Keywords】ELL3; LINE-1; AKT3; naïve embryonic stem cells<\/span><\/p>


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1 LINE-1与基因顺式调控<\/span><\/p>

哺乳动物基因组约有一半是由重复元件构成的, 其中超过95%是逆转录转座子, 它们通过转录复制粘贴机制进行“跳跃”[1-2]。逆转录转座子的转座活性尽管可能对宿主基因组有害, 但它们也是进化的驱动力, 并且现在逆转录转座子被认为是宿主基因组的一个不可或缺的组成部分, 具有调控功能[3-4]。大多数逆转录转座子经过长期演化已丧失转座活性。然而, 最近进化的长散在重复元件-1(long interspersed nuclear element-1, LINE-1)是哺乳动物中仍然具有自主迁移能力的逆转录转座子类群[5-7]。在早期胚胎发育过程中, 表观遗传的广泛重编程导致了LINE-1转录的瞬时且显著的增加[8]。尽管LINE-1在着床前胚胎中具有显著的转录活性, 但其逆转录频率却远远低于预期。最近的研究表明, LINE-1转录或其转录产物的调控功能已经超越了其在宿主基因组中的转座作用。例如, LINE-1转录对小鼠早期胚胎中染色质的全局性开放起到重要作用[9]。此外, 研究还发现, LINE-1转录物能够招募核仁蛋白和KAP1来抑制2细胞(2C)胚胎特异性转录因子DUX, 并调控基因组的空间组织[10-11]。虽然大量LINE-1存在于宿主基因附近或相邻区域, 但LINE-1元件本身是否在胚胎发育及基因表达调控中发挥作用目前尚不清楚。<\/span><\/p>


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在早期胚胎发育过程中 , 逆转录转座子受到严格的表观遗传调控。Krüppel样锌指蛋白(KRABzinc finger protein, KZFP)和相关的组蛋白修饰酶(如 SETDB1)以及支架蛋白 KAP1能够特异地定向到逆转录转座子(包括古老LINE-1元件)上, 以保持染色质的紧密折叠, DNA对转录因子和RNA聚合酶的不可及性[12-13]。然而, 在小鼠胚胎干细胞(mouseembryonic stem cell, mESC)中, 年轻的LINE-1逃脱了KZFP介导的沉默调控, 受到共抑制子SIN3A和DNA羟甲基化酶TET1的调控, 处于转录静息状态[12-13]。研究发现, Krüppel样锌指转录因子ZFP281可以招募TET1和SIN3A到一部分年轻LINE-1上[14]。年轻LINE-1的表达在胚胎着床前阶段达到最高水平[15],然而, 在早期胚胎发育和干细胞多能性调控过程中,年轻LINE-1如何受到精确调控仍不清楚。<\/span><\/p>


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2 ELL3抑制L1Md_T及其附近基因<\/span><\/p>

我们之前的研究表明 , 在血清 /LIF培养的mESC中, ELL3结合在增强子上, 并且调控RNA聚合酶Pol II在发育关键基因启动子上的近端结合[17]。通过ChIP-seq实验, 我们发现ELL3在染色质上的结合位点有3 428个, 大部分位于重复元件区域, 特别是L1Md_T元件占比达到85%(图1A)。为了进一步验证 ELL3对定位的重复元件的调控作用 , 我们在ESC中敲除(KO)了Ell3基因, 并使用RNA-seq方法对细胞进行了分析。结果显示, 在Ell3基因敲除后,L1Md_T的转录水平显著增加(图1B)。同时, 我们还分析了ELL3结合的L1Md_T和L1Md_Gf附近(<50Kb)基因的表达水平, 发现在Ell3基因敲除后, 这些基因的表达水平显著增加(图1C)。KEGG通路分析显示, 这些基因显著富集于AKT、RAS和MAPK信号途径中(图1D)。同时, 我们观察到, ELL3结合在Xlr基因簇内的L1Md_T元件上, Ell3基因敲除会导致该簇内所有Xlr基因的表达上调(图1E)。这些结果提示 ELL3可能通过靶向抑制 L1Md_T来抑制邻近基因的转录活性。<\/span><\/p>

\"LCQ-1.jpg\"/A: 饼图显示ELL3结合的重复元件中L1Md_T和L1Md_Gf的百分比。B: 火山图显示Ell3 KO后差异表达的逆转录重复元件。红色和蓝色点分别代表表达水平显著增加或减少的重复元件(倍数≥1.5或≤−1.5, 且P<0.05)。C: 小提琴图显示Ell3 KO后, ELL3结合的L1Md_T和L1Md_Gf附近50 Kb内基因的表达变化倍数, ELL3未结合的全长L1Md_T和L1Md_Gf基因的表达变化倍数, 以及ELL3结合的非逆转录重复元件(non-REs)的表达变化倍数。D: Ell3 KO后差异表达基因的KEGG通路分析。E: RNA-seq IGV显示WT和Ell3 KO mESC中Xlr家族基因的RNA水平。ChIP-seqIGV显示ELL3在Xlr基因组中的定位。<\/span><\/p>

A: pie chart showing the percentage of L1Md_T and L1Md_Gf overlapping with ELL3 peaks. B: volcano plot of differentially expressed retrotransposons after Ell3 KO with red dots representing upregulated retrotransposons (FC≥1.5; P<0.05) and blue dots representing downregulated retrotransposons (FC≤–1.5; P<0.05). C: violin plot showing the expression FCs of the genes nearby the ELL3 bound L1Md_Ts and L1Md_Gfs, the ELL3 free fulllength L1Md_Ts and L1Md_Gfs, and the ELL3 bound non-retrotransposons (non-REs) after Ell3 KO (within 50 Kb). The horizontal line across the boxrepresents the median value. D: KEGG pathway enrichment analysis for the genes differentially expressed after Ell3 KO. E: IGV browser tracks showing the RNA-seq signals of RNAs from the Xlr family genes in WT and Ell3 KO mESC. IGV browser tracks showing the ChIP-seq tracks for ELL3 atthe entire Xlr locus.<\/span><\/p>

图1 ELL3通过直接与L1Md_T结合来抑制L1Md_T及其附近的基因(数据修改自参考文献[16])<\/span><\/p>

Fig.1 ELL3 directly binds to the L1Md_T, resulting in the repression of both L1Md_T and the adjacent genes(modified from reference [16])<\/span><\/p>


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3 ELL3靶向的L1Md_T作为顺式作用元件调控基因表达<\/span><\/p>

接下来, 我们进一步研究了ELL3调控L1Md_T附近基因表达的调控机制。为了验证 LINE-1是否作为顺式作用元件来调控基因表达, 我们进行了位点特异性CRISPR激活(CRISPRa)实验来特异性激活Ell3在Akt3上的结合位点Akt3_L1(图2A和图2B)。实验结果显示, HA标记的dCas9-VP64能够特异性地定向到Akt3_L1位点, 而不定向到ELL3结合的其他L1Md_T位点(图2C)。进一步的分析发现, Akt3_L1的位点特异性CRISPRa导致H3K27ac在Akt3_L1上的富集程度显著增加(图2D)。在Akt3_L1 CRISPRa细胞系中, L1Md_T的转录水平升高的同时, Akt3表达也上调, 而Xlr5a、Aldh1a2或Reg2的RNA水平没有明显变化 (图 2E)。这些结果表明 , ELL3结合的L1Md_T可能通过顺式作用来调节附近基因的表达。进一步的研究中, 我们分析了mESC Micro-C数据, 并进行了可视化4C分析, 结果显示, ELL3结合的L1Md_T与相邻基因如Akt3、Aldh1a2等发生相互作用(图2F)。通过4C实验验证了Aldh1a2启动子与其最近的L1Md_T之间的相互作用, 并且在Ell3敲除后观察到更强的相互作用(图2G)。这些结果表明,ELL3结合的L1Md_T可作为增强子与邻近基因相互作用, 进而调控其转录活性。<\/span>
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\"LCQ-2.jpg\"/<\/p>


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A: dCas9-VP64特异性靶向Akt3_L1并激活Akt3基因示意图。B: Western blot分析显示在CRISPRa载体慢病毒感染mESC后, WB检测到带有HA标签的VP64。C: HA ChIP-qPCR显示特异sgRNA可以引导带有HA标签的VP64定位结合Akt3_L1。D: H3K27ac ChIP-qPCR显示在Akt3_L1 CRISPRa后, Akt3_L1上H3K27ac富集水平增加, 但Xlr_L1、Aldh1a2_L1或Reg2_L1上没有显著变化。E: RT-qPCR显示在Akt3_L1 CRISPRa后, L1Md_T和Akt3的RNA水平上调, 但Xlr5a、Aldh1a2或Reg2没有明显变化。B~E, 数据为3次独立实验的平均值±SEM, 并进行了t检验。**P<0.01,***P<0.001, ns=不显著。F: ChIP-seq可视化显示Ell3 KO后Akt3_L1和Aldh1a2_L1上H3K27ac富集水平增加, hMeDIP-seq可视化显示5hmC水平降低。虚拟4C分析的结果表明, Akt3和Aldh1a2的启动子分别与Akt3_L1和Aldh1a2_L1发生相互作用。蓝色条表示视点, 橙色条表示推测的增强子区域。显示来自多映射和唯一映射的reads。G: 可视化显示Aldh1a2基因上的ELL3 ChIP-seq和4C数据。放大图示意4C信号中Hind III片段末端的计数映射。数据进行了多映射reads的分析。<\/span><\/p>

A: schematic of Akt3 gene activation by dCas9-VP64 targeting the Akt3_L1 specifically. B: Western blot analysis for HA-VP64 can be detected inmESC after lentiviral transduction of the dCas9-VP64 vectors. C: HA ChIP-qPCR demonstrates that specific sgRNA can guide HA-tagged VP64 totarget and bind Akt3_L1. D: H3K27ac ChIP-qPCR at Akt3_L1, Xlr_L1, Aldh1a2_L1 and Reg2_L1 after Akt3_L1 CRISPRa. E: RT-qPCR showing theRNA levels of L1Md_T, Akt3, Xlr5a, Aldh1a2 and Reg2 after Akt3_L1 CRISPRa. B-E: data are the mean±SEM from three independent experiments. ttests were performed. **P<0.01, ***P<0.001, ns=not significant. F: IGV browser shows ChIP-seq signal tracks for H3K27ac and hMeDIP-seq signaltracks at Akt3_L1 and Aldh1a2_L1. Multi-mapped reads were used for the analyses. A zoom-in view from the virtual-4C showing the interaction ofpromoters of Akt3 and Aldh1a2 to Akt3_L1 and Aldh1a2_L1, respectively. Blue bars indicating the view points, and orange bars indicating the putativeenhancer regions. G: browser view of ELL3 ChIP-seq and 4C data at Aldh1a2, bins on 4C corresponding to Hind III fragments. Multi-mapped readswere used for the analyses.<\/span><\/p>

图2 在原始态mESC中ELL3结合的L1Md_T具有增强子活性(数据修改自参考文献[16])<\/span><\/p>

Fig.2 The ELL3-regulated L1Md_T serve as enhancers in naïve mESC (modified from reference [16])<\/span><\/p>


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4 ELL3-AKT3-ERK调控轴调控干细胞多能性和早期胚胎发育<\/span><\/p>

已有研究表明 , AKT可以在癌症中磷酸化RAF的S259, 并抑制RAF-MEK-ERK通路[18]。为了验证 AKT3上调是否改变原始态 mESC中的 RAFMEK-ERK通路活性 , 我们在不加 MEK/ERK抑制剂PD0325901的培养基中进行mESC培养。结果显示, Ell3 KO mESC中AKT3蛋白以及磷酸化AKT(pAKT1/2/3)水平显著增加, 而p-ERK1/2显著减少(图3A)。这提示Ell3 KO后高水平的AKT3对ERK的磷酸化可能具有抑制作用。为了进一步验证这一观察结果, 我们使用两个独立的shRNA在Ell3 KO细胞中进行Akt3敲低(KD), Western blot结果显示, Akt3 KD可部分恢复RAF S259和p-ERK1/2水平(图3A)。以上结果说明, Ell3 KO导致AKT3转录激活, 进而抑制ERK磷酸化。<\/span><\/p>


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原始态mESC中的ERK处于去磷酸化状态, 而ERK的磷酸化对推动ESC从原始态向始发态的转化至关重要。考虑到ELL3可通过抑制AKT3来促进ERK的磷酸化, 我们进一步探究了ELL3在调节ESC从原始态向始发态的转化中的作用。在FA培养基(Fgf2+ActivinA)中培养ESC, 可诱导细胞从原始态向始发态转变。转录组分析显示Ell3 KO阻碍了一些始发态ESC标志基因(如Pitx2和Grb10)的激活,同时也显著抑制了原始态标志基因(包括Nanog和Esrrb)在原始态向始发态转化过程中的下调(图3B)。这些结果表明ELL3在调控ESC多能性转化过程中发挥重要作用。<\/span><\/p>


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信号转导调节在早期胚胎发育中发挥至关重要的作用[19]。研究发现, AKT信号通路及L1Md_T大约在2细胞(2C)胚胎发育阶段被激活, 而阻断AKT信号通路则会导致早期胚胎发育停滞 [20-21]。这提示ELL3可能通过抑制L1Md_T和AKT3来调节着床前胚胎的 ERK活性 , 参与调控早期胚胎发育。我们分析多种哺乳动物早期胚胎的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据发现, ELL3在不同哺乳动物(人类、恒河猴、小鼠)的合子基因组激活(ZGA)阶段被激活表达(图3C和图3D)。早期胚胎免疫染色结果也显示, 从2C阶段开始胚胎中已有ELL3蛋白的表达(图3E)。为了验证早期胚胎中这些基因的表达是否受ELL3调控, 我们向受精卵注射Ell3的特异性siRNA并进行体外培养, qRT-PCR结果显示, 敲低Ell3可上调L1Md_T和Akt3的表达, 而L1Md_Gf水平保持不变(图3F和图3G)。进一步的免疫荧光实验表明,ELL3缺失的囊胚中AKT3水平增加, 而p-ERK1/2信号水平降低。使用AKT抑制剂MK2206处理囊胚后,成功抑制了AKT的表达, 并观察到ELL3缺失囊胚中的p-ERK1/2水平得到了一定程度的挽救(图3H), 说明ELL3可通过调节AKT3影响早期胚胎发育过程中ERK磷酸化水平。<\/p>

\"LCQ-3.jpg\"/A: Western blot分析显示WT、Ell3 KO和Akt3 KD mESC中AKT1、AKT2、AKT3、p-AKT1/2/3、p-RAF S259、ERK、p-ERK1/2的蛋白水平。所示样品细胞经PD0325901处理以抑制ERK通路。使用GAPDH作为负载对照。B: Alluvial图显示Ell3 KO影响了一部分始发态标志基因的激活上调(红色), 以及FA处理后一些原始态标志基因的下调(蓝色)(左图)。中图显示了受Ell3 KO影响的不同类别基因的功能注释。RNA-seq可视化显示WT和Ell3 KO mESC在FA处理前后Cdhr1、Sycp1、Pitx2、Grb10、Nanog、Esrrb、Stmn3和Pex11b的RNA水平(右图)。分析使用的是唯一映射的reads。C: 折线图显示小鼠卵母细胞(OO)、原核(PN)、2细胞胚胎(2C)、4细胞胚胎(4C)、8细胞胚胎(8C)和卵块(M)中Akt1、Akt2和Akt3的RNA水平变化。D: 折线图显示人类(左图)、恒河猴(中图)和小鼠(右图)卵母细胞、原核、2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎和卵块中ELL3的RNA水平变化。E: 免疫染色显示在小鼠着床前胚胎的不同阶段的ELL3蛋白定位。F、G: 箱线图显示对照组和Ell3 KD的2C胚胎(F)和囊胚(G)中Ell3、L1Md_T、Akt3和L1Md_Gf的RNA水平。H: 免疫染色图像显示对照组和Ell3 KD囊胚中AKT3和p-ERK1/2的水平, 以及MK2206处理可以部分恢复Ell3 KD囊胚中pERK1/2的水平。箱线图显示每组中AKT3和p-ERK1/2的荧光强度(右图)。<\/span><\/p>

A: Western blot analysis showing protein levels of AKT1, AKT2, AKT3, p-AKT1/2/3, p-RAF S259, ERK, p-ERK1/2 in WT, Ell3 KO and Akt3KD mESC. Indicated cells were treated with PD0325901 to inhibit ERK pathway. As a loading control, GAPDH was used. B: alluvial plot showing that Ell3 KO impairs the induction of a subset of the primed signature genes (in red), and the down-regulation of some of the naïve markgenes after FA treatment (in blue) (left panel). Functional annotation of affected genes by Ell3 KO in each class are shown (middle panel). IGVbrowser tracks showing the RNA-seq signals of Cdhr1, Sycp1, Pitx2, Grb10, Nanog, Esrrb, Stmn3 and Pex11b in WT and Ell3 KO mESC beforeand after FA treatment (right panel). Uniquely mapped reads were used for the analysis. C: line graphs showing changes of Akt1, Akt2 and Akt3RNA level in mouse oocyte (OO), pronucleus (PN), 2 cell embryo (2C), 4 cell embryo (4C), 8 cell embryo (8C) and morula (M). D: line graphsshowing changes of ELL3 RNA in human (left panel), rhesus macaque (middle panel) and mouse (right panel) oocyte, pronucleus, 2 cell embryo,4 cell embryo, 8 cell embryo and morula. E: representative immunostaining showing ELL3 localization in murine pre-implantation embryos atdifferent stages. F,G: box plots showing the RNA expression levels of Ell3, L1Md_T, Akt3 and L1Md_Gf in control and Ell3 KD 2C embryos (F)and blastocysts (G). H: representative immunostaining images showing the levels of AKT3 and p-ERK1/2 in control and Ell3 KD blastocystswith or without MK2206 treatment. Box plots of the fluorescence intensity of AKT3 and p-ERK1/2 in each group (right panel).<\/span><\/p>

图3 ELL3对于小鼠ESC和植入前胚胎的ERK适当激活至关重要(数据修改自参考文献[16])<\/span><\/p>

Fig.3 ELL3 is essential for proper ERK activation in both mouse ESC and pre-implantation embryos(modified from reference [16])<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

5 总结与展望<\/span><\/p>

在胚胎干细胞中, 转录延伸因子ELL3是RNAPol II延伸因子家族的成员。ELL3能够与增强子结合, 并调控小鼠胚胎干细胞中RNA Pol II在发育调节基因启动子近端的结合。这种调控作用在干细胞谱系分化中起到重要作用 [17]。在本研究中 ,我们发现ELL3在原始态胚胎干细胞中主要结合在LINE-1转座子 L1Md_T上并招募 SIN3A和 TET1,进而抑制附近基因的转录活性。我们利用三维染色质构象micro-C组学数据及4C分析发现, L1Md_T与相邻基因的启动子存在相互作用, 这提示它们可能作为增强子行使转录调控功能。进一步 , 我们发现ELL3可通过调控L1Md_T上的5hmc修饰和H3K27ac富集水平 , 进而调控其增强子活性。更重要的 , 我们发现 ELL3结合的一个 L1Md_T增强子能够调控Akt3的转录。在ESC和着床前胚胎中 ,抑制 ELL3表达会导致 Akt3的过度激活 , 进而抑制ERK的磷酸化。总之 , 我们的研究发现 , ELL3在ESC中与L1Md_T基因结合, 进而调节邻近基因的表达。特别地 , ELL3通过抑制 Akt3基因上 L1Md_T增强子活性来抑制 Akt3基因的表达 , 进而调节RAF-ERK通路的激活, 从而调控干细胞多能性(图4)。这些研究结果揭示了ELL3在ESC多能性和早期胚胎发育中的关键调节作用。<\/span><\/p>


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转座子是一类能够自主插入到宿主基因组中的DNA序列, 其中LINE-1(L1)转座子的丰度最高。在这项研究中, 我们发现ELL3结合的LINE-1基因具有增强子的功能, 可以调控附近基因的表达。我们还发现, ELL3结合的L1Md_T基因不仅富集有增强子标志物H3K4me1和H3K27ac, 还富集启动子标志H3K4me3。这表明这个区域不仅在转座子的调控中扮演重要角色, 还可在调控附近基因的表达中发挥作用。最近的研究也发现了一类具有增强子活性的启动子[22-24]。因此, 我们的发现为增强子和启动子的研究提供了新的视角。通过调控LINE-1基因, ELL3为宿主基因组提供了一种新的转录调控层次。这对于我们深入了解干细胞谱系分化的分子机制, 揭示基因调控网络的复杂性和多样性, 探索细胞信号转导通路的调控机制和生物学过程具有重要意义。此外, 这项研究还有助于推动干细胞研究和应用的发展, 为干细胞领域的进一步研究和临床应用提供了重要的基础和指导。<\/span><\/p>

\"LCQ-4.jpg\"/<\/span><\/p>

ELL3结合的L1Md_T作为增强子与附近基因如Akt3相互作用并调控其表达。ELL3缺失导致L1Md_T上5hmC修饰减少, H3K27ac富集增加, 从而导致L1Md_T附近基因, 包括Akt3的异常激活。ELL3缺失后AKT3的异常激活抑制了ERK的活性, 从而阻碍原始态–始发态多能性转化。<\/span><\/p>

ELL3 bound L1Md_T serve as enhancers that facilitate physical interaction and activation of neighboring genes, such as Akt3. Depletion of ELL3 leadsto a decrease in 5hmC levels, an increase in H3K27ac levels, and up-regulation of nearby genes including Akt3. The aberrant activation of AKT3 following ELL3 depletion inhibits ERK activity and hinders the transition from naïve to primed pluripotency.<\/span><\/p>

图4 ELL3通过L1Md_T-AKT3-ERK途径调节原始态–始发态转变的分子机制模型(数据修改自参考文献[16])<\/span><\/p>

Fig.4 Model showing how ELL3 affects naïve-primed transition via its connection to the L1Md_T-AKT3-ERK pathway(modified from reference [16])<\/span><\/p>


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参考文献 (References)<\/span><\/p>

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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/23-12-01-16-28-00-852.jpg","cshort":"

林承棋, 东南大学二级教授、青年首席教授、博士生导师。中组部海外高层次人才引进计划青年项目获得者, 国家重点研发计划项目首席科学家, 科技部中青年科技创新领军人才获得者, 国家万人计划获得者。主要研究方向: (1) 基因\r\n表达调控机制; (2) 细胞命运决定与早期胚胎发育调控。在Cell、Nat Cell Biol、\r\nMol Cell、Cell Death Differ、Genes Dev、Sci Adv<\/em>等杂志上发表SCI论文30余篇,\r\n文章被引用4 000余次。曾获新加坡国家医学研究理事会(NMRC)转化与临床研究、新加坡卫生部物医药研究理事会(BMRC)项目、江苏省杰出青年基金、江苏省“双创人才“等多项基金资助。<\/p>","cshort2":"
<\/span>\"1.jpg\"<\/td>

林承棋, 东南大学二级教授、青年首席教授、博士生导师。中组部海外高层次人才引进计划青年项目获得者, 国家重点研发计划项目首席科学家, 科技部中青年科技创新领军人才获得者, 国家万人计划获得者。主要研究方向: (1) 基因表达调控机制; (2) 细胞命运决定与早期胚胎发育调控。在Cell、Nat Cell Biol、Mol Cell、Cell Death Differ、Genes Dev、Sci Adv<\/em>等杂志上发表SCI论文30余篇,文章被引用4 000余次。曾获新加坡国家医学研究理事会(NMRC)转化与临床研究、新加坡卫生部物医药研究理事会(BMRC)项目、江苏省杰出青年基金、江苏省“双创人才“等多项基金资助。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"ELL3结合的LINE-1作为增强子调控小鼠胚胎干细胞原始多能性","listseq":99,"seqno":"99","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"23-12-12-10-08-37-788"},{"caddress1":"(细胞生物学国家重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/中国科学院上海生物化学与细胞生物学 研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)","cauthor":"王超雄 郑培宣 赵允*","cintpic":"Upload/qianyan/23-12-04-16-52-47-357.pdf","clicktime":798,"clong1":"

   <\/p>


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病理激活的中性粒细胞上表达的CD300ld参与肿瘤免疫抑制<\/strong><\/p>

王超雄 郑培宣 赵允*<\/p>

(细胞生物学国家重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/中国科学院上海生物化学与细胞生物学\r\n研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)<\/p>


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       <\/strong><\/p>

       [摘要]<\/strong>   通过靶向免疫检查点分子进而增强免疫效应细胞的肿瘤细胞杀伤能力是近年来肿\r\n瘤治疗领域的重大突破。然而, 肿瘤内部高度免疫抑制性的肿瘤微环境使得现有的免疫检查点阻断疗法效果不佳。肿瘤的微环境高度异质, 而大量浸润的髓系细胞在免疫抑制微环境的建立上发挥关键作用, 其中病理激活的中性粒细胞[也被称为多形核髓系来源的抑制细胞(polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell, PMN-MDSC)]是微环境的重要组分。不同于正常的\r\n中性粒细胞, PMN-MDSC具有强烈的抑制淋巴细胞杀伤功能的作用。因此, 寻找特异且高效地\r\n阻断PMN-MDSC的靶点是当前免疫治疗研究中的热点。该文总结了该团队发现PMN-MDSC上\r\n表达的膜蛋白CD300ld参与肿瘤发展的过程, 并详细描述了CD300ld通过下游S100A8/A9发挥功\r\n能的信号转导机制。靶向CD300ld有可能成为一种有潜力的肿瘤治疗手段, 为后续的免疫治疗提供了新思路。<\/p>

       [关键词]<\/strong>   免疫检查点阻断疗法; 肿瘤微环境; PMN-MDSC; CD300ld<\/p>


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国家自然科学基金(批准号: 32270137、32130025、32293232)和国家重点研发计划(批准号: 2020YFA0509000)资助的课题 
<\/p>

*通讯作者。Tel: 021-54921618, E-mail: yunzhao@sibcb.ac.cn <\/p>

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.32270137, 32130025, 32293232) and the National Key Research and \r\nDevelopment Program of China (Grant No.2020YFA0509000) <\/p>

*Corresponding author. Tel: +86-21-54921618, E-mail: yunzhao@sibcb.ac.cn<\/p>


<\/p>

The CD300ld Receptor on Pathologically Activated Neutrophils is Required \r\nfor Tumor-Driven Immune Suppression<\/strong><\/p>

WANG Chaoxiong, ZHENG Peixuan, ZHAO Yun*<\/p>

(State Key Laboratory of Cell Biology, Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry \r\nand Cell Biology, <\/p>

Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)<\/p>


<\/p>

        [Abstract]<\/strong>    Targeting immune checkpoint proteins to enhance the cytotoxic ability of immune effector cells \r\nrepresents a breakthrough in cancer therapy and has achieved promising results in clinical treatments. However, a \r\nsignificant proportion of cancer patients do not respond to existing immune checkpoint inhibitor therapy due to the \r\nhighly immunosuppressive tumor microenvironment. This microenvironment is heterogeneous, and myeloid cells \r\nplay a key role in its establishment, particularly pathologically activated neutrophil, also known as PMN-MDSC \r\n(polymorphonuclear myeloid-derived suppressive cell), which is recognized as the major immune suppressor. Unlike normal neutrophils, PMN-MDSC has a strong suppressive ability to lymphocytes. Therefore, identifying specific and effective targets to block PMN-MDSC in the tumor microenvironment is an important avenue of immunotherapy research. This article summarizes the team’s discovery of the membrane protein CD300ld expressed on \r\nPMN-MDSC involved in tumor development, and describes in detail the signal transduction mechanism by which \r\nCD300ld functions through downstream S100A8/A9. Targeting CD300ld may potentially become a promising tumor treatment approach, providing new insights for subsequent immunotherapy.<\/p>

        [Keywords]   <\/strong> immune checkpoint therapy; tumor microenvironment; PMN-MDSC; CD300ld<\/p>


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1 PMN-MDSC是肿瘤免疫治疗中重要的抑制性细胞<\/strong><\/p>

       肿瘤免疫治疗是癌症治疗领域革命性的进展, \r\n免疫治疗明显提高了临床肿瘤治疗的效果, 并显著\r\n延长了癌症患者的生存期[1-2]<\/sup>。但即便如此, 现阶段\r\n肿瘤免疫治疗存在的问题仍然需要获得持续广泛\r\n的关注, 其中最引人瞩目的问题和挑战就是免疫检\r\n查点阻断疗法仅对部分癌种中的部分患者响应, 这\r\n极大地限制了免疫检查点阻断疗法的适用范围[3]<\/sup>。\r\n而大量的实验和临床数据显示, 高度免疫抑制性的\r\n肿瘤微环境是造成癌症患者不响应或部分响应检\r\n查点抑制剂的重要原因[4-5]<\/sup>。抑制性的肿瘤微环境\r\n会导致具有杀伤能力的免疫效应细胞 (如 T细胞和\r\nNK细胞)很难存留在肿瘤中, 即使存在于肿瘤当中\r\n其活性也会被大幅度抑制, 其通常会处于耗竭或失\r\n活的状态从而无法发挥杀伤肿瘤的功能[6]<\/sup>。因此寻\r\n找新的靶向分子从而改善肿瘤的免疫微环境是目\r\n前肿瘤免疫治疗领域的重大挑战。 <\/p>

      借助单细胞测序、单细胞成像系统以及质谱\r\n细胞分析等技术 , 肿瘤微环境的复杂性正在逐步\r\n被揭示[7]<\/sup>, 而其中的一类关键细胞: 病理激活的中\r\n性粒细胞[也被称为多形核髓系来源的抑制细胞\r\n(polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell, \r\nPMN-MDSC)]引起了大家的广泛关注。作为机体\r\n的第一道防线, 中性粒细胞在天然免疫中发挥着重\r\n要且关键的作用[8]<\/sup>, 但在肿瘤负荷的情况下, 这群细\r\n胞的状态发生转变 , 从免疫激活转变为免疫抑制 , \r\n主要起抑制T淋巴细胞活化的作用, 并参与到肿瘤\r\n发展的各个阶段[7,9-10]<\/sup>。但由于这群细胞本身的特性\r\n(半衰期很短, 通常不到24小时, 且成熟后无法继续\r\n增殖), 使得研究者对PMN-MDSC本身的复杂性缺\r\n乏足够认识, 中性粒细胞转化成PMN-MDSC的确切\r\n机制仍不是特别清楚, 在临床环境中准确地鉴定和\r\n分析PMN-MDSC的标准有待建立[11]<\/sup>。因此, 探究中\r\n性粒细胞与PMN-MDSC的分化途径, 并针对其在肿\r\n瘤中的募集和抑制功能寻找特异且安全的靶点, 是\r\n目前亟待解决的关键问题。<\/p>


<\/p>

2 通过筛选鉴定出CD300ld参与肿瘤进程 <\/strong><\/p>

      如前所述, 肿瘤中浸润的髓系细胞深度参与肿瘤进程, 同时由于膜蛋白具有良好的靶向性和成药\r\n性, 因此我们希望筛选到表达在髓系细胞上的并且\r\n在肿瘤的发生过程中起到关键作用的膜蛋白。为此\r\n我们设计了一套基于CRISPR-Cas9的体内筛选系统, 基于这样的筛选体系, 我们发现了一个之前未被报\r\n道的膜蛋白CD300ld[12-13]<\/sup>。CD300ld是一类单次跨膜\r\n蛋白, 隶属于CD300蛋白家族, 之前被报道可能是小\r\n鼠诺如病毒入侵细胞的靶点, 并且可能参与中性粒\r\n细胞的活化过程; 但在肿瘤的发生过程中, CD300ld\r\n的功能还未被研究。我们的检测发现, CD300ld主要\r\n在中性粒细胞中高表达, 并且在荷瘤后产生的PMN-MDSC中上调表达, 这表明CD300ld可能参与肿瘤进程[14]<\/sup>。 <\/p>

      为了进一步阐明 CD300ld在肿瘤进展中的作\r\n用, 我们制备了全身性CD300ld基因敲除小鼠, 随后在野生型小鼠和CD300ld缺失小鼠上皮下接种了\r\n黑色素瘤细胞, 并分析了肿瘤的生长速度。令人惊讶的是, CD300ld基因缺失小鼠中的肿瘤生长速度\r\n要明显慢于野生型小鼠, 同时在多种肿瘤模型中我\r\n们都看到了这一现象。此外, 我们还尝试在不同基\r\n因型的小鼠中构建了原发性肝癌模型, 结果也显示CD300ld基因缺失小鼠有更少的肿瘤负荷和更长的\r\n生存时间, 这证实CD300ld可能是重要的免疫抑制基因[14]<\/sup>。 <\/p>

      为了探究 CD300ld是通过何种细胞影响肿瘤\r\n进程的 , 我们首先采用骨髓移植后对小鼠再荷瘤的方法 , 证明了免疫系统中表达的CD300ld在肿\r\n瘤生长中起关键作用。随后 , 我们构建了条件性\r\nCD300ld基因敲除小鼠, 使其分别与Lyz2-Cre小鼠和S100A8-Cre小鼠杂交 , 得到了在髓系细胞和中性粒细胞中特异性敲除CD300ld的小鼠, 随后的成\r\n瘤实验以及后续抗体清除实验也进一步证实, 中性\r\n粒细胞中表达的CD300ld对肿瘤进程尤为关键[14]<\/sup>。<\/p>


<\/p>

3 CD300ld的缺失减弱了肿瘤微环境的\r\n免疫抑制特性<\/strong><\/p>

      由于PMN-MDSC是肿瘤免疫微环境的组成成\r\n分, 发挥重要的免疫抑制作用, 在确定了CD300ld\r\n的缺失会通过一种PMN-MDSC依赖的方式抑制肿瘤进展之后, 我们想进一步探究CD300ld的缺失对\r\n肿瘤微环境的影响。通过流式染色的分析, 我们发现CD300ld基因缺失小鼠的肿瘤中有更少的PMN\u0002MDSC的积累, 同时CD4阳性T细胞、CD8阳性T细\r\n胞和NK细胞等免疫效应细胞的数量明显增加, 随后\r\n的免疫荧光染色结果也支持了这一观点。为了更加深刻地揭示CD300ld缺失对整个肿瘤微环境的影响, 我们将野生型和CD300ld基因缺失小鼠肿瘤中的免疫细胞分选出来进行了单细胞测序, 随后我们获得了与之前类似的结果, CD300ld基因缺失小鼠肿瘤中促进肿瘤生长的免疫抑制性细胞在整个免疫细胞中的比例整体减小, 而抑制肿瘤的细胞比例则整体增\r\n加, 这表明CD300ld的缺失重塑了肿瘤微环境, 大大减弱了肿瘤微环境的免疫抑制特性[14]<\/sup>。<\/p>


<\/p>

4 CD300ld影响PMN-MDSC的迁移和抑制功能<\/strong><\/p>

      为了探究PMN-MDSC中CD300ld信号通过何种分子机制影响肿瘤进程, 我们对野生型和CD300ld基因缺失小鼠的PMN-MDSC进行了转录组测序, 我们发现CD300ld基因缺失小鼠的PMN-MDSC中与中性粒细胞招募和趋化相关的信号通路涉及的基因明显下调表达, 这提示CD300ld可能影响了PMN-MDSC的迁移能力。随后我们利用经典的Transwell实验和更能模拟生理状态的体内迁移实验证实了这一点, 即CD300ld缺失的PMN-MDSC被募集到肿瘤的能力较野生型更弱。由于PMN-MDSC在肿瘤中的重要功能之一就是参与免疫抑制, 因此我们也想探究CD300ld是否也能调控PMN-MDSC的免疫抑制活性, 通过T细胞增殖的抑制实验, 我们证实, 相较于野生型来说, CD300ld缺失的PMN-MDSC对T细胞的抑制能力明显下降[14]<\/sup>。<\/p>

      为了揭示CD300ld下游更加具体的分子机制, \r\n通过进一步分析转录组测序数据 , 我们找到了一对在中性粒细胞中发挥关键作用的蛋白S100A8和S100A9。S100A8/A9是中性粒细胞特异性表达的一类钙连蛋白, 通常会形成异源二聚体参与细胞进程, \r\n并且被报道在中性粒细胞的迁移和活化过程中发挥\r\n重要作用[15-16]<\/sup>。我们首先证实CD300ld基因缺失小鼠中确实有更低的S100A8/A9蛋白表达水平, 随后通过回补该蛋白或者加入抑制剂的方式, 证实CD300ld通过影响S100A8/A9蛋白的表达进而影响PMN-MDSC\r\n的迁移和抑制能力[14]<\/sup>。<\/p>


<\/p>

5 靶向CD300ld能延缓肿瘤进程<\/strong><\/p>

      为了进一步探究CD300ld作为药物靶点的潜力 , 我们构建了时间可控的条件性敲除CD300ld基因的小鼠。我们发现在肿瘤已经成型后再去敲除这一基因仍然能够抑制肿瘤的进程。由于CD300ld是一类单次跨膜蛋白, 因此我们猜测如果将其蛋白胞外区纯化出来打入荷瘤小鼠体内, 过量\r\n的可溶性蛋白胞外区(extracellular domain, ECD)就可以竞争性地结合CD300ld潜在的配体, 从而阻断CD300ld识别潜在的配体, 模拟CD300ld缺失的效果, 达到延缓肿瘤进程的效果。随后的结果也证实了我们的猜测, 在多种肿瘤模型当中CD300ld蛋白胞外区展现出了非常好的抗肿瘤效果, 更令人兴奋的是, CD300ld蛋白胞外区与PD-1抗体疗法产生了明显的协同效应[14]<\/sup>。<\/p>

      在通过一系列的小鼠和细胞实验证实在小鼠中CD300ld影响PMN-MDSC的迁移能力和免疫抑制活性, 靶向CD300ld显示了非常好的抗肿瘤效果之后, \r\n我们想进一步探究人中的CD300LD是否具有与小鼠中CD300ld类似的功能。我们发现, 与小鼠中的表达情况相类似, 人的CD300LD主要在中性粒细胞中高表达, 同时肿瘤患者外周血中的CD300LD表达水平明显高于健康人。同时, 对数据库进行进一步分析后我们发现, 在大部分癌种中, CD300LD的表达量都要高于正常组织, 同时在黑色素瘤病人当中, \r\nCD300LD表达量高的病人有更短的生存期。为了\r\n进一步分析人CD300LD的功能, 我们构建了人源化CD300ld小鼠, 成瘤实验表明人源化CD300ld小鼠中肿瘤生长速度与野生型小鼠没有明显差异, 同时在人源化小鼠中, 人CD300LD的蛋白胞外区也表现出\r\n了非常好的抗肿瘤效果。这表明人CD300LD与小鼠CD300ld具有功能上的保守性, 靶向CD300LD是一种有潜力的治疗肿瘤的方式[14]<\/sup>。<\/p>


<\/p>

6 总结与展望<\/strong><\/p>

      在此项研究中, 我们筛选并鉴定出了一种在中性粒细胞或PMN-MDSC中特异性高表达的膜蛋白分子CD300ld, 并且该分子深度参与了肿瘤进程。当CD300ld存在时, 其会介导下游S100A8/A9蛋白的表达, 从而促进PMN-MDSC的迁移, 使得肿瘤中有更多浸润的PMN-MDSC; 此外, 激活的CD300ld还可以通过下游S100A8/A9影响PMN-MDSC的免疫抑制活性, 使得PMN-MDSC的免疫抑制活性更强。更强的免疫抑制活性也使得肿瘤浸润的杀伤性CD8阳性T细胞数量大为减少, 最终表现出来的结果是促进肿瘤进程。而当我们敲除CD300ld或者使用药物阻断相应的信号通路之后, PMN-MDSC的迁移能力降低, \r\n其免疫抑制的活性也降低, 最终使得肿瘤微环境的免疫抑制能力大幅降低, 同时使得CD8阳性T细胞的浸润增加, 最终使得肿瘤生长变缓(图1)。CD300ld的发现为后续的肿瘤治疗和药物研发提供了新思路, 可能会对将来的免疫治疗产生积极的影响。<\/p>

\"图1-赵允.png\"/<\/p>


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图1 CD300ld作为PMN-MDSC上的抑制分子参与肿瘤介导的免疫抑制(根据参考文献[14]修改) <\/strong><\/p>

Fig.1 CD300ld is involved in tumor-driven immune suppression as an immune suppressor \r\non PMN-MDSCs (modified from the reference [14])<\/strong><\/p>


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参考文献 (References)<\/strong><\/p>

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赵允, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)二\r\n级研究员, 副主任(副所长), 细胞生物学国家重点实验室副主任, 中国科学院特聘\r\n核心骨干研究员, 上海科技大学特聘教授, 中国科学院大学杭州高等研究院双聘\r\n教授, 国家重点研发计划首席科学家。1992年于山东大学微生物系微生物学专\r\n业毕业, 获理学学士学位; 2001年于北京大学生命科学学院分子细胞生物学专业\r\n毕业, 获理学博士学位; 2001—2004年在美国哈佛大学医学院从事博士后研究工\r\n作; 2004—2008年在美国德州大学西南医学中心从事博士后研究工作。2008年\r\n6月起任中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所(现中国\r\n科学院分子细胞科学卓越创新中心)研究员, 研究组长。赵允研究员长期致力于\r\n细胞内信号转导研究, 尤其关注信号通路的异常与疾病发生的分子基础, 取得了一系列原创性科学发现, 在Nature<\/em>、Dev Cell<\/em>、Nat Metab<\/em>、Nat Commun<\/em>和PLoS\r\nBiol<\/em>等学术期刊上发表了90余篇研究论文。近年来赵允研究员聚焦于肿瘤浸润免疫细胞与肿瘤免疫治疗的基础研究, 取得了一系列进展。<\/p>","cshort2":"
<\/span>\"赵允2.jpg\"/<\/td>

赵允, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)二级研究员, 副主任(副所长), 细胞生物学国家重点实验室副主任, 中国科学院特聘 核心骨干研究员, 上海科技大学特聘教授, 中国科学院大学杭州高等研究院双聘 教授, 国家重点研发计划首席科学家。1992年于山东大学微生物系微生物学专 业毕业, 获理学学士学位; 2001年于北京大学生命科学学院分子细胞生物学专业 毕业, 获理学博士学位; 2001—2004年在美国哈佛大学医学院从事博士后研究工 作; 2004—2008年在美国德州大学西南医学中心从事博士后研究工作。2008年 6月起任中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所(现中国 科学院分子细胞科学卓越创新中心)研究员, 研究组长。赵允研究员长期致力于 细胞内信号转导研究, 尤其关注信号通路的异常与疾病发生的分子基础, 取得了一系列原创性科学发现, 在<\/span>Nature<\/em>、<\/span>Dev Cell<\/em>、<\/span>Nat Metab<\/em>、<\/span>Nat Commun<\/em>和<\/span>PLoS Biol<\/em>等学术期刊上发表了90余篇研究论文。近年来赵允研究员聚焦于肿瘤浸润免疫细胞与肿瘤免疫治疗的基础研究, 取得了一系列进展。<\/span><\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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氨基酸信号通过抑制SIRT4调控细胞氨脱毒<\/span><\/p>

胡颂华 冯雨阳 徐薇 赵世民*<\/span><\/p>

(复旦大学附属妇产科医院/生物医学研究院, 上海 200032)<\/span><\/p>


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【摘要】氨基酸是细胞主要的能源物质之一。然而, 氨基酸在代谢过程中产生的氨具有很强的神经毒性, 因此其需要在肝脏中被转化成尿素排出体外。已有的研究表明, 氨的清除主要是通过尿素循环(又称鸟氨酸循环)来完成的, 然而这一代谢通路是如何基于细胞内氨基酸水平的变化来被精确调控目前仍不清楚。该团队发现, 线粒体中的SIRT4会作为一个去氨甲酰化酶响应细胞内氨基酸水平的变化来调控氨的清除。机制上, 氨基酸代谢产生的氨甲酰磷酸(CP)会通过修饰尿素循环代谢酶(ornithine transcarbamylase, OTC)的307位赖氨酸来激活OTC的酶活, 促进氨的清除。当感知到氨基酸不足时, 细胞会通过GCN2-Eif2A-ATF4信号通路上调SIRT4的表达, 进而去除OTC上的氨甲酰化修饰, 关闭尿素循环。针对这一调控机制, 该团队发现敲除Sirt4会降低小鼠的血氨水平并且改善四氯化碳诱导的肝性脑病。该研究揭示SIRT4是细胞内氨解毒的一个新的调控因子, 且SIRT4有望成为肝性脑病的一个新的干预靶点。<\/p>


<\/span><\/p>

【关键词】 SIRT4; 氨甲酰化修饰; 尿素循环; 氨基酸代谢<\/p>


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Amino Acid Downregulate SIRT4 to Detoxify Ammonia<\/span><\/p>

HU Songhua, FENG Yuyang, XU Wei, ZHAO Shimin*<\/span><\/p>

<\/span><\/p>

(Institutes of Biomedical Sciences, the Obstetrics & Gynaecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200032, China)<\/span><\/p>

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【Abstract】 Amino acids are one of the major sources of cellular energy, yet ammonia produced from amino acid catabolism has serious neurotoxicity. The urea cycle (ornithine cycle) is the primary metabolic pathway in\u0002volved in ammonia detoxification, but the processes underlying the regulation of ammonia removal by amino acids rmain unclear. SIRT4 acts as a decarbamylase that responds to amino acid sufficiency and regulates ammonia removal. Mechanistically, amino acids-derived CP (carbamoyl phosphate) promotes lysine 307 carbamylation (OTC K307-CP) of OTC (ornithine transcarbamylase), which activates OTC and the urea cycle. SIRT4 expression was transcriptionally upregulated by the amino acid insufficiency-activated GCN2-Eif2A-ATF4 axis, leading to decarbamylation of OTC and inactivation of urea cycle. Based on this mechanism, Sirt4 ablation decreased mouse blood ammonia levels and ameliorated CCl4-induced hepatic encephalopathy phenotypes. This study uncovers a novel role of SIRT4 in ammonia detoxification, which could be harnessed to develop a new strategy to cure hepatic encephalopathy.<\/p>


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【Keywords】SIRT4; carbamylation; urea cycle; amino acid metabolism<\/p>


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1 尿素循环与氨甲酰化修饰<\/span><\/p>

氨基酸的氧化脱氨在具有双层膜包裹的线粒体内进行, 以防止氨泄露到细胞质及其他亚细胞器中, 降低氨对细胞的毒性。氨的解毒主要在肝脏中进行: 肝脏的线粒体中高表达一种叫氨甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl phosphate synthetase 1, CPS1)的催化酶, 其可将氨基酸氧化脱下的氨迅速转化为毒性较低的氨甲酰磷酸 (carbamoyl phosphate, CP)。接下来 , CP会通过鸟氨酸氨甲酰基转移酶 (orni\u0002thine transcarbamylase, OTC)进入尿素循环 (urea cycle)生成尿素将氨排出体外[2-3]。同时, CP也可以作为核苷酸从头合成的原料, 参与细胞周期和细胞分裂过程[4]。CP具有很强的反应活性, 可自发与赖氨酸的末端氨基(ɛ氨基)反应生成赖氨酸氨甲酰修饰(lysine carbamylation, CP-K)[5]。CP-K也许是自然界中最为重要的一种蛋白质翻译后修饰 , 因为光合作用依赖的羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase, RuBisCO)依赖于CP-K的激活[6]。在人体中, CP-K也同样具有重要的生理与病理意义。有研究表明皮肤中胶原蛋白的氨甲酰化水平会随着衰老的进程而升高, 因此蛋白质的氨甲酰化修饰也被认为是一种新的衰老标志物[7-8]。此外, 有大量的研究报道在一些肾脏疾病中蛋白质的氨甲酰化修饰的水平也是升高的, 因此氨甲酰化修饰同样可以作为疾病的标志物[9-11], 然而CP-K在哺乳动物中的生理功能是什么目前仍不清楚。尤其是, CP-K与细胞代谢之间是否存在联系以及这一翻译后修饰是否可逆这些重要的科学问题仍未得到很好的回答。
<\/p>


<\/p>

2 细胞内氨甲酰修饰水平受到氨基酸水平与SIRT4蛋白的共同调控<\/span><\/p>

由于氨基酸分解代谢产生CP可以自发修饰蛋白形成CP-K(图1A), 因此为了探究细胞内CP-K的水平是否受到细胞内氨基酸水平的影响, 我们对细胞进行了氨基酸饥饿处理, 结果显示无论是单独缺乏谷氨酰胺还是全氨基酸饥饿处理都能显著降低细胞内CP-K水平(图1B)。氨基酸的氧化脱氨主要是在线粒体中进行的, 我们发现氨基酸饥饿导致的CP-K水平降低在线粒体中更为显著, 这说明线粒体中CP-K水平的确与氨基酸的分解代谢密切相关。Sirtuin蛋白是一类以NAD+为底物的蛋白质去修饰酶家族, 这一类去修饰酶会通过去除蛋白质赖氨酸上的翻译后修饰来影响蛋白的功能从而调控细胞内一系列的生理过程[12-14]。为了探究蛋白上CP-K是否可以被线粒体中的sirtuin蛋白去除, 我们分别在细胞中过表达了三种定位于线粒体的sirtuin蛋白—SIRT3~5, 结果显示只有过表达SIRT4可以降低线粒体内的CP-K水平, 提示SIRT4或许是CP-K的去修饰酶(图1C)。进一步, 我们纯化了SIRT4蛋白并通过体外实验验证了SIRT4去修饰酶活, 并且我们发现相比较于其他几个已知的去修饰底物, 包括之前报道的乙酰化(Ac\u0002K)[15]、硫辛酰化(Lipoyl-K)[16]以及羟甲基戊二酰化(HMG-K)[17]修饰, SIRT4具有更强的去氨甲酰化修饰的活性(图1和表1)。<\/p>

\"领域前沿-1.jpg\"/<\/span><\/p>

A: CP修饰蛋白质赖氨酸残基形成CP-K的示意图。B: 氨基酸饥饿降低细胞内的CP-K水平。HepG2细胞分别用Glutamine缺乏培养基和全氨基酸缺乏培养基处理4 h, 然后分离线粒体和胞质并用Western blot检测不同细胞组分中CP-K的水平。C: 过表达SIRT4降低细胞内CP-K水平。细胞分别转染SIRT3、SIRT4和SIRT5 48 h之后分离线粒体并检测CP-K的水平。D: SIRT4去除蛋白质上CP-K的示意图。<\/span><\/p>

A: schematic diagram of nonenzymatic carbamylation between carbamoyl phosphate and ɛ-amine of lysine. B: amino acid starvation decreases mitochondrial CP-K levels. CP-K levels in whole-cell lysates, mitochondria, and cytoplasm of HepG2 cells, with or without glutamine or total amino acid starvation for 4 h. C: SIRT4 overexpression decreases mitochondrial CP-K levels. CP-K levels of mitochondrial proteins were detected in HepG2 cells and HepG2 cells overexpressing SIRT3, SIRT4, or SIRT5. D: schematic illustration of NAD+-dependent decarbamylation catalysed by SIRT4.<\/span><\/p>

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图1 氨甲酰化修饰是一种动态可逆的翻译后修饰 (数据修改自参考文献[1]) <\/span><\/p>

Fig.1 Carbamylation is a reversible posttranslational modification (modified from reference [1])<\/span><\/p>


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\"1.jpg\"/<\/p>

3 SIRT4调控OTC和尿素循环<\/span><\/p>

为了探究 CP-K的生理功能 , 我们利用蛋白组学和代谢组学去寻找可能受到CP-K和 SIRT4调控的底物蛋白以及代谢通路。首先, 我们用 CP-K的抗体和定量分析质谱在小鼠肝脏中鉴定到142个存在CP-K修饰的蛋白; 接下来, 我们利用BIO-ID(邻近蛋白标记技术 )在小鼠肝细胞中鉴定到 135个与SIRT4存在相互作用的蛋白。我们发现一共有22个蛋白同时存在于这两个集合当中, 说明这些蛋白上不仅存在CP-K修饰, 并且其很可能会受到SIRT4的调控, 而这其中很大一部分都是定位于线粒体的代谢酶, 包括GDH、GOT2和OTC等(图2A)。最后, 为了进一步缩小筛选范围, 我们对WT和Sirt4 KO小鼠肝脏进行了代谢组学实验, 通过对差异代谢物进行通路富集分析, 我们发现尿素循环这个代谢通路改变最为显著(图2B), 而我们通过蛋白组学筛选到的其中一个代谢酶OTC也是属于这一代谢通路, 这些实验结果提示 SIRT4有可能会通过去除 OTC上的CP-K修饰并改变OTC的酶活来调控整个尿素循环。利用LC-MS/MS去靶向检测尿素循环代谢物, 我们发现所有尿素循环中间代谢物在Sirt4 KO小鼠肝脏中的水平都是升高的(图2C和图2D)。这说明SIRT4可能会通过去除OTC上的CP-K修饰来调控尿素循环。<\/span>
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\"领域前沿-2.jpg\"/<\/span><\/p>

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A: K-CP修饰蛋白组和SIRT4互作蛋白组中共同鉴定到的蛋白。B: 对WT和Sirt4 KO小鼠肝脏中差异代谢物(P<0.05, FC>2)进行通路富集分析并以气泡图的形式进行展示。通路影响因子表示鉴定到的差异代谢物数量占该通路中所有代谢物总和的百分比。C: Sirt4 KO小鼠肝脏中尿素循环中间代谢产物水平升高。所有数据均以x_±s形式表示, 采用One/Two-Way ANOVA检验(*P<0.05, ***P<0.001)。D: 尿素循环代谢通路示意图。<\/span><\/p>

A: co-identified proteins in the K-CP proteome and the SIRT4 interactome. B: the metabolites (P<0.05, FC>2) in the liver of WT and Sirt4 KO mice were analyzed via pathway enrichment and displayed in the form of bubble map. Pathway impact is a measure for the percentage of metabolites that measured in a given pathway. C: the intermediate metabolites of urea cycle were increased in the liver of Sirt4 KO mice. Data are presented in the x_±s form, and significance was calculated using a One/Two-Way ANOVA test (*P<0.05, ***P<0.001). D: schematic diagram of the urea-cycle metabolism pathway.<\/span><\/p>

图2 SIRT4调控OTC和尿素循环(数据修改自参考文献[1])<\/span><\/p>

Fig.2 OTC and urea cycle are regulated by SIRT4 (modified from reference [1])<\/span><\/p>


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4 SIRT4通过去除OTC K307位点上的氨甲酰化修饰(OTC K307-CP)调控尿素循环<\/span><\/p>

通过一系列的细胞生化实验, 我们发现CP会修饰OTC的K307位点并促进OTC的酶活, 因此, 氨基酸代谢产生的CP不仅仅是作为OTC的底物, 还会作为一种信号分子通过直接修饰OTC蛋白来调控蛋白的酶活。这说明当氨基酸的分解代谢旺盛时, 由氨代谢产生的CP会通过变构激活的方式来激活尿素循环从而促进氨的清除。与之相对应的是, SIRT4则会以 NAD+依赖的方式去除该位点上的 CP-K修饰抑制OTC的酶活从而关闭尿素循环。此外, 我们发现SIRT4的转录水平还会受到细胞内氨基酸水平的调控, 因此, 当感知到氨基酸不足时, 细胞会通过GCN2-Eif2A-ATF4信号通路上调SIRT4的表达以减少尿素的生成(图3)。最后, 为了探究SIRT4调控尿素循环的生理意义, 我们利用CRISPR-Cas9构建了Sirt4敲除小鼠, 我们发现Sirt4 KO小鼠血氨浓度要低于WT小鼠。进一步, 我们通过腹腔注射CCl4的方式构建了肝性脑病小鼠模型[18], 发现敲除Sirt4会降低小鼠的血氨水平, 并且改善CCl4诱导的肝性脑病。<\/span><\/p>

\"领域前沿-3.jpg\"/<\/p>

图3 SIRT4去除OTC K307-CP并调控尿素循环<\/span><\/p>

Fig.3 SIRT4 regulates urea cycle via decarbamylation of OTC K307-CP<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

5 总结与展望<\/span>
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作为细胞内重要的营养物质, 氨基酸最主要的生理功能是为蛋白质、核苷酸等生物大分子的合成提供原料(building blocks)。然而在特定的生理情况下, 例如长时间的饥饿处理, 氨基酸也可以作为一种能源物质被动员起来去为细胞提供能量, 而这一过程则会以产生有毒的氨作为代价。在细胞中, 这些有毒的氨需要及时通过尿素循环生成尿素排出体外, 否则氨的累积将会造成细胞毒性。尽管如此, 选择氨基酸作为能源物质依然不是一种经济的选择, 因为将游离氨以尿素的形式排出会造成细胞内氮源的流失。因此, 氨的代谢去路应该根据细胞内氨基酸的丰度以及利用程度而被精确调控。本研究发现当氨基酸的分解代谢旺盛时, 由氨代谢产生的CP会通过变构激活的方式来激活尿素循环, 促进氨脱毒; 当感知氨基酸不足时, 细胞会上调SIRT4表达去除OTC上的CP-K修饰关闭尿素循环。这一调控的生理意义可能在于: 当细胞感知到氨基酸不足时, 细胞会尽可能利用有限的氮源, 包括有毒的氨。有研究表明, CP可以直接作为底物参与嘧啶核苷酸的合成[4], 这提示当OTC的活性被抑制之后, 由氨代谢而来的CP可能会直接参与核苷酸等生物大分子的合成。<\/span><\/p>


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除此之外, 这一调控机制同样具有十分重要的病理意义。在一些肝功能损伤的疾病(例如肝硬化)当中, 血液中氨水平的异常升高会引起高氨血症(又称尿素循环代谢病), 最终造成中枢神经系统功能障碍, 例如脑水肿和脑疝[19-21]。肝癌病人经常发生由于肝脏氨排毒功能障碍导致的高血氨症, 直接威胁病人生命。因此, 阐明肝脏的氨脱毒机制具有重要的理论与临床转化价值。<\/span><\/p>


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参考文献 (References)<\/span><\/p>

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赵世民, 复旦大学附属妇产科医院教授、博士生导师, 主要研究营养代谢物失调与人类疾病的关系, 是国际代谢物信号研究先行者之一。在 Science<\/em>、Cell Metab<\/em>、Nature Metab<\/em>等顶级期刊发表研究论文70余篇, 系列成果入选美国化学会“2010年超级成就”和科技部“中国科学十大进展”, 被编入经典美国本科教材; 获教育部自然科学一等奖、中华医学奖、“吴–杨奖–基础医学”、“谈家桢奖”等。<\/span><\/p>","cshort2":"
<\/span>\"赵世民.jpg\"<\/td>

赵世民, 复旦大学附属妇产科医院教授、博士生导师, 主要研究营养代谢物失调与人类疾病的关系, 是国际代谢物信号研究先行者之一。在 Science<\/em>、Cell Metab<\/em>、Nature Metab<\/em>等顶级期刊发表研究论文70余篇, 系列成果入选美国化学会“2010年超级成就”和科技部“中国科学十大进展”, 被编入经典美国本科教材; 获教育部自然科学一等奖、中华医学奖、“吴–杨奖–基础医学”、“谈家桢奖”等。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"氨基酸信号通过抑制SIRT4调控细胞氨脱毒","listseq":97,"seqno":"97","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"23-06-28-14-09-04-705"},{"caddress1":"","cauthor":"张少华 赵欢 周斌","cintpic":"Upload/qianyan/22-12-21-14-07-45-655.pdf","clicktime":2481,"clong1":"

利用邻近细胞遗传学技术揭示哺乳动物体内细胞间相互作用<\/span><\/p>

张少华 赵欢 周斌*<\/span><\/p>

(细胞生物学国家重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)<\/span><\/p>


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【摘要】细胞与细胞之间的交流和相互作用是多细胞生物的一项基本特征, 解析细胞之间的相互作用对于深入了解多种生物学过程及其调控机制具有重要意义。但是目前领域内缺乏研究体内细胞互作的技术手段。该团队将人工合成Notch信号通路(synNotch)技术与传统遗传学手段相结合, 建立了邻近细胞遗传学技术, 用于监测细胞间相互作用并永久示踪接触过的细胞。通过构建表达synNotch通路的遗传工具小鼠, 该团队在两种不同类型细胞中分别表达synNotch配体蛋白和受体蛋白, 当相邻细胞配体和受体特异结合后, synNotch信号通路被激活从而开启下游报告基因原件的表达, 实现遗传标记和永久示踪受体细胞。该团队利用邻近细胞遗传学技术揭示了心脏中心肌细胞和内皮细胞, 以及肿瘤中肿瘤细胞和内皮细胞之间的动态相互作用。邻近细胞遗传学技术可以解决众多与细胞相互作用相关的重要科学问题, 有助于开拓新的细胞互作研究方向。<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

【关键词】 synNotch; 细胞互作; 邻近细胞遗传学; 受体细胞; 配体细胞<\/span><\/p>


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Intercellular Genetics Reveals Cell-Cell Interactions in Mammals<\/span><\/p>

ZHANG Shaohua, ZHAO Huan, ZHOU Bin*<\/span><\/p>

<\/span><\/p>

(State Key Laboratory of Cell Biology, Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)<\/span><\/p>

<\/span>
<\/p>

【Abstract】 Cell-cell communication and interactions are essential for multicellular organisms. Monitoring \r\nand elucidation of their interactions is fundamental to understanding the diverse biological processes. However, in  vivo<\/em> genetic monitoring of cell-cell interactions remains challenging to date. In this study, this group developed a \r\nproximal cell genetics, combining synNotch with traditional genetic approaches, to monitor in vivo cell-cell interactions, as well as to permanently trace their contact histories. This group generated knock-in mice that expressed \r\nsynNotch elements, where an artificial Notch ligand was expressed in one cell type (sender cells) and an artificial \r\nreceptor in another cell type (receiver cells). The specific binding of ligand and receptor between two contacting \r\ncells activates synNotch pathway, and initiates the expression of reporter gene in receptor cells, thus enabling genetic labelling and lineage tracing of the receptor cells. Using the proximal cell genetics, this group revealed the \r\ndynamic interactions between endothelial cells with cardiomyocytes or tumor cells. This proximal cell genetic approach could be widely applied to understand scientific questions involved with cell-cell interaction, opening new \r\nwindow for study cell-cell communication.<\/span><\/p>


<\/p>

【Keywords】 synNotch; cell interactions; proximal cell genetics; receiver cell; sender cell<\/span><\/p>


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1 解析细胞间互作的技术背景<\/span><\/p>

细胞与细胞之间的交流和相互作用是多细胞生物的一项基本特征, 在多种生物学过程中发挥着\r\n重要的作用, 包括胚胎发育、免疫应答、干细胞命\r\n运决定和肿瘤发生等[1-4]。因此, 解析细胞与细胞之\r\n间的相互作用对于深入了解多种生物学过程及其调\r\n控机制具有重要意义。科学家利用现代遗传学的手段, 例如遗传示踪、组织特异性基因敲除或过表达等技术, 研究器官发育、组织再生与疾病发生发展等过程及其内在的细胞分子机制[5]。但是这些遗传技术基本上只能针对细胞自身进行操作, 无法探究细胞之间的相互关系。最近有研究开发出新技术揭示细胞间相互作用, 推进了我们对生物学过程更深刻的认识[6-14]。例如, 在免疫反应过程中, T细胞和树突状细胞会通过受体和配体特异性的识别发生进一步的细胞交流, 利用转肽酶可以监测这两种细胞之间的相互作用[9,12]。此外当在肿瘤细胞中过表达膜透过性的荧光蛋白时, 这些荧光蛋白会释放到周围的环境, \r\n并进入肿瘤细胞的邻近细胞, 让这些邻近细胞被标记上荧光蛋白, 达到研究肿瘤细胞与其微环境细胞之间互作的目的[14]。这些方法都能够标记特定细胞周围的其他细胞, 揭示细胞间互作。但是体内细胞互作是瞬时且动态的, 已有方法很难对互作的细胞进行长时程追踪, 比如, 在肿瘤发生过程中, 肿瘤细胞会扩散和转移, 导致肿瘤细胞与其微环境细胞之间的互作会动态变化[15], 这就需要一套能够永久示踪体内细胞互作的遗传学技术。因此, 实现体内捕捉细胞与细胞之间相互交流并解析相关细胞的功能及其分子调控机制, 对于阐释体内多种生物学过程至关重要。
<\/p>


<\/p>

2 邻近细胞遗传学技术的建立<\/span><\/p>

Notch信号通路介导了相邻细胞之间的交流和\r\n信号转导[16-18]。在经典Notch信号通路中[18], 配体细\r\n胞表达Notch配体蛋白, 受体细胞表达Notch受体蛋\r\n白, 当细胞相互靠近时, Notch配体和受体蛋白特异\r\n性结合, 产生的蛋白间牵引拉力引起受体跨膜段的\r\n构象改变(图1A); 接着, γ-secretase会水解Notch跨膜\r\n段和胞内段的连接, 从而释放Notch胞内段的转录\r\n因子, 这些转录因子入核后会调控基因的表达。基\r\n于内源性Notch信号通路的原理, 有研究构造了人\r\n工合成的Notch配体和受体蛋白, 配体和受体蛋白\r\n特异性结合会激活受体细胞中的人工合成Notch通\r\n路, 调控受体细胞转录水平的改变, 该技术被称作人\r\n工合成Notch信号通路(synNotch)[6-8,11,19-20]。我们利\r\n用synNotch将体内细胞间的接触信息转变为遗传信\r\n号, 并对接触的细胞进行永久示踪[21]。我们以心脏\r\n中心肌细胞和内皮细胞为例, 验证synNotch能否在\r\n体内监测细胞间的直接接触(图1B和图1C)。我们选\r\n择将心肌细胞作为synNotch的配体细胞, 内皮细胞\r\n作为synNotch的受体细胞, 通过同源重组技术构建\r\n了心肌细胞表达配体蛋白的工具小鼠Tnnt2-mGFP\r\n和内皮细胞表达受体蛋白的工具小鼠Cdh5-αGFP-N-tTA。mGFP是定位在细胞膜上的绿色荧光蛋白, \r\nαGFP-N-tTA全称是GFP nanobody-Notch transmembrane domain-tTA, 作为synNotch的受体蛋白, 其中\r\nGFP nanobody是特异性识别GFP的纳米抗体, Notch \r\ntransmembrane domain是Notch的跨膜段, tTA作为胞\r\n内段, 水解后被释放入核能够发挥转录调控的作用。\r\n接着, 我们检测Tnnt2-mGFP和Cdh5-αGFP-N-tTA两\r\n个小鼠能否正常表达 synNotch配体蛋白和受体蛋白。我们取Tnnt2-mGFP第9.5天的胚胎样本, 通过\r\n全组织荧光成像, 观察到只有心脏是GFP绿色荧光, \r\n胚胎的其他组织不表达GFP, 进一步的切片结果表\r\n明, 心脏中GFP阳性的细胞共表达TNNT2, 说明这些\r\nGFP阳性的细胞是心肌细胞。我们也收取了Cdh5-\r\nαGFP-N-tTA第9.5天的胚胎样本, 通过共染Myc-tag\r\n和CDH5, 发现受体蛋白αGFP-N-tTA表达在内皮细\r\n胞中。以上结果说明我们成功构建了心肌细胞特\r\n异表达synNotch配体、内皮细胞特异表达synNotch\r\n受体的两个小鼠品系。在小鼠早期胚胎心脏中, 内\r\n皮细胞和心肌细胞紧密相邻, 表明两种细胞可能直\r\n接接触。我们进一步获得了三基因型小鼠 Tnnt2-\r\nmGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-nLacZ, 其中 tetO\u0002nLacZ作为报告元件能响应tTA的调控。当内皮细胞\r\n与心肌细胞未发生接触时, synNotch不会被激活; 当\r\n两类细胞相互接触时, 心肌细胞膜表面的mGFP配\r\n体和内皮细胞膜表面的受体特异性结合, 激活synNotch信号通路, 受体胞内段的tTA进入内皮细胞的\r\n细胞核中并结合TRE转录调控序列, 激活报告基因\r\nnLacZ的表达, 显示出与心肌细胞接触的内皮细胞\r\n(图1D)。我们可以看到胚胎心脏中有明显的X-gal信\r\n号, 胚胎其他部位检测不到X-gal信号, 对照组胚胎\r\nTnnt2-mGFP;tetO-nLacZ和Cdh5-αGFP-N-tTA;tetOnLacZ中也检测不到X-gal信号。通过对胚胎切片并\r\n结合免疫染色, 我们发现X-gal阳性内皮细胞与心肌\r\n细胞紧密接触。因此, 基于synNotch的邻近细胞遗\r\n传学技术能够用于监测体内细胞间的接触和互作。<\/p>


<\/p>

\"lyqy-1.jpg\"/<\/p>

A: 卡通图展示经典Notch信号通路原理。NICD指Notch胞内段。B: 卡通图展示利用邻近细胞遗传学技术标记相互接触的细胞。C: 邻近细胞\r\n遗传标记技术工作原理。D: 对完整胚胎进行X-gal染色, 9.5天的胚胎基因型为Tnnt2-mGFP;tetO-nLacZ, Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-nLacZ和Tnnt2-\r\nmGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-nLacZ。箭头指示LacZ阳性的心脏内皮细胞。黄色比例尺代表1µm。<\/span> <\/p>

A: schematic figure showing canonical Notch signal pathway. NICD, Notch intracellular domain. B: illustration showing proximal cell genetics system \r\nfor genetic labeling of contacting cells. C: schematic showing the overall design of the intercellular genetic labelling system. D: whole-mount X-gal \r\nstaining of E9.5 embryos of Tnnt2-mGFP;tetO-LacZ, Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-LacZ, Tnnt2-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-LacZ embryos. Arrows, \r\nLacZ+ cardiac ECs. Scale bars: yellow, 1 mm.<\/span><\/p>

图1 邻近细胞遗传学技术监测细胞间互作(根据参考文献[21]修改) <\/span><\/p>

Fig.1 Intercellular genetic monitoring of cell-cell interactions (modified from reference [21])<\/span><\/p>


<\/p>

为了验证nLacZ的表达是通过synNotch信号通\r\n路调控的, 我们采用DAPT抑制γ-secretase的酶活性[22], \r\n小鼠心脏中几乎检测不到nLacZ的信号。为了验证\r\nnLacZ的表达受到tTA-TRE的调控, 对小鼠饲喂四环\r\n素Dox, Dox能抑制转录因子tTA结合TRE序列[23], 我\r\n们在小鼠胚胎中检测不到nLacZ信号, 结果表明, 该\r\n技术能通过Dox进行灵活的调控。<\/p>


<\/p>

我们也能利用邻近细胞遗传学技术监测肝脏\r\n中肝细胞和内皮细胞之间的互作。另外, 我们引入\r\n了tetO-tdT荧光报告基因小鼠, 更加直观地展现心肌\r\n细胞和内皮细胞之间的接触, 同时也能更加方便荧\r\n光成像和细胞分选。<\/p>


<\/p>

在该技术中, 我们利用GFP蛋白特异性结合\r\nGFP纳米抗体从而激活受体细胞中的synNotch信号\r\n通路, 但是GFP与其抗体的结合可能会影响细胞间\r\n正常的接触和相互作用。为了降低这部分的影响, \r\n我们采用了亲和力比较低的GFP纳米抗体LaG17。\r\n另一个常用的GFP纳米抗体是LaG16, LaG17对GFP\r\n的亲和力是LaG16的1/70[6,24], 这可以大大降低对细胞间黏附的影响。<\/p>


<\/p>

3 邻近细胞遗传学技术实现细胞互作永久示踪<\/span><\/p>

从以上数据可知, 基于synNotch的邻近细胞遗传学技术能够指示细胞间的实时相互作用, 并将细胞间的接触信息转变为可控的遗传信号。但是当细胞分离后, 转录因子tTA将不再入核, 随着荧光蛋白的降解, 细胞很快会失去荧光标记。因此, 我们接下来将探究如何实现对体内细胞相互作用的永久示踪。<\/p>


<\/p>

谱系示踪技术利用Cre-LoxP重组, 使细胞永久\r\n表达荧光蛋白, 实现对细胞的永久追踪[5]。我们将\r\nCre-LoxP重组系统引入到synNotch信号通路中, 从\r\n而让synNotch的瞬时激活转变为永久性的遗传改\r\n变。为了验证该想法是否可行, 我们以心肌细胞和\r\n内皮细胞相互作用为例, 获得了Tnnt2-mGFP;Cdh5-\r\nαGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT四基因型小鼠(图2A)。\r\ntetO-Cre会受到tTA的调控, 表达出Cre重组酶, 这与\r\ntetO-nLacZ受tTA调控的原理一致; 接着, Cre重组酶\r\n作用在报告基因R26-tdT上发生Cre-loxP重组, 使报\r\n告基因永久地表达tdT红色荧光蛋白, 从而达到示踪\r\n细胞的目的。在小鼠胚胎早期, 心脏中的心内膜内\r\n皮细胞与心肌细胞紧密接触, 由于心肌细胞和内皮\r\n细胞分别作为synNotch的配体细胞和受体细胞, 因\r\n此, 心内膜内皮细胞将被永久的标记为tdT阳性(图\r\n2B~图2D)。在胚胎发育到9.0天后, 部分心内膜内\r\n皮细胞迁移离开心肌细胞[25-26], 形成房室垫, 并随着\r\n胚胎的发育重塑产生心脏瓣膜。我们收取该四基因\r\n型小鼠出生后的心脏样本, 发现几乎全部的心脏内\r\n皮细胞被标记上, 同时位于瓣膜的间充质细胞也被\r\n标记上。这些间充质细胞是由心内膜内皮细胞发生\r\nEndoMT转变而来, 远离心肌细胞, 也不再激活内皮\r\n细胞的特征基因Cdh5, 但持续表达tdT荧光蛋白, 证\r\n明与心肌细胞接触过的内皮细胞经历过Cre-loxP重\r\n组介导的遗传操作表达出荧光标记蛋白, 这些被标\r\n记的内皮细胞及其子代细胞即使发生了命运转变也\r\n会被永久标记上。因此, 我们将tetO-Cre;R26-tdT引\r\n入synNotch后, 通过细胞间的直接接触实现了对邻\r\n近细胞的遗传示踪。<\/p>


<\/p>

我们收取以上四基因型小鼠出生后的肝脏样本, 发现肝脏中存在部分被标记为tdT阳性的内皮细胞, 但是并没有检测到肝脏中存在表达mGFP的细胞, 意味着这部分tdT阳性的内皮细胞是由心脏内皮细胞迁移到肝脏形成的(图2E~图2H)。这一现象在以前的研究中也曾被报道[27], 证明邻近细胞遗传示踪技术的精准性。这些内皮细胞在肝脏后期发育过程中会形成肝窦内皮细胞, 明显区别于心脏内皮细胞, 说明不同组织微环境会对细胞在形态结构、生理功能甚至命运决定等产生影响。<\/p>


<\/p>

4 利用邻近细胞遗传学技术追踪肿瘤血管内皮细胞<\/span><\/p>

细胞间互作也在各种疾病发生发展过程中扮演着重要角色。以肿瘤为例, 在肿瘤发生过程中, 肿瘤细胞会分泌细胞外因子, 招募周围组织中的血管迁移至肿瘤[28-30]。与肿瘤细胞的互作会赋予内皮细胞新的特性, 这些特性让肿瘤血管内皮细胞与正常内皮细胞相比具有明显差异[30]。接着, 我们利用邻近细胞遗传学技术解析肿瘤血管内皮细胞与肿瘤细胞之间的相互作用, 并永久示踪肿瘤血管内皮细胞。我们构建了过表达mGFP的肿瘤细胞系, 并将该肿瘤细胞移植到小鼠Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT皮下, 因此, 在该模型中, 肿瘤细胞为配体细胞, 内皮细胞为受体细胞。当内皮细胞迁移进入肿瘤并接触肿瘤细胞后, 会被永久标记为tdT阳性。在肿瘤早期阶段(移植肿瘤第7天), 我们发现肿瘤中几乎全部的内皮细胞都被标记为tdT, 通过对小鼠注射BS lectin证实这些肿瘤血管与小鼠的正常血管连通。肿瘤外周有一层富含成纤维细胞和巨噬细胞的外包膜, 在肿瘤早期阶段, 我们没有在外包膜中检测到tdT标记的内皮细胞。然而在肿瘤发展的后期(移植肿瘤第14天), 我们发现外包膜中超过一半的内皮细胞被标记上tdT。但是外包膜中没有表达mGFP的肿瘤细胞, 意味着这些tdT阳性的内皮细胞可能从肿瘤内部迁出(图3)。<\/p>


<\/p>

为了进一步揭示肿瘤细胞对肿瘤血管内皮细胞的影响, 我们通过流式细胞分选分离出了三群内皮细胞: 肿瘤内部tdT阳性内皮细胞, 肿瘤外包膜中tdT阳性内皮细胞和tdT阴性内皮细胞。我们接着对这三群内皮细胞进行RNA测序, 分析基因表达差异。测序数据表明, 这三群内皮细胞各自成群, 具有明显差异。相对于肿瘤外包膜中tdT阴性的内皮细胞, tdT阳性内皮细胞(从肿瘤中迁出进入外包膜的内皮细胞)具有转移和浸润、促血管生成以及炎症反应等特征, 这些都是典型的肿瘤血管的特征, 说明与肿瘤细胞的互作会影响肿瘤血管内皮细胞, 即使内皮细胞迁移出肿瘤, 这种影响仍然会维持下去。<\/p>


<\/p>

\"lyqy-2.jpg\"/<\/p>

A: 图示邻近细胞遗传示踪技术的原理。B: 卡通图表示胚胎心脏房室垫和瓣膜的形成。红色指示心内膜及经过EMT产生的子代细胞, 绿色表\r\n示心肌细胞。C、D: Tnnt2-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT胚胎的完整胚胎荧光成像以及切片后免疫荧光共染色GFP和tdT。E: 卡通\r\n图表示胚胎8.5天时心脏内皮细胞迁移到肝芽, 并形成肝脏血管内皮细胞。F: 对肝脏进行完整组织的荧光成像。G: 肝脏切片免疫荧光共染tdT\r\n和PECAM, 或者tdT, CDH5和HNF4a。箭头指示tdT阳性的内皮细胞。H: 左侧卡通图表示通过邻近细胞遗传标记技术标记和心肌细胞接触的内\r\n皮细胞; 右侧卡通图表示通过邻近细胞遗传示踪技术永久追踪和心肌细胞接触的内皮细胞。Fb, 成纤维细胞; EMT, 内皮向间充质的转变。黄\r\n色比例尺为400 µm; 白色比例尺为100 µm。<\/span><\/p>

A: schematic showing proximal cell genetics strategy for permanent genetic tracing of cardiac endothelial cells (ECs) that have contacted cardiomyocytes (CMs). B: illustration of the development of the endocardial cushion and cardiac valves (red). Green indicates CMs. C,D: whole-mount fluorescence images of E9.0 (C) and E10.0 (D) Tnnt2-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT embryos, and immunostaining for tdT and GFP on their \r\nembryonic sections. E: illustration showing that ECs from the developing heart migrate to liver bud at E8.5 and subsequently contribute to liver vasculature. F: whole-mount fluorescence images of P0 livers. G: immunostaining for tdT and PECAM on P0 liver sections. Arrowheads, tdTomato+ECs. \r\nControl (blue box) is Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT. H: illustration showing genetic labelling of ECs based on their contact with CMs (left) and \r\nlineage tracing of ECs based on their contact history with CMs (right). Fb, fibroblast; EMT, endothelial-to-mesenchymal transition. Scale bars: yellow, \r\n400 µm; white, 100 µm.<\/span><\/p>

图2 邻近细胞遗传学技术追踪接触过心肌细胞的内皮细胞(根据参考文献[21]修改) <\/span><\/p>

Fig.2 Intercellular genetic tracing of endothelial cells that have contacted with cardiomyocytes (modified from reference [21])<\/span><\/p>


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5 邻近细胞遗传学技术相关工具的开发和拓展<\/span><\/p>

以上实验结果主要集中在心血管领域 , 证明邻近细胞遗传标记和示踪技术在小鼠体内是可行的。为了进一步推广该技术的应用范围, 我们分别构建了由Cre重组酶诱导表达synNotch配体的小鼠R26-mGFP和synNotch受体的小鼠H11-αGFP-N-tTA。R26-mGFP工具鼠可以搭配特定细胞类型的Cre小鼠品系, 经过Cre-LoxP重组后, 特定类型细胞表达mGFP, 成为配体细胞。H11-αGFP-N-tTA工具鼠结合特定Cre小鼠后, 特定类型细胞表达αGFP-N-tTA, 成为受体细胞。因此, 我们可以利用这两个小鼠品系, 使任何类型细胞成为 synNotch配体细胞或受体细胞。<\/p>


<\/p>

为了让该系统只需搭配特定 Cre小鼠品系就能研究体内细胞间相互作用 , 我们进行了更进一步地改造优化。我们将序列tetO-rox-stop-rox-tdT-insulator-CAG-loxP-αGFP-N-tTA-pA-loxP-mGFP插入到小鼠基因组Tigre位点[31], 构建了Tigre-synNotch小鼠。在该小鼠中, 所有细胞都会表达αGFP-N-tTA, 成为受体细胞。当搭配细胞特异性基因驱动的Cre小鼠时, Cre-loxP重组会在基因组上切掉αGFP-N-tTA-pA序列, 使细胞启动并表达mGFP, 因此, Cre阳性的细胞成为配体细胞。Cre阴性的细胞不会发生Cre-loxP重组, 这些细胞持续表达αGFP-N-tTA蛋白, 保持着受体细胞的状态。Cre阴性的受体细胞和Cre阳性细胞接触后, 会被标记为tdT荧光。通过Tigre\u0002synNotch, 我们能够标记与特定细胞接触的所有其他细胞。<\/p>


<\/p>

为了验证Tigre-synNotch是否可行, 我们将其与Tie2-Cre;CAG-Dre小鼠繁配, 得到Tie2-Cre;CAG\u0002Dre;Tigre-synNotch胚胎。Tie2-Cre小鼠中内皮细胞表达Cre重组酶[32], CAG-Dre小鼠全身细胞表达Dre重组酶[33]。因此, 在Tie2-Cre;CAG-Dre;Tigre-synNotch胚胎中, 内皮细胞通过Cre-loxP重组表达mGFP成为配体细胞, 其他类型细胞通过和内皮细胞的接触被标记为tdT红色, 比如在胚胎大脑中周细胞被标记为tdT, 在心脏中心肌细胞被标记为tdT阳性, 在肝脏中肝细胞被标记为tdT阳性, 在肺脏中肺成纤维细胞被标记为tdT阳性。对于胚胎CAG-Dre;Tigre-syn\u0002Notch, 由于没有表达mGFP的配体细胞, 我们几乎检测不到tdT的信号, 证明Tie2-Cre;CAG-Dre;Tigre-synNotch胚胎中的tdT信号是通过mGFP激活受体细胞synNotch通路实现的。因此, 当搭配特定Cre小鼠品系时, Tigre-synNotch能够监测一种细胞与其接触的所有其他类型细胞间的互作。<\/p>


<\/p>

\"lyqy-3.jpg\"/<\/p>

在肿瘤发生发展形成外包膜过程中, 周围正常组织中的血管会迁移进入肿瘤并被标记为tdT阳性, 接着这些tdT阳性的肿瘤血管会迁移进入肿瘤外包膜。<\/span><\/p>

Illustration showing that vessels expand from peripheral into tumor (ingrowth) and tdT+ vessels expand out of tumor into the peripheral capsule (outgrowth) during tumor growth and formation of its capsule.<\/span><\/p>

图3 邻近细胞遗传示踪技术追踪肿瘤血管内皮细胞(根据参考文献[21]修改)<\/span><\/p>

Fig.3 Genetic tracing of tumor cell-EC interaction during tumor growth (modified from reference [21])<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

6 总结与展望<\/span><\/p>

合成生物学领域可以通过人工合成信号通路实现体外相邻细胞的标记和转录调控, 遗传学领域可以通过遗传操控元件实现特定细胞的示踪及基因表达调控。在该工作中, 我们结合了合成生物学技术和传统遗传学手段, 建立了邻近细胞遗传标记技术和邻近细胞遗传示踪技术。邻近细胞遗传标记技术用于捕捉细胞之间的实时接触, 将细胞接触信息转变为遗传信号, 反映出细胞之间的动态相互作用; 我们引入tetO-Cre工具鼠, 基于Cre-loxP重组系统, 建立了邻近细胞遗传示踪技术, 用于永久记录细胞之间的相互作用, 示踪曾经接触过的细胞。借助邻近细胞遗传标记技术, 我们直观地揭示了小鼠体内不同细胞间的动态相互作用, 包括心肌细胞和内皮细胞、肝细胞和内皮细胞以及肿瘤细胞和内皮细胞的互作; 我们发现了心脏中的内皮细胞在早期胚胎发育过程中会迁移到肝脏, 并首次揭示了肿瘤血管内皮细胞会迁移到肿瘤外包膜的现象。<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

邻近细胞遗传学技术可以解决众多与细胞互作相关的重要科学问题, 比如追踪特定位置来源的细胞, 特别是胚胎不同部位产生的造血干细胞对于各个器官的贡献情况; 利用干细胞与微环境细胞之间的接触标记微环境细胞, 从而解析干细胞微环境的功能; 在同一组织内根据位置的不同将巨噬细胞分类, 可以将和不同类型细胞接触的巨噬细胞分为不同类别; 肿瘤发生早起肿瘤细胞对微环境细胞的影响等。因此, 邻近细胞遗传学技术的建立有助于开拓新的研究方向, 对细胞相互作用如何调控发育、组织稳态、疾病及修复再生等过程的深入研究提供重要技术支持。<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

参考文献 (References)<\/span><\/p>

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周斌, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。2002年于浙江大学医学院获本科学位; 2006年于中国协和医科大学获得博士学位; 2006至2010年在美国哈佛大学波士顿儿童医院从事博士后研究。2010年8月至2016年8月在中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所工作, 任研究员、研究组长、博士生导师。2016年9月起在中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所(现中国科学院分子细胞科学卓越创新中心)工作。实验室主要利用遗传谱系示踪技术探索在器官发育和组织再生过程中细胞的起源和命运调控机制。以第一或通讯作者的身份在Nature<\/em>、Science<\/em>、Nat Med<\/em>、Nat Genet<\/em>等国际期刊发表研究论文。<\/p>","cshort2":"
\"lyqy.jpg\"<\/td>

周斌, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。2002年于浙江大学医学院获本科学位; 2006年于中国协和医科大学获得博士学位; 2006至2010年在美国哈佛大学波士顿儿童医院从事博士后研究。2010年8月至2016年8月在中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所工作, 任研究员、研究组长、博士生导师。2016年9月起在中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所(现中国科学院分子细胞科学卓越创新中心)工作。实验室主要利用遗传谱系示踪技术探索在器官发育和组织再生过程中细胞的起源和命运调控机制。以第一或通讯作者的身份在Nature<\/em>、Science<\/em>、Nat Med<\/em>、Nat Genet<\/em>等国际期刊发表研究论文。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"利用邻近细胞遗传学技术揭示哺乳动物体内细胞间相互作用","listseq":96,"seqno":"96","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-12-21-14-53-07-035"},{"caddress1":"（1<\/sup>遗传工程国家重点实验室, 遗传与发展协同创新中心, 生命科学学院, 人类表型组研究院, 复旦大学, 上海 200438; 2<\/sup>中国科学院计算生物学重点实验室, 中国科学院大学上海营养与健康研究所, 上海 200031; 3<\/sup>现代人类学教育部重点实验室, 人类学与人类遗传学系, 生命科学学院, 复旦大学, 上海 200438; 4<\/sup>上海交通大学医学院, 基础医学院, 上海 200025)","cauthor":"李金喜1<\/sup>，<\/sup>2<\/sup> 张海国3<\/sup>，<\/sup>4<\/sup> 金力1<\/sup>，<\/sup>2<\/sup> 汪思佳2<\/sup>*","cintpic":"Upload/qianyan/22-07-27-10-45-30-801.pdf","clicktime":2451,"clong1":"

肢体发育相关基因在指纹花纹形成中发挥关键作用\r\n—‘一因多效’连接肢体发育和指纹花纹形成<\/span><\/p>

 李金喜1,2<\/sup> 张海国3,4<\/sup> 金力1,2<\/sup> 汪思佳2<\/sup>* <\/p>

(1<\/sup>遗传工程国家重点实验室, 遗传与发展协同创新中心, 生命科学学院, 人类表型组研究院, 复旦大学, 上海 200438; \r\n2<\/sup>中国科学院计算生物学重点实验室, 中国科学院大学上海营养与健康研究所, 上海 200031; <\/p>

 3<\/sup>现代人类学教育部重点实验室, 人类学与人类遗传学系, 生命科学学院, 复旦大学, 上海 200438;4<\/sup>上海交通大学医学院, 基础医学院, 上海 200025)<\/p>


<\/p>

 摘要<\/strong>       肤纹具有长期的实用性和文化性, 且与身俱来, 但人们对其变化背后的机制知之甚\r\n少。通过对中国汉族人群的全基因组扫描, 该团队发现了18个与指纹类型相关的基因座, 包括长期\r\n以来被认为的中间三枚手指指纹花纹之间的“模式块”相关性的遗传基础。值得注意的是, 该团队\r\n发现了EVI1基因附近的一个变异, 它可以改变对EVI1基因表达的调节活性, 并证实了Evi1在小鼠脊\r\n线模式中的重要作用。在人类发育过程中, EVI1的动态表达支持其在塑造四肢和手指方面发挥作\r\n用, 而不是直接影响皮肤模式。多群体的荟萃分析鉴定了43个与指纹相关的位点, 基因显著富集在\r\n肢体发育通路中。此外, 指纹花纹与手的比例存在基因上的关联。综上所述, 这些发现支持了肢体\r\n发育基因在影响指纹花纹形成中起关键作用。 <\/p>

关键词<\/strong>       指纹花纹; 遗传; 全基因组关联分析; 多群体荟萃分析; 肢体发育; EVI<\/em><\/p>


<\/em><\/p>

Limb Development Genes Underlie Variation in Human Fingerprint Patterns\r\n—Pleiotropic Effects of Limb Development and Fingerprint Patterning<\/span><\/p>

LI Jinxi1,2<\/sup>, ZHANG Haiguo3,4<\/sup>, JIN Li1,2<\/sup>, WANG Sijia2<\/sup>*<\/p>

 (1\r\nState Key Laboratory of Genetic Engineering, Collaborative Innovation Center for Genetics and Development, \r\nSchool of Life Sciences, and Human Phenome Institute, Fudan University, Shanghai 200438, China; 2\r\nCAS Key Laboratory \r\nof Computational Biology, Shanghai Institute of Nutrition and Health, University of Chinese Academy of Sciences, \r\nChinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China; 3\r\nMinistry of Education Key Laboratory of Contemporary Anthropology, \r\nDepartment of Anthropology and Human Genetics, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China; \r\n4\r\nSchool of Basic Medicine, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China) <\/em><\/p>

Abstract<\/strong>      Fingerprints are of longstanding practical and cultural interest, but little is known about the \r\nmechanisms that underlie their variation. Using genome-wide scans in Han Chinese cohorts, this studyidentified \r\n18 loci associated with fingerprint type across the digits, including a genetic basis for the long-recognized “pattern\u0002block” correlations among the middle three digits. In particular, it identified a variant near EVI1 that alters regula\u0002tory activity and established a role for EVI1 in dermatoglyph patterning in mice. Dynamic EVI1 expression during \r\nhuman development supports its role in shaping the limbs and digits, rather than influencing skin patterning directly. \r\nTrans-ethnic meta-analysis identified 43 fingerprint-associated loci, with nearby genes being strongly enriched in \r\ngeneral limb development pathways. This study also found that fingerprint patterns were genetically correlated with \r\nhand proportions. Taken together, these findings support the key role of limb development genes in influencing the \r\noutcome of fingerprint patterning. <\/em><\/p>

Keywords      <\/strong>fingerprint pattern; genetics; Genome-Wide Association Study; trans-ethnic meta-analysis; \r\nlimb development; EVI1<\/em><\/p>


<\/em><\/p>

前世今生, 奠定肤纹研究重要意义<\/strong> <\/p>

    肤纹又称皮纹, 是人类和灵长类动物厚型皮肤的纹理, 即手足掌面由表皮嵴线形成的花纹, 其中分布在指尖处的花纹被称为指纹。 此外, 肤纹还包括掌纹和足纹等[1]。命相学把人的命运与肤纹联系起来, 认为人的寿命、遭遇、婚姻等都可以“算”\r\n出来。因此, 正确认识人体肤纹, 是肤纹发展的关键。中国是世界上公认的指纹观察和应用的发源地。我们的祖先观察和应用肤纹的历史已达几千年之久。出土的各类古代陶器、陶罐、青铜器文物上也都有类似指纹的装饰。各类民间契约及断案文书上也能发现指纹的遗迹。这说明我们的祖先已对指纹进行过观察并加以运用。直到近300多年, GALTON[2]总结了人皮肤上的这些纹路, 确立了指纹的个体差异性及持久稳定性, 并于1892年出版\r\n了《指纹学》一书, 标志着近代指纹科学理论的开\r\n始。1926年, CUMMINS[1,3]和MIDLO[1]对皮肤纹理\r\n的各个层面都作了清楚的论述, 从方法学、解剖学\r\n到人类学、遗传学以及胚胎学, 规范了皮纹学的定\r\n义, 并巧妙地将皮肤(dermato)与雕刻(glyphic)结合成\r\n‘dermatoglyphics’(皮肤纹理学、肤纹学或皮纹学), \r\n建立了皮纹学理论。也因此, CUMMINS被称为“皮\r\n纹学之父”, 并于1943年出版了《指纹、手掌和脚掌》\r\n一书[4], 该书被认为是肤纹学领域的圣经。 自此, 肤纹学正式成为一个专业的研究领域。\r\n国内外许多学者也在各个领域相继对肤纹\r\n学的发展作出了重大贡献。从体质人类学角度, \r\nWILDER[5]指出肤纹特征在中国人和日本人间存在差异。之后, RIFE[6]对全球多个国家人群的肤纹总结, \r\n以及张海国[7]在我国不同民族人群中的肤纹调查, \r\n均证实了肤纹具有明显的群体差异性。进而, 张海国等[8]利用肤纹作为遗传标记将我国56个民族分成南方和北方两大群体, 还找到了民族肤纹的标志性群体。由此可见, 肤纹对人类学、民族学、遗传学的研究均有重要意义。1958年, WALKER[9]首次提出可以利用肤纹特征判别唐氏综合征, 证实肤纹可以作为染色体异常的诊断指标。在之后的二十年间, \r\n肤纹在唐氏综合征辅助诊断中的应用研究得到了大\r\n量医生、学者的青睐, 并在REED等[10]的研究中达到高潮。REED等[10]筛选出4项可以明显区分唐氏综合征患者与正常人的肤纹特征, 并构建判别方程, 作为诊断唐氏综合征的简单依据。我们近期也对此项工\r\n作进行了进一步探索, 经过更严密的肤纹特征筛选, \r\n将判别准确率提升到了98%, 并将假阴性率控制在\r\n了6.6%[11]。除唐氏综合征外, HOLT[12]在《肤纹遗传\r\n学》一书中, 总结了对不同人群(包括正常人群和多种先天性疾病患者)手指和手掌纹路的研究。以上, \r\n说明肤纹在医学辅助诊断领域中具有重要应用价\r\n值。如今, 肤纹, 尤其是指纹, 凭借其个体独特性以及永久稳定性已被广泛应用于个人认定、侦查破案、\r\n信息安全、医学辅助诊断等各个领域中, 横跨法医\r\n物证学、生物学、民族学、人类遗传学、医学、计算机科学等各学科。 <\/p>


<\/strong><\/p>

析理入微, 解析指纹花纹遗传学结构 <\/strong><\/p>

     在指尖上, 有规律的脊线和沟纹形成了三种主要模式的指纹: 弓型、箕型和斗型(图1)。尽管指纹\r\n的出现可能是为了帮助抓取[13-14]和表面纹理的触觉\r\n感知[15-16], 但自19世纪以来, 指纹因其独特性和永久性而已被广泛用于各领域。妊娠10周后, 手指指尖处在肿胀消退的掌侧垫上的皮肤上开始出现嵴线。\r\n到第14周时, 在表皮–真皮交界处初生嵴的构型确定了未来的指纹花纹(弓型、箕型和斗型)的形成[17-18]。\r\n人们提出了几种机制来解释这些花纹的形成, 包括\r\n基于通过屈曲分解表皮上的机械应变的理论[19-20], 根\r\n据血管或神经走向设定的嵴线排列[21], 以及反应–扩\r\n散信号过程的影响[22]。然而, 皮肤纹图案和整个指纹花纹形成的生物机制在很大程度上还不清楚。KARMAKAR等[24-25]和LOESCH等[26]认为绝大多数的肤纹特征都受到多个基因的影响, 并且指出\r\n如指纹花纹、总嵴线数等一些特征存在显性遗传\r\n的主效基因。但有研究证明指纹花纹也满足多基\r\n因遗传模型, 且存在主效基因的影响[27], 其遗传因素的影响占60%~90%, 还存在外界环境的影响[25]。\r\n随着对人体皮纹分析更加精细, 样本量不断增加, \r\n有学者通过全基因组关联分析(Genome-Wide Asso\u0002ciation Study, GWAS)的方式, 定位到几个与欧洲血\r\n统群体的指纹花纹相关的基因座[28], 但这些基因座\r\n此前都没有被报道参与肢体或皮肤发育的功能, 学\r\n者们对潜在的生物学机制几乎没有深入了解。基\r\n于指纹花纹在不同种族群体中, 甚至不同手指上外显率的不同, 我们认为在不同种族不同手指上的主效基因对肤纹特征的影响应该是存在差别的, 对肤\r\n纹特征背后遗传因素的探索还任重而道远。\r\n针对这一问题, 我们从定位与指纹花纹表型相\r\n关的遗传变异入手, 通过对23 000多例个体进行全\r\n基因组关联扫描与多群体荟萃分析, 从中识别出43\r\n个与人类指纹花纹相关的遗传基因座(图2A)。这些\r\n基因座在欧亚不同祖先群体中存在一定差异(图2B), \r\n但总体相同, 这可能是由于不同的等位基因效应大小或频率不同造成的。这些与指纹花纹相关的基因显著富集在肢体发育与形成的相关通路上, 而非皮\r\n肤发育相关通路上(图2C)。\r\n值得注意的是, 我们的研究确认了左右中间三枚手指指纹花纹间存在“模块现象”(图3A和图3B), \r\n即中间三枚手指指纹高度相关[29-31]。而位于3q26.2\r\n区域邻近EVI1基因的变异位点与中间三枚手指指纹的复合表型显著相关, 这为上世纪即被发现的\r\n“指纹模块现象”提供了表型组学和遗传学解释(图\r\n3C)。\r\n基于小鼠动物模型和人胚胎组织的实验观察\r\n发现, 人类胎儿组织在从肢体发育到皮纹形成的系\r\n列过程中, 支持Evi1/EVI1基因发挥塑造四肢和手指\r\n作用的, 正是表达于肢体发育期的间充质细胞, 而非\r\n皮肤发育期的上皮细胞(图4)。这进一步与研究结论相印合: 指纹相关基因通过调控肢体发育来影响指纹花纹的形成。\r\n此外, 通过多表型关联分析发现, 指纹花纹与手指长度比例特征间紧密相关, 两者共有相同的遗传基础。如小指相对越长, 掌长相对越短, 双手斗型花纹越多; 而食指远端指节(指纹形成处)相对越长, \r\n斗形花纹则越少(图5)。<\/p>


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\"Figure<\/p>

根据轴三角和中心区域确定指纹花纹类型。有三种主要类型: 弓型、箕型和斗型。每一种按陡度、嵴线方向和中心区域变化为两类亚型。<\/p>

 Pattern-types of fingerprints according to the number of triradii/deltas (triangles) and cores (circles) (STAR methods). There are three main types: arch, \r\nloop and whorl. Each main group contains two sub-types according to the steepness, direction of ridges and the variable core. <\/p>

图1 指纹花纹的类型(根据参考文献[23]修改)<\/p>

 Fig.1 Pattern-types of fingerprints (modified from reference [23])<\/p>


<\/p>

\"Figure<\/p>

A: 曼哈顿图显示了欧(European, EUR)、亚(East Asian, EAS)不同祖先群体十枚手指上指纹花纹的荟萃分析结果。有43个信号与至少一个手指\r\n上的指纹模式相关(Padj<1.67×10–8\r\n), 不同颜色的基因名称: 紫色表示EAS和EUR均显著; 红色和蓝色分别表示仅在EAS和EUR中显著; 绿色表示\r\n在EAS或EUR中均不显著, 但只有在合并两者的荟萃分析后才显著。粗体基因显示与肢体表型发育异常相关。右侧的块图表示左侧信号对应\r\n的手指。红色和蓝色三角形分别代表EAS和EUR显著性, 而深色和浅色分别代表达到Bonferroni校正后全基因组显著性的信号(Padj<1.67×10–8\r\n)\r\n和边际显著性水平的信号(Padj<3.33×10–6\r\n)。 在多群体荟萃分析后, 粗体框表示全基因组显著(黑色)或边际显著(灰色)。B: 韦恩图显示与指纹花\r\n纹相关信号在各群体中的分布。C: 与指纹花纹相关的43个基因功能注释。红色星号表示经Bonferroni校正后基因显著富集的肢体相关条目(红\r\n色虚线)。只显示富集分析后排名前10位的条目和前5位上皮/皮肤相关的条目。 <\/p>

A: a Manhattan plot showing the results of the meta-analyses combining GWAS of East Asian (EAS)-ancestry (TZL, NSPT, JD, CKB and WeGene) \r\nand European (EUR)-ancestry cohorts (ALSPAC, QIMR and Pittsburgh) across all ten digits (D1L/R were unavailable in JD and ALSPAC). There were \r\n43 signals associated with fingerprint patterns of at least one digit (Padj<1.67×10–8\r\n), with gene names in different colors: purple indicating significant \r\nin both EAS and EUR; red and blue indicating only significant in EAS and EUR, respectively; green indicating not significant in either EAS or EUR, \r\nbut only significant after the meta-analysis combining both. Bold genes showed associations with limb phenotypes abnormalities. The block map on \r\nthe right represented the digits corresponding to the signals on the left. Red and blue triangles indicate significance in EAS and EUR, respectively, while dark \r\nand light colors represented signals that reached the adjusted genome-wide significant (Padj<1.67×10–8\r\n) and suggestive levels (Padj<3.33×10–6\r\n), respectively. \r\nBold frame indicated genome-wide significant (black) or suggestive (gray) significant after combined meta-analyses. B: venn diagram summarizing \r\nfingerprint-associated signals. C: enrichment of annotations across ontologies for the 43 fingerprint-associated signals. The red asterisk indicates limb\u0002relevant terms that genes are significantly enriched in after Bonferroni correction (the red dotted lines). Only the top 10 terms ranked after enrichment \r\nanalysis and top 5 epithelial/skin-related terms are shown. <\/p>

图2 多群体荟萃分析发现指纹花纹相关信号在肢体发育相关通路中显著富集(根据参考文献[23]修改) <\/p>

Fig.2 A meta-analysis of fingerprint patterns showing signals enriched in limb development (modified from reference [23])<\/p>

\"Figure<\/p>

A: 十枚手指指纹花纹两两间表型相关分析(蓝色)和遗传相关分析(红色)均表明左右中间三枚手指指纹花纹存在“指纹模块现象”(n=9 909)。虚\r\n线框表示两只手的同名手指与相邻手指上指纹花纹之间的高度相关性。 图中由高到低的相关性分别用颜色和相关系数(r)表示。B: 左右中间\r\n三枚手指之间的指纹花纹的相关性(Pattern-block pairs)高于十枚手指的所有随机对之间的相关性(all pairs)。C: 对从左右中间三枚手指的指纹\r\n花纹中提取的复合表型进行全基因组关联扫描。复合表型对6个相关变量的加载系数在0.719~0.792。 <\/p>

A: “Pattern block” phenomenon of the middle three digits on both hands revealed by pair-wise phenotypic correlation (blue) and genetic correlation (red) \r\namong the ten digits (n=9 909). The dashed box indicates high correlations between the same digits of both hands and neighboring digits. The correla\u0002tions from high to low were represented by both color and correlation coefficients (r) in the figure. B: the correlations of fingerprint patterns between the \r\nmiddle three digits on both hands (Pattern-block pairs) are higher than the correlations of all random pairs of the ten digits (all pairs). C: genome-wide \r\nscan on the composite phenotype extracted from the fingerprint pattern of the middle three digits on both hands. The loading coefficients of the compos\u0002ite phenotype on the six correlated variables are between 0.719 and 0.792. <\/span><\/p>

图3 EVI1附近位点可能为左右中间三枚手指指纹花纹“模块现象”的遗传基础(根据参考文献[23]修改)<\/p>

 Fig.3 The top signal near EVI1 may be the genetic basis of the middle three digit “Pattern-block” phenomenon\r\n(modified from reference [23])<\/p>


<\/p>

\"Figure<\/p>

A: 野生型和Evi1Jbo/+成年小鼠甲苯胺蓝染爪掌真皮表面显示皮纹构型。箭头表示突变小鼠爪子上额外D5指。B: 野生型和Evi1Jbo/+小鼠D4指和\r\n腹侧横脊分类示意图。表示携带连续的C、不连续的D和不完整的I脊的区域。C: 野生型和Evi1Jbo/+突变体的指脊模式定量分析。在所有突变趾上, \r\n连续脊减少, 而D3和D4携带更多的不连续脊。D: 整体原位杂交检测小鼠胚胎前肢Evi1的表达。腹侧视图。E: RNAscope原位杂交检测小鼠胚\r\n胎肢体和指肢E11.5和E17.5之间的Evi1和肢体间质标记物Prrx1转录物。F: 定量RT-PCR检测小鼠前肢E11.5(全肢芽)、E13.5、E15.5和E17.5(仅\r\n限同源体)时Evi1的表达。G~J: 免疫荧光检测人胚胎组织中EVI1的表达。CS17胚胎(约6周EGA)横切面显示肢芽间充质细胞(下方放大图)的核\r\n表达(G)。神经管(NT)指背侧中线。H: 10周EGA手指纵切面, 箭头表示指纹形成的凸起掌侧垫。13周EGA(I)指和16周EGA(J)指检测EVI1和上\r\n皮标志物K14。虚线表示真皮–表皮交界处。*表示血细胞自身荧光。SG为汗腺。K、L: RNAscope原位杂交在单细胞中检测10周EGA(K)和16\r\n周EGA(L)人类手指的EVI1和PRRX1表达。M: 10周EGA手指增殖细胞标志物Ki67的检测。背轴(D)和腹轴(V)标注, 核用DAPI染色。误差线表\r\n示标准误差。 <\/p>

A: palmar dermal surface of toluidine blue stained paws from wild type and Evi1Jbo/+ adult mice showing dermatoglyph arrangement. Arrow indicates \r\nspur on the mutant digit 5 (D5). B: schematic depicting transverse ridge categories on mouse digits and ventral surface of D4 of wild type and Evi1Jbo/+.\r\nRegions carrying continuous C, discontinuous D, and incomplete I ridges are indicated. C: quantification of digit ridge pattern in wild type and Evi1Jbo/+\r\nmutants. Continuous ridges are reduced on all mutant digits, while D3 and D4 carry more discontinuous ridges. D: wholemount in situ hybridization \r\ndetecting Evi1 expression in mouse embryonic forelimbs. Ventral view. E: RNAscope in situ hybridization detecting Evi1 and the limb mesenchyme \r\nmarker Prrx1 transcripts in mouse embryonic limb and digits between E11.5 and E17.5. F: quantitative RT-PCR determination of Evi1 expression in \r\nmouse forelimb at E11.5 (whole limb bud), E13.5, E15.5 and E17.5 (autopod only). G-J: immunofluorescence detecting EVI1 expression in human \r\nembryonic tissue. Transverse section of CS17 embryo (~6-week EGA) shows nuclear expression in mesenchymal cells of the limb bud (LB, magnified \r\nin lower panel). The neural tube (NT) indicates the dorsal midline (G). Longitudinal section of 10-week EGA digit, arrow indicates the raised volar pad \r\nacross which fingerprints form (H). 13-week EGA digit (I) and 16-week EGA digit (J) detecting EVI1 and epithelial marker K14. Dotted line indicates \r\ndermal-epidermal junction. * indicates cateinin immunofluorescence. SG: eccrine sweat gland. K,L: RNAscope in situ hybridization detecting EVI1 and \r\nPRRX1 transcripts in sectioned 10-week EGA (K) and 16-week EGA (L) human digit. Individual cells co-express EVI1 and PRRX1. Asterisks indicates \r\nautofluorescent blood cells. M: detection of proliferative cell marker Ki67 in 10-week EGA digit. Dorsal (D) and ventral (V) axes are annotated: Nuclei \r\nare stained with DAPI. Error bars indicate S.E.M.<\/p>

 图4 检测小鼠皮肤纹路和肢体发育过程中EVI1的表达(图片来源参考文献[23])<\/p>

 Fig.4 EVI1 in dermatoglyph patterning and limb development (image source from reference [23])<\/p>

\"Figure<\/p>

A: 手和手指长度示意图, 指手比(DHR)是指手指长度与手长度的比值。B: 斗型花纹出现频率与各手指DHR的相关性。使用Z分数来标准化左\r\n手和右手的平均DHR。 红点表示平均值, 短黑线表示每组的标准差。 箭头表示线性回归通过显著性检验。C: 各指斗型花纹与平均DHR值关\r\n系条形图。误差线表示标准误差。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。D: 各指斗型花纹与平均DHR值的遗传相关性。使用GCTA软件的双变量\r\nGREML进行估计和检验。误差线表示标准误差。\r\nA: diagrammed human hand with measured phenotypes, including hand and digit length. The digit-hand ratio (DHR) is the ratio of digit length and \r\nhand length. B: the association between the whorl frequency of eight digits (D2-D5) and the DHR of each digit. We used Z-score to standardize the \r\nmean DHR of left and right hands. Red dots indicate the average values and short black lines the standard deviation for each group. The arrow indicates \r\nthe linear regression passes the significance test. C: bar plot of fingerprint patterns of each digit (D2-D5) and the mean DHR of D5. Error bars indicate \r\nS.E.M. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. D: genetic correlations between fingerprint patterns and the mean DHR of D5. Estimates and tests were performed using the bivariate GREML of GCTA software. Error bars indicate S.E.M. <\/p>

图5 指纹花纹和手征间关系(n=6 318)(图片来源参考文献[23]) <\/p>

Fig.5 Association between fingerprint patterns and hand phenotypes (n=6 318) (image source from reference [23])<\/p>


<\/strong><\/p>

前景广博, 助力识别潜在疾病风险<\/strong> <\/p>

    肤纹在早期胚胎发育阶段形成, 出生后便不再改变[2]。而在表皮嵴发育阶段, 研究发现皮肤内已经出现了血管神经对, 其与肤纹发育处于同一时期。\r\n当肤纹发育不全或发育异常时, 常伴有神经等的发育异常[32]。CUMMIN[33]首次于1936年观察到唐氏综\r\n合征患者的肤纹出现异常, 如通贯手(断掌), 从而开创了医学皮肤纹理学的研究。之后一系列研究也发现肤纹和染色体畸变综合征、单基因疾病等都有着\r\n密切联系[34-37]。我们研究所揭示的影响指纹花纹形成的是一系列肢体发育相关的重要基因, 这些基因在人体发育中往往起着重要的‘一因多效’作用, 为肤纹与人体其他表型与疾病的关联研究提供了重要理论基础。通过肤纹特征和先天遗传病间的统计分析, 筛选出患者的最佳皮肤纹理特征组合, 有望运用在新生儿先天性疾病的早期筛查中, 从而实现早诊断、早治疗。 <\/p>


<\/p>

范式革新, 展现人类表型组学创新策源重大意义<\/strong> <\/p>

     人类表型组, 是人体所有生物特征的集合。开展人类表型组研究一个很重要的目的, 就是要发现\r\n基因–表型–环境之间以及宏观–微观表型之间的关联机制, 尤其是“强关联”及其背后的机制。基于人类表型组计划“测一切之可测”的理念, 量化相当规模的志愿者肤纹特征, 并寻找其与其他表型或疾病之间的关系, 进而发现并解析表型之间的强关联, \r\n尤其是那些现在科学家还没有注意到的、与人类健康息息相关的表型间的强关联, 最终形成一张由各种强关联组成的“导航图”, 为未来的生命健康研究提供新的指引和方向。<\/p>


<\/p>

参考文献 (References) <\/p>

[1] CUMMINS H, MIDLO C. Palmar and plantar epidermal ridge \r\nconfigurations (dermatoglyphics) in European-Americans [J]. \r\nAm J Phys Anthropol, 1926, 9(4): 471-502.<\/p>

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[24] KARMAKAR B, YAKOVENKO K, KOBYLIANSKY E. Mode \r\nof inheritance of dermatoglyphic pattern intensity index on fin\u0002gers in five Indian populations: a comparative study between individual trait and its factor [J]. Am J Hum Biol, 2006, 18(3): 377-86.<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/22-07-26-16-06-39-458.jpg","cshort":"

汪思佳, 中国科学院上海营养与健康研究所研究员、博士生导师。现任中国科学院计算生物学重点实验室副主任、中国科学院上海生物医学大数据中心副主任。目前课题组的主要科研方向为开发及运用系统组学分析方法及人工智能算法, 利用人群队列产生的生物大数据构建人体表型与遗传及环境暴露因素的互作网络, 建立预测个体健康状况的算法模型。<\/p>

 https://www.picb.ac.cn/dermatogenomics<\/p>","cshort2":"
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汪思佳, 中国科学院上海营养与健康研究所研究员、博士生导师。现任中国科 学院计算生物学重点实验室副主任、中国科学院上海生物医学大数据中心副主任。目前课题组的主要 科研方向为开发及运用系统组学分析方法及人工智能算法, 利用人群队列产生 的生物大数据构建人体表型与遗传及环境暴露因素的互作网络, 建立预测个体 健康状况的算法模型。<\/p>

 https://www.picb.ac.cn/dermatogenomics<\/p>


<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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肿瘤干细胞标志物ALDH1A1通过重塑免疫微环境促进乳腺癌进展<\/p>

刘翠翠 张立行 柳素玲*<\/p>

(复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所&生物医学研究院, 上海医学院, 上海市乳腺肿瘤重点实验室, 上海 200032)<\/p>


<\/p>

【<\/strong>摘要】     <\/strong>醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)是包括乳腺癌在内的多种癌症中肿瘤干细胞的功能性标志物, 在肿瘤发生发展过程中扮演了重要角色。但是, ALDH1A1对肿瘤免疫微环境的影响及其调控机制尚不明确。该研究发现, ALDH1A1依赖于其酶活性促进乳腺肿瘤干细胞的自我更新以及肿瘤生长, 同时肿瘤细胞中具有酶活性的ALDH1A1还可以促进肿瘤微环境中骨髓来源的免疫抑制细胞(MDSCs)的富集并抑制抗肿瘤免疫细胞活性。机制上, 该团队发现具有酶活性的ALDH1A1可以通过降低肿瘤细胞内的pH值来激活TAK1-NFκB信号通路, 激活的TAK1-NFκB信号通路通过上调粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)的分泌增加MDSCs在乳腺癌免疫微环境中的富集比例以及增强对杀伤性T细胞增殖和活化的抑制作用, 从而促进肿瘤的生长。针对这一调控机制, 该团队设计了具有MDSCs清除作用的化疗药物吉西他滨和ALDH1A1酶活性抑制剂双硫仑的联合治疗思路。免疫健全小鼠体内实验结果显示, 二者联合可以更好地抑制乳腺癌的生长。这些研究结果进一步阐明了肿瘤干细胞标志物ALDH1A1对乳腺癌发生发展的影响及其发挥作用的具体分子机制, 并揭示了ALDH＋乳腺肿瘤干细胞对MDSCs富集的调控作用, 为乳腺癌的临床治疗提供了新的思路。<\/p>

【关键词】 乳腺癌; 肿瘤干细胞; ALDH1A1; 骨髓来源的免疫抑制细胞; 细胞内pH; TAK1; NFκB; GM-CSF<\/p>


<\/p>

ALDH1A1 Activity in Cancer Stem Cells Remodels Immune-Microenvironment to Promote Breast Cancer Progression<\/p>

LIU Cuicui, ZHANG Lixing, LIU Suling*<\/p>

(Fudan University Shanghai Cancer Center & Institutes of Biomedical Sciences, Key Laboratory of Breast Cancer in Shanghai, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)<\/p>


<\/p>

【Abstract】 CSCs (cancer stem cells) are associated with tumor initiation, growth, metastasis and recur\u0002rence. ALDH1A1 (Aldehyde dehydrogenase 1A1) is a CSC marker in many cancers, including breast cancer, however the molecular mechanisms of ALDH1A1 functioning in solid tumors remain largely unknown. Here, the studies by LIU and colleagues demonstrate that ALDH1A1, solely relying on its enzymatic activity, decrease the intracellular pH of breast cancer cells to promote the phosphorylation of TAK1 and activate NFκB signaling pathway and then increase the secretion of GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor), which lead to MDSCs (myeloid derived suppressor cells) expansion and anti-tumor immunity suppression to facilitate breast tumor growth. Furthermore, the combination of ALDH1A1 inhibitor DSF (disulfiram) and chemothera\u0002peutic agent GEM (gemcitabine) could cooperatively inhibit breast tumor growth and tumorigenesis by purging ALDH+ breast CSCs and activating T cell immunity. These findings elucidate the mechanisms of how active ALDH1A1 modulates tumor immunity to promote tumor development, which will shed light on new therapeutic strategies for malignant breast tumor.<\/p>

【Keywords】 breast tumor; cancer stem cell; ALDH1A1; myeloid-derived suppressor cell; intracellular pH; TAK1; NFκB; GM-CSF<\/p>


<\/p>

1 乳腺肿瘤干细胞与ALDH1A1的研究背景<\/strong><\/p>

     肿瘤治疗后的复发和转移仍然是目前为止恶性肿瘤患者需要面对的严峻问题, 给肿瘤的临床治疗带来了极大的困难和挑战。常规的治疗手段如手术切除和放化疗等, 都不可完全消灭肿瘤细胞。研究表明, 在肿瘤组织内存在一小部分致瘤能力特别强、分化程度极低的细胞, 它们具有干细胞的自我更新及多向分化特性, 称为“肿瘤干细胞”[1]。我们和国内外众多研究小组的研究均表明, 乳腺癌组织中也存在这么一小群具有肿瘤生成能力、可以自我更新、分化程度较低的肿瘤干细胞, 即乳腺肿瘤干细胞(breast cancer stem cells, BCSCs), 它们是乳腺癌治疗耐受、复发和转移的关键因素[2]。醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)是一组依赖烟酰腺嘌呤核苷酸磷酸(NADP)作为辅酶的催化酶, 其生理功能是将内源性和外源性醛类物质氧化为相应的羧酸类物质。现在, 研究者们也通过检测肿瘤细胞内ALDH酶的活性来标志BCSCs[3]。人体总共有19种不同的ALDH同工酶, 但是乳腺癌中只有少数几种ALDH同工酶具有生物化学功能, 其中ALDH1A1是BCSCs中ALDH酶活性的主要承担者[4-5]; 过去的研究已经发现ALDH1A1在乳腺癌的发生、转移和耐药方面均发挥十分重要的促进作用[6]。同时, 高表达ALDH1A1的三阴性乳腺癌组织中PD-L1阳性细胞也更多[7], 而抗原递呈相关蛋白(TAP1和TAP2)和共刺激分子CD80在ALDH+乳腺癌细胞中则呈现低表达[8], 这种表达模式也使得ALDH+乳腺癌细胞更容易逃逸机体的免疫杀伤[9]。因此, ALDH1A1分子不仅是BCSCs的标志物, 同时也是乳腺癌发生发展和不良预后的预测分子。虽然关于ALDH1A1在乳腺癌细胞中的生物学功能已经有很多报道, 然而ALDH1A1促进乳腺癌发生进展是否与其酶活性有关以及ALDH1A1调控乳腺癌免疫抑制微环境的具体作用机制尚不明确, 解决以上问题将为我们未来靶向抑制肿瘤干细胞及其免疫抑制微环境带来新的希望。<\/p>


<\/p>

2 ALDH1A1酶活性乳腺癌细胞和小鼠模型的设计和构建<\/strong><\/p>

     我们在之前的研究中已经发现, 从过表达了ALDH1A1的乳腺癌细胞系中分离出的ALDH＋肿瘤细胞群虽然具有较强的致瘤能力, 但是相对于ALDH–肿瘤细胞群, 两群细胞中的ALDH1A1 mRNA和蛋白表达水平均无明显差异, 提示ALDH1A1促进ALDH+ BCSCs富集及肿瘤发生的作用可能不仅依赖于其表达水平, 而且与其ALDH酶活性密切相关。为了验证上述猜想, 我们构建了过表达ALDH1A1野生型和K193Q/R突变体的慢病毒载体, 其中K193位点是ALDH1A1与其发挥酶活性必需的辅酶NADP结合的关键位点之一。实验结果显示, 相较于对照组, ALDH酶活性在ALDH1A1野生型组明显上升, 而在K193Q/R突变体组无明显变化; 同时, 过表达ALDH1A1野生型和K193Q/R突变体组的肿瘤细胞中ALDH1A1蛋白表达水平并没有显著差异。因此, 我们得到了仅改变ALDH1A1的酶活性而不影响其蛋白表达的细胞模型(图1)。<\/p>

\"领域前沿-1.jpg\"/<\/p>

A: K193是ALDH1A1的重要酶活性位点, 可与NADP+形成化学键(氢键), 通过碱基突变将193位点的赖氨酸残基K突变为谷氨酰胺或精氨酸(Q/R), 从而只丢失ALDH1A1酶活性而不影响其蛋白表达水平; B~D: 建立过表达Aldh1a1/ALDH1A1突变体(K193Q/R) 4T1和MDA-MB-231稳定细胞系, 通过Western blot验证ALDH1A1及其突变体的过表达效果, 通过ALDEFLUOR实验和流式分析检测各组肿瘤细胞ALDH酶活性。所有结果统计数据均以x±s表示, 采用One-Way ANOVA检验, **P<\/em><0.01, ***P<\/em><0.001。<\/p>

A: K193 is a vital enzyme activity site for ALDH1A1 which could form chemical bond (hydrogen bond) with NADP+. Then, K was mutated to Q/R at 193 residue to lose ALDH1A1 enzyme activity but not protein expression. B-D: 4T1 and MDA-MB-231 stable cell lines were established with the overexpression of Aldh1a1/ALDH1A1 wild-type or mutants (K193Q/R). The ALDH enzyme activity was determined by ALDEFLUOR assay and FACS. Data were presented as x_±s, One-Way ANOVA test was utilized, **P<\/em><0.01, ***P<\/em><0.001.<\/p>

图1 ALDH1A1酶活缺失突变体构建策略(根据参考文献[10]修改)<\/p>

Fig.1 The strategy to construct ALDH1A1 mutations in K193Q/R (modified from reference [10])<\/p>


<\/strong><\/p>

3 ALDH1A1依赖其酶活性促进肿瘤干细胞自我更新和乳腺癌的生长<\/strong><\/p>

      我们利用构建的ALDH1A1野生型和K193Q/R突变体模型探究了ALDH1A1酶活性对BCSCs干性的调控作用。肿瘤微球形成实验结果显示, 相较于对照组, ALDH1A1野生型组肿瘤细胞的自我更新能力明显增强, 而在K193Q/R突变体组未看到类似现象; 同时, 有限梯度稀释成瘤实验结果显示, ALDH1A1依赖其酶活性促进了原位移植瘤起始能力和肿瘤生长(图2和表1)。这些实验结果均提示了ALDH1A1对BCSCs干性的维持作用依赖ALDH1A1酶活性。<\/p>


<\/p>

\"领域前沿-2.jpg\"/图2 ALDH1A1依赖其酶活性促进 ALDH+\r\n BCSCs的自我更新和肿瘤形成(根据参考文献[10]修改) <\/span><\/p>

Fig.2 ALDH1A1 increased ALDH+\r\n BCSCs self-renewal and promoted breast tumor growth \r\nrelying on its enzyme activity (modified from reference [10])<\/p>

\"未标题-1.jpg\"/<\/p>


<\/strong><\/p>

4 ALDH1A1依赖其酶活性诱导了肿瘤免疫抑制细胞MDSCs的富集<\/strong><\/p>

       为了解析ALDH1A1对乳腺癌免疫微环境的重塑作用, 我们利用小鼠Basal-like乳腺癌4T1-Aldh1a1和K193Q/R突变体细胞在免疫健全小鼠Balb/c上构建了乳腺原位同种异体移植瘤模型, 并利用多色流式细胞技术对移植瘤中多种免疫细胞的富集情况进行了分析。分析结果显示, 肿瘤免疫微环境中MDSCs占主要成分且其浸润比例发生了明显变化, 相比于对照组, MDSCs在Aldh1a1野生型组肿瘤组织和脾脏中的富集比例明显增加, 而在K193Q/R组无明显变化; 同时, 我们还检测了MDSCs对杀伤性CD8+T细胞的抑制性, 实验结果显示, IFN-γ+CD8+和TNF-α+CD8+T细胞Aldh1a1组免疫微环境中的浸润比例明显下降, 而在K193Q/R组中无类似现象(图3)。与此相反, 应用ALDH酶活抑制剂或者敲低乳腺癌细胞中Aldh1a1表达都展示出了其对微环境中MDSCs富集的抑制效果。这些研究结果揭示了ALDH+BCSCs生物标志物Aldh1a1对乳腺癌免疫微环境中MDSCs的富集和对杀伤性CD8+T细胞的抑制作用。<\/p>

\"领域前沿-3.jpg\"/<\/p>

图3 ALDH1A1依赖其酶活性促进肿瘤微环境中MDSCs的富集和抑制CD8+\r\n T细胞的浸润(根据参考文献[10]修改) <\/p>

Fig.3 ALDH1A1 increased MDSCs and suppressed T cell immunity relying on its enzyme activity (modified from reference [10])<\/p>


<\/strong><\/p>

5 ALDH1A1依赖其酶活性降低肿瘤细胞pH值并促进TAK1-NFκB信号通路激活<\/strong><\/p>

        为了深入剖析ALDH1A1重塑乳腺癌免疫微环境的分子调控机制, 我们使用MDA-MB-231-AL\u0002DH1A1野生型和K193Q/R突变体肿瘤细胞进行了RNAseq测序和GSEA分析等实验, 结果显示, AL\u0002DH1A1通过激活NFκB信号通路来上调肿瘤细胞内GM-CSF分泌水平; 进一步, 磷酸激酶芯片实验结果显示, ALDH1A1依赖其酶活性通过上调TAK1的磷酸化水平激活NFκB信号通路。另外, 研究发现, ALDH1A1依赖其酶活性明显降低了肿瘤细胞内的pH值; 而且, 活体移植瘤的核磁共振成像实验结果也证实了ALDH1A1对乳腺癌组织pH值的调控作用; 同时, 我们也通过实验证实了肿瘤细胞内pH值的变化对TAK1磷酸化水平的调控作用。根据以上实验结果, 我们得出结论: ALDH1A1依赖其酶活性通过降低肿瘤细胞内pH值来激活TAK1-NFκB信号通路, 进而上调肿瘤细胞GM-CSF表达, 促进肿瘤免疫微环境中MDSCs的富集和抑制抗肿瘤T细胞免疫应答, 从而促进乳腺癌的进展(图4)。<\/p>

\"领域前沿-4.jpg\"/<\/p>

ALDH1A1依赖于酶活性降低乳腺癌细胞内pH以激活TAK1-NFκB信号通路, 进而导致GM-CSF分泌水平增加, 继而诱导MDSCs扩增并降低抗肿瘤免疫, 从而促进乳腺癌的发展。<\/p>

ALDH1A1, relying on its enzyme activity, decreased the pHi (intracellular pH) of breast cancer cells to promote the phosphorylation of TAK1 and acti\u0002vate NFκB signaling pathway and then increased the secretion of GM-CSF, which led to MDSCs expansion and immunosuppression to facilitate breast tumor growth.<\/p>

图4 ALDH1A1重塑免疫微环境促进肿瘤生长的分子机制模式图(根据参考文献[10]修改)<\/p>

Fig.4 The molecular mechanisms of ALDH1A1 on remodeling tumor immune-microenvironment in breast tumor (modified from reference [10])<\/p>


<\/strong><\/p>

6 ALDH抑制剂双硫仑和具有MDSCs清除作用的化疗药物吉西他滨联合治疗乳腺癌<\/strong><\/p>

        针对ALDH1A1促进乳腺癌进展的调控机制,我们设计了一种联合治疗思路以更高效地靶向治疗恶性乳腺癌, 使用可以清除MDSCs的化疗药物吉西他滨(gemcitabin, GEM)和ALDH1A1酶活性的抑制剂双硫仑(disulfiram, DSF)单独或联合治疗免疫功能健全小鼠乳腺原位移植瘤, 结果显示, DSF和GEM的联合治疗显著抑制了移植瘤的生长, 而且联合治疗效果优于任何一个单药治疗效果。有趣的是, DSF或GEM单一处理均可以抑制ALDH+BCSCs在移植瘤组织内的富集, 而且这种抑制效应在联合治疗中得到了明显增强; 同时, 结果显示GEM确实有效清除了肿瘤免疫微环境中MDSCs, 并增加了其中TNF-α+CD8+和IFN-γ+CD8+ T细胞的浸润比例, 这些效应均在DSFGEM联合治疗中得到增强。为了进一步证明DSF是通过抑制肿瘤细胞内ALDH1A1酶活性来发挥作用的, 我们在NOD-SCID免疫缺陷鼠上构建了三阴性乳腺癌的PDX(patient\u0002derived xenograft)模型USTC11, 并使用DSF和GEM进行单独或联合治疗。结果显示, DSF或GEM的单药治疗均可显著抑制PDX移植瘤的生长和ALDH＋BCSCs的富集; 然而, DSF和GEM的联合治疗并未明显增强任何一个单药治疗效果。我们猜测, 这可能是由于NOD-SCID免疫缺陷鼠体内缺乏MDSCs可靶向的免疫细胞, 尤其是缺乏具有抗肿瘤活性的杀伤性CD8+T细胞所导致的。<\/p>


<\/p>

7 总结与展望<\/strong><\/p>

        总体上, 本研究发现ALDH1A1依赖其酶活性降低了乳腺癌细胞内pH激活了TAK1-NFκB信号通路, 进而诱导了肿瘤细胞GM-CSF分泌水平的增加, 继而促进了肿瘤免疫微环境中MDSC的扩增并抑制了抗肿瘤免疫活性, 从而促进了乳腺癌的发展。这些研究结果进一步阐明了BCSCs标志物ALDH1A1对乳腺癌发生发展的影响及其分子调控机制, 为ALDH+BCSCs和MDSCs相互调控作用提供了直接证据, 为乳腺癌的临床治疗提供了新的有效治疗靶点。MDSCs是一群造血干细胞分化来源的未成熟的早期髓系细胞。研究人员普遍认为, 在正常生理条件下, 骨髓中的MDSCs快速终末分化为成熟的单核细胞或者中性粒细胞被释放入外周循环系统; 在某些病理条件下, 如肿瘤的发生, 这群未成熟的髓系细胞, 受肿瘤细胞分泌的细胞因子等因素刺激, 将大大扩增并停止进一步的分化, 然后在肿瘤免疫微环境中大量浸润, 并产生高度免疫抑制活性[11-12]。在小鼠中, 这群细胞具有CD11b+Gr1+的特异性表面分子表达, 而在人体中, 它们的表型为Lin–HLA–DR–CD33+或CD11b+CD14–CD33+。人肿瘤组织中MDSCs的一个重要特征是它们与机体外周血中性粒细胞非常相似, 因此, 浸润到肿瘤微环境的MDSCs似乎是一种可以发挥免疫抑制活性的变异“中性粒细胞”[13-16]。在人和小鼠多种肿瘤中均可以观察到肿瘤微环境和全身性的MDSCs的积累, 而且肿瘤组织内和外周循环中MDSCs的富集与多种肿瘤的不良预后密切相关[17-18]。因此, 理论上诱导MDSCs耗竭或者逆转其免疫抑制活性可以在一定程度上重建机体的肿瘤免疫监视功能, 从而使其与各种治疗策略配合以控制肿瘤的进展。目前研究发现, 肿瘤可以通过多个机制促进肿瘤微环境中MDSCs的扩增和招募从而调控肿瘤的进展, 其中就包括与肿瘤干细胞相关的调控机制[19-20]。值得注意的是, MDSCs也可以通过多种途径促进肿瘤干细胞的干性[13], 因此, 这样就会形成一个恶性循环, 即肿瘤干细胞招募MDSCs, MDSCs反过来促进肿瘤干细胞干性, 最终共同促进肿瘤病人的治疗耐受、肿瘤复发和转移。该项研究为打破这一恶性循环提供了新视角, MDSCs和BCSCs之间恶性循环的打破重塑了机体对乳腺肿瘤干细胞的免疫监视, 从而控制了肿瘤的进展; 另外, 此项研究对肿瘤的临床免疫治疗具有重要的启示性意义, 打破MDSCs和BCSCs之间恶性循环可以提高机体的抗肿瘤免疫活性, 从而为后续免疫治疗的成功提供可能。<\/p>


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参考文献 (References)<\/strong> <\/p>

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柳素玲, 复旦大学生物医学研究院和肿瘤医院双聘、二级教授, 博士研究生导师。  2005至2008年获美国苏珊–库门癌症基金会博士后奖, 2006年获美国癌症协会默克学者奖, 2010年获美国癌症协会苏珊–库门学者奖, 2014年获USCACA-NFCR学术奖, 2018年获得中国肿瘤青年科学家奖, 2020年获药明康德生命化学研究奖。作为通讯或共同通讯作者在<\/span>Nat Cell Biol、Advanced Science、Nat Commun、Science Advances、Cancer Res、Clinical Cancer Research、Mole Cancer<\/em>等国际杂志上共发表论文29篇。共发表SCI论文81篇, 论文总他引超过18 000次。共获得国际专利5项、申请中国专利5项(2项已获批)。<\/span><\/p>","cshort2":"
\"image001.jpg\"<\/td>

柳素玲, 复旦大学生物医学研究院和肿瘤医院双聘、二级教授, 博士研究生导师。获中国科\r\n学技术大学生物系学士学位, 美国俄亥俄州立大学博士学位; 博士毕业后加入美国密歇根大学癌症研究中心从事博士后研究工作, 随后被聘为研究助理教授。\r\n2005至2008年获美国苏珊–库门癌症基金会博士后奖, 2006年获美国癌症协会默克学者奖, 2010年获美国癌症协会苏珊–库门学者奖, 2014年获USCACA-NFCR学术奖, 2018年获得中国肿瘤青年科学家奖, 2020年获药明康德生命化学研究奖。作为通讯或共同通讯作者在Nature Cell Biology、Advanced\r\nScience、Nature Communications、Science Advances、Cancer Research、Clinical Cancer Research、Molecular Cancer<\/em>等国际杂志上共发表论文29篇。共发表SCI论文81篇, 论文总他引超过18 000次。共获得国际专利5项、申请中国专利5项(2项已获批)。课题组长期从事乳腺癌干细胞异质性调控分子机制和精准靶向研究。近期在Cancer Research发表的研究揭示了ALDH1A1依赖其酶活性对乳腺癌免疫微环境的重塑和促癌作用及其具体分子机制, 帮助我们更好地阐明了干细胞标志物ALDH1A1对乳腺癌发生发展的影响, 为恶性乳腺癌的临床治疗提供了新的思路。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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5-IP7小分子是神经调控胰岛素分泌和葡萄糖稳态过程中的胆碱能GPCR第二信使<\/p>

李娜 饶枫*<\/span><\/p>

(南方科技大学生命科学学院, 深圳 518055)<\/span><\/p>


<\/p>

【摘要】5-焦磷酸–五磷酸肌醇(5-IP7)是一种进化上保守的小分子代谢物, 其作用模式尚不清\r\n楚。该研究揭示5-IP7通过介导突触结合蛋白-7(Syt7)依赖性胰岛素释放的副交感刺激信号参与葡\r\n萄糖稳态的神经调控。迷走神经刺激通过毒蕈碱乙酰胆碱受体-Gαq-PLC-PKC/PKD磷酸化激活5-IP7\r\n的合成酶IP6K1。5-IP7及其前体IP6都与PIP2竞争Syt7。然而, Ca2+以高亲和力选择性结合5-IP7, 释放\r\nSyt7以促进囊泡膜相互作用。β细胞特异性IP6K1缺失可减少毒蕈碱刺激引起的胰岛素分泌和葡萄\r\n糖清除; 而模拟IP6K1磷酸化活化的突变体表现出胰岛素释放能力增强、先天性高胰岛素血症和肥\r\n胖, 这些表型在Syt7基因敲除后消失。此研究提出了一个新的概念框架来理解焦磷酸肌醇生理学: \r\n5-IP7是外周神经系统和代谢器官之间联系的GPCR信号信使, 它将Gq偶联的GPCR刺激传递给Syt7\r\n依赖性的生物学过程。<\/span><\/p>


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【关键词】 5-IP7; G蛋白偶联受体; 突触结合蛋白-7; 胰岛素分泌<\/span><\/p>


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5-IP7 is a GPCR Messenger Mediating Neural Control of Insulin \r\nExocytosis and Glucose Homeostasis<\/span><\/p>

LI Na, RAO Feng* <\/span><\/p>

(School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, Shenzhen 518055, China)<\/span><\/p>

【Abstract】 5-IP7 (5-diphosphoinositol pentakisphosphate) is an enigmatic signaling metabolite. This study \r\nelucidated a GPCR pathway that utilized 5-IP7 as a 2nd messenger to mediate neural control of endocrine secretion \r\nand metabolic homeostasis. Specifically, vagal stimulation activates IP6K1, the 5-IP7 synthase, is activated via a \r\nmuscarinic acetylcholine receptor-Gαq-PLC-PKC/PKD phosphorylation axis in pancreas. Upon parasympathetic \r\nnerve input, this pathway activates by mediating parasympathetic stimulation of Syt7 (synaptotagmin-7)-dependent \r\ninsulin release. Both 5-IP7 and its precursor IP6 compete with PIP2 for Syt7. However, Ca2+ selectively binds 5-IP7\r\nwith high affinity, freeing Syt7 to promote vesicle membrane interaction. β-cell specific IP6K1 deletion diminishes \r\ninsulin secretion and glucose clearance elicited by muscarinic stimulation; whereas mice carrying a phosphoryla\u0002tion-mimic, hyperactive IP6K1 mutant display augmented insulin release, congenital hyperinsulinism, and obesity. \r\nThese phenotypes are absent in a Syt7 null background. This study suggests a new conceptual framework to un\u0002derstand inositol pyrophosphate physiology: 5-IP7 is a metabolic messenger for GPCR signaling at the interface \r\nbetween peripheral nervous system and metabolic organs, where it transmits Gq-coupled GPCR stimulation to un\u0002clamp Syt7-dependent and perhaps other exocytotic events.<\/span><\/p>


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【Keywords】 5-diphosphoinositol pentakisphosphate; GPCR; synaptotagmin-7; insulin secretion<\/p>


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1 胰岛素和磷酸肌醇研究背景<\/p>

随着经济社会发展, 糖尿病(diabetes mellitus, \r\nDM)已经成为对人类生命健康产生严重危害的慢性病。其主要临床特点是循环血液中异常升高的血糖浓度, 并可能伴有胰岛素抵抗以及糖代谢、脂代谢、\r\n氨基酸代谢等代谢紊乱, 是一种代谢性疾病。其临床表现为多饮、多尿、多食, 体重下降, 被概括为“三多\r\n一少”。除此之外, 严重的糖尿病患者有很多并发症, \r\n包括糖尿病酮症酸中毒(diabetic ketoacidosis, DKA)\r\n和高渗高血糖综合征这两种急性严重代谢紊乱, 以\r\n及许多慢性并发症, 如糖尿病肾病、糖尿病性视网膜\r\n病变、神经系统并发症等。糖尿病患者发生动脉粥样硬化的风险较大, 糖尿病是动脉粥样硬化的危险因\r\n素, 易引发冠心病、缺血或出血性脑血管病等, 这些对于患者生命健康都是很严重的威胁[1]。<\/p>

胰岛素是一种由胰岛β细胞分泌的激素, 是体内唯一的降血糖激素, 胰岛素通过促进肝细胞、脂肪细胞及骨骼肌细胞对葡萄糖的吸收从而调控血糖。另外胰岛素也调控脂代谢及氨基酸代谢。胰岛素蛋白由51个氨基酸组成, 分子量约为5.8千道尔顿(kDa), 由二硫键连接A链与B链而成[2-3]。胰岛素分泌的严格精细调控对于血糖稳态具有非常重要的意义。其分泌受血糖浓度、神经信号以及多种激素的复杂调控[4]。胰岛β细胞的破坏及分泌功能受损会导致分泌至血液中的胰岛素含量减少, 而长\r\n期过量的胰岛素分泌则会引起机体对胰岛素敏感性的降低, 从而造成胰岛素抵抗(insulin resistance, \r\nIR)。因此, 胰岛素分泌异常是糖尿病发病的重要原因。<\/p>

磷酸肌醇信号通路起源于G蛋白偶联受体(G \r\nprotein coupled receptor, GPCR)。GPCR在接受外源信号刺激后激活质膜上的磷脂酶C, 其切割PIP2生成的IP3除了能促进内质网中钙离子释放外 , 还能被多级磷酸肌醇激酶催化进入多磷酸肌醇代谢途径。Ins(3,4,5)P3首先被IPMK或IP3K磷酸化生成Ins(1,3,4,5)P4或Ins(1,4,5,6)P4, 然后IP4被ITPK或\r\nIPMK催化生成IP5, 再者IP5被IP5K催化生成IP6, IP5\r\n和 IP6是细胞中最多的两种磷酸肌醇 , 含量远多于IP3。IP6Ks催化5’位焦磷酸化产生5-IP7, PP-IP5K则\r\n催化1’位焦磷酸化产生1-IP7。最后5-IP7还可以实现\r\n1’位和5’位两个位点的同时焦磷酸化生成IP8。同时, \r\n体内存在磷酸肌醇的磷酸水解酶(diphosphoinositol\u0002poly-phosphate phosphohydrolases, DIPPs), 可以将IP8\r\n依次水解为5-IP7、IP6和IP5(图1)[5-6]。<\/p>

六磷酸肌醇激酶的功能有很多, 包括参与DNA损伤修复[7]、肿瘤转移[8]、能量消耗[9]、脂质代谢[10]和胰岛素信号通路[11]等。2007年, ILLIES等[12]通过电生理学实验测量β细胞膜电容证明了5-IP7在促进胞吐作用中起重要作用。IP6K1全身敲除的小鼠表现出胰岛素分泌减少的情况[13], 这些都证实5-IP7与胰岛素分泌关系密切。但是, 5-IP7如何参与囊泡释放是磷酸肌醇领域十多年来未解决的问题。我们最近发现β细胞里的5-IP7是GPCR第二信使, 其通过传递神经递质\r\n信号来介导胰岛素分泌的神经调控[14]。<\/p>


<\/p>

2 5-IP7生成受副交感神经信号调控<\/p>

毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcho\u0002line receptors, mAChRs)是细胞膜表面的一种GPCR, \r\n接受来自副交感神经的神经递质乙酰胆碱。胰岛β细胞表面的M3R响应副交感神经后可促进胰岛素分泌。其信号转导机制中下游重要的蛋白激酶为蛋白激酶C(PKC), 我们首先在体外证明了PKC可以磷酸化IP6K1的S118/S121位点(图2a)。随后, 我们使用制备的S118/121磷酸化抗体在细胞里证实, S118/121磷酸化受胆碱能受体激动剂调控(图2b), 其信号转导是通过Ach-M3R-Gαq/11-PLC-PKC/PKD-IP6K1路径实现的(图2c)。在酶活方面, 我们利用体外实验发现, PKC/PKD可增加IP6K1的酶活, 促进生成更多的\r\n5-IP7(图2d)。同时, 在细胞里, PKC的激动剂佛波酯\r\n(PMA)可显著增加细胞内5-IP7的含量(图2e), 乙酰胆\r\n碱类似物卡巴胆碱也可以增加细胞内5-IP7的含量,同样的过表达Gαq/11蛋白也可以增加5-IP7的含量。\r\n更为重要的是, 我们在迷走神经背核直接激活迷走神经可以在胰腺里检测到IP6K1磷酸化水平的增加, \r\n这种增加可以被迷走神经切除术阻断。这些都表明, \r\nIP6K1在生理状态下响应副交感神经并被激活, 促使\r\n5-IP7产生从而发挥功能。这是关于IP6Ks酶活的生\r\n理调控的首次报道, 是中枢调控外周的一项新发现。<\/p>

\"领域前沿-1.jpg\"/<\/p>

IP6K介导的IP6至5-IP7间的动态转换可能参与了细胞对外界信号/刺激/胁迫的应答。然而, IP6K参与应答的信号以及5-IP7的靶标与作用机制未\r\n知。\r\nIP6K1-catalyzed IP6 to 5-IP7 turnover may be involved in the cell response to external signals/stimuli/stresses. However, the signal IP6K responds, the \r\ntarget and mechanism of 5-IP7 were hitherto unknown<\/span><\/p>

图1 高级多酸肌醇代谢分子的信使功能与机制研究 <\/p>

Fig.1 The inositol polyphosphate synthetic pathway<\/p>


<\/p>

\"领域前沿-2.jpg\"/a: 体外PKC/PKD磷酸化IP6K1; b: 乙酰胆碱激动剂促进IP6K1 S118/121位点磷酸化, *非特异性条带; c: 乙酰胆碱到IP6K1信号转导通路; d: 体外\r\nPKC/PKD促进IP6K1酶活; e: PKC激活剂PMA促进5-IP7生成, **P=0.005。\r\na: PKC/PKD phosphorylate IP6K1 in vitro; b: acetylcholine agonists promote the phosphorylation of IP6K1 S118/121. * nonspecific band; c: scheme \r\ndepicting the signaling pathway from acetylcholine to IP6K1; d: PKC/PKD activate IP6K1 in vitro; e: PKC activator PMA stimulates 5-IP7 production. \r\n**P=0.005.<\/span><\/p>

图2 IP6K1受副交感神经系统调控激活(根据参考文献[14]修改) \r\nFig.2 IP6K1 is regulated and activated by parasympathetic nervous system via PKC/D (modified from reference [14])<\/p>


<\/p>

3 IP6K1磷酸化模拟突变体小鼠胰岛素分泌<\/p>

为了探究5-IP7的功能, 我们构建了IP6K1S118/121D模拟磷酸化突变的小鼠(DD鼠), 在DD鼠的胰腺组织中, 发现了更高水平的5-IP7(图3a), 且DD鼠具有更高的血清胰岛素水平(图3b), 这也进一步证实了之前的结论, 5-IP7能够促进胰岛素囊泡释放。同时, 在葡萄糖耐受实验中 , DD鼠表现出更好的葡萄糖耐受以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌。DD鼠的胰岛也表现出更好的胰岛素分泌能力。另外 , DD鼠的食物摄入 , 氧气消耗 , 二氧化碳生成 , 呼吸速率等代谢指标没有显著差异。而相反, 胰岛β细胞中特异敲除IP6K1的IP6K1fl/fl:MIP-Cre小鼠表现出受损的葡萄糖诱导的胰岛素分泌以及更差的葡萄糖耐受(图3c和图 3d)。乙酰胆碱激动剂或 DMV刺激迷走神经诱导生成胰岛素的能力在 β细胞中特异性敲除IP6K1的小鼠中显著降低(图 3e), 葡萄糖清除速率显著下降 , 因此 , IP6K1参与神经调控的胰岛素分泌过程。<\/p>


<\/p>

4 5-IP7参与胰岛素分泌机制研究<\/p>

为进一步解析5-IP7促进胰岛素分泌的机制, 我\r\n们系统表征了胰岛的数量、大小和胰岛素含量与囊\r\n泡对接程度, 以及钙内流, 发现5-IP7不参与这些过\r\n程。但是IP6K1过表达确实能够显著增加胰岛β细\r\n胞的胞吐(图4a)。胰岛素囊泡释放是一个复杂的过\r\n程, 一般认为与钙离子内流相关, 当大量钙离子内流\r\n时, 突触结合蛋白(synaptotagmin)可以感知钙离子, \r\n从而启动胰岛素囊泡的膜融合, 释放胰岛素。参与\r\n胰岛素囊泡释放的是synaptotagmin-7(Syt7)[15-16]。因此我们在DD鼠的基础上引入Syt7敲除, 随后我们发现, DD鼠胰岛素水平高的现象在Syt7敲除之后回复到野生型小鼠的水平(图4b), 因此, Syt7是5-IP7参与胰岛素分泌的重要靶点。那么5-IP7究竟如何作用于Syt7蛋白, 我们解析了Syt7与磷酸肌醇复合物的晶体结构, 发现5-IP7可与PIP2竞争结合Syt7, 从而抑制无刺激时的自发囊泡释放。在钙内流刺激的胰岛素囊泡与细胞膜融合过程中, 钙离子可与5-IP7结合, 从而促进Syt7与细胞膜上的PIP2结合, 催发SNARE介导的囊泡与细胞膜自然融合(图4c)。而5-IP7的前体IP6与钙离子的结合能力较弱, 此差异在IP6K1激活时或在IP6K1S118/121D突变体里被放大, 导致鼠胰岛素分泌高于正常水平。基于以上现象, 我们认为当Gq偶联的GPCR被激活时, 5-IP7作为与Ca2+共同作用的“共发”信使(coincident messenger)参与囊泡释放。<\/p>

\"领域前沿-3.jpg\"/<\/p>

a: DD鼠胰腺5-IP7含量, **P=0.002; b: DD鼠血清胰岛素水平, **P=0.007; c: β特异敲除IP6K1小鼠GSIS, *P=0.01; d: β特异敲除IP6K1小鼠GTT, ***P<0.001; e: β特异敲除IP6K1小鼠副交感神经激活刺激的胰岛素分泌, *P=0.028。<\/span><\/p>

a: the content of 5-IP7 in pancreas of DD mice, **P=0.002; b: serum insulin level in DD mice, **P=0.007; c: GSIS of β specific IP6K1 knockout mice, *P=0.01; d: GTT of β specific IP6K1 knockout mice, ***P<0.001; e: insulin secretion stimulated by parasympathetic nerve in β specific IP6K1 knockout mice, *P=0.028.<\/span><\/p>

图3 DD鼠和β特异敲除小鼠的胰岛素分泌(根据参考文献[14]修改) <\/span><\/p>

Fig.3 Insulin secretion in DD and β specific IP6K1 knockout mice (modified from reference [14])<\/span><\/p>


<\/span><\/p>

\"领域前沿-4.jpg\"/<\/span><\/p>

a: IP6K1过表达的细胞胞吐能力增加, **P=0.005, ***P=0.000 4; b: Syt7敲除的DD鼠的血清胰岛素水平回复到野生型鼠水平, **P=0.003; c: 5-IP7\r\n与Ca2+作为乙酰胆碱受体GPCR通路下游的“共发”信使(coincident messenger)刺激胰岛素囊泡释放的作用模式图。\r\na: increased exocytosis in IP6K1 overexpressed cells, **P=0.005, ***P=0.000 4; b: fasting serum insulin levels in male WT, IP6K1DD, Syt7−/−\r\n and \r\nIP6K1DD;Syt7−/− mice, **P=0.003. c: 5-IP7 works with Ca2+ as “coincident messengers” downstream of the acetylcholine receptor GPCR pathway to \r\nstimulate the release of insulin vesicles. <\/span><\/p>

图4 5-IP7参与胰岛素分泌机制研究(根据参考文献[14]修改) <\/p>

Fig.4 5-IP7 promotes Syt7-triggered insulin secretion (modified from reference [14])<\/p>


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5 展望<\/p>

IP6K家族蛋白的生理功能被广泛报道, 但是其调控机制未知, 我们首次发现了IP6K1在体内响应重要的神经信号, 这为探讨IP6K1更多的生理功能提供了可能的方向。已被发现的800多种G蛋白偶联受体功能非常广泛, 因此IP6K1作为下游蛋白很可能有很多的生理功能还未被发现。或许它们都在参与自主神经调控的生理过程中发挥重要的作用。另外, IP6K家族的其他蛋白或可以类似的方式被调控, 它们的调控机制及生理功能还有待被挖掘。在应用方面, IP6K1对于胰岛素分泌至关重要, 这对于糖尿病治疗来说可能是一个潜在的药物靶点, 或许可以靶向调控IP6K1从而影响胰岛素分泌以达到治疗糖尿病的目的。<\/p>


<\/p>

参考文献 (References)<\/p>

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饶枫, 南方科技大学生命科学学院生物系副教授, 研究员。新加坡国立大学生物医学学士, 南洋理工大学生物学博士, 美国约翰–霍普金斯大学医学院博士后, 加入南科大前任职北京生命科学研究所研究员。饶枫实验室(信使与代谢生物学实验室)主要研究细胞内新兴小分子信使的功能机制和蛋白质稳态的代谢调控, 以及疾病微环境中这些生命过程如何参与神经与代谢和肿瘤组织的互调互作。作为最后通讯作者在Nature<\/em> Metabolism<\/em>、PNAS<\/em>和Nature Communications<\/em>等杂志上发表研究论文多篇。成果多次被作为研究亮点点评或被F1000等推荐。<\/p>","cshort2":"
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饶枫, 南方科技大学生命科学学院生物系副教授, 研究员。新加坡国立大学生物医学学士, 南洋理工大学生物学博士, 美国约翰–霍普金斯大学医学院博士后, 加入南科大前任职北京生命科学研究所研究员。饶枫实验室(信使与代谢生物学实验室)主要研究细胞内新兴小分子信使的功能机制和蛋白质稳态的代谢调控, 以及疾病微环境中这些生命过程如何参与神经与代谢和肿瘤组织的互调互作。作为最后通讯作者在Nature Metabolism<\/em>、PNAS<\/em>和Nature Communications<\/em>等杂志上发表研究论文多篇。成果多次被作为研究亮点点评或被F1000等推荐。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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piRNA通路在哺乳动物雌性生殖中具有不可或缺的功能 <\/span><\/p>

张宏道 张英 吕小龙 吴立刚* <\/p>

(分子生物学国家重点实验室, 上海市分子男科学重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院大学, 上海 200031) <\/p>

[摘要]  <\/strong>   piRNA是一类非编码小RNA, 它在生殖细胞中针对基因组行使“免疫系统”的功能, 抑制转座元件, 维持基因组的稳定性。已有的研究表明, piRNA在模式动物果蝇和斑马鱼的两性生殖, \r\n以及小鼠的雄性生殖中都是必需的, 但对小鼠的雌性生殖却是非必需的, 因此形成了piRNA对哺乳\r\n动物的雌性生殖不重要的默认共识。该团队通过建立单细胞小RNA测序技术, 描绘了多种哺乳动\r\n物卵细胞中小RNA的表达谱, 发现了小鼠卵细胞中无论是Piwi基因还是piRNA的组成类型和表达\r\n特征在哺乳动物中均不具有代表性。该团队以piRNA表达情况更接近人类的金黄地鼠为模型, 重新研究了piRNA通路在哺乳动物中的功能, 发现了piRNA通路关键基因被敲除后雄性和雌性的生\r\n殖都受到了严重的影响, 与非哺乳动物中的表型一致。上述发现不仅为深入研究piRNA通路在高\r\n等动物卵细胞发生和早期胚胎发育中的功能和机制提供了新的切入点, 更重要的是为研究piRNA\r\n通路相关基因突变与女性生殖障碍的关联, 并针对性地开发新的治疗方法提供了重要的动物模型。 <\/p>

[关键词]<\/strong> PIWI; piRNA; 卵细胞; 转座子; 金黄地鼠 <\/p>


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The piRNA Pathway is Essential for Mammalian Female Fertility <\/span><\/p>

ZHANG Hongdao, ZHANG Ying, LÜ Xiaolong, WU Ligang* <\/p>

(State Key Laboratory of Molecular Biology, Shanghai Key Laboratory of Molecular Andrology, Center for Excellence in \r\nMolecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, \r\nUniversity of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)<\/p>

[Abstract]<\/strong>   piRNAs (piwi-interacting RNAs) are sncRNAs (small non-coding RNAs) and function as an \r\nadaptive immune system to safeguard genome integrity in the germ cells. Despite its essential role for both female \r\nand male reproduction in flies and zebrafish, piRNA pathway appears to be dispensable for female fertility in the \r\nmouse, leading to the assumption that piRNA pathway is not required for female fertility in mammals. Here, this \r\ngroup developed a single cell sequencing method for sncRNAs, and profiled the sncRNAs in oocytes of various \r\nmammals. Intriguingly, this group found that the profile of both Piwis and piRNAs expressed in mouse oocytes are \r\nnot representative in other mammals. Thus, this group reexamined the function of piRNA pathway using genetic\u0002modified golden hamsters. Notably, this group found that piRNA pathway is essential for both male and female fer\u0002tility in golden hamsters. Such an indispensable function of piRNA pathway for oogenesis is probably common in \r\nmost mammalian species, including humans. Therefore, current study opens an avenue for understanding the aetiol\u0002ogy of female infertility and provides an informative animal model for developing medicine and cure. <\/p>

 [Keywords]<\/strong> PIWI; piRNA; oocytes; transposon; golden hamster<\/p>


<\/p>

1 piRNA通路对哺乳动物雌性生殖无足轻重？ <\/strong><\/p>

    piRNA是一类长度为18~31 nt的非编码小RNA \r\n(small non-coding RNA), 特异性表达于动物的生殖\r\n细胞中, 与PIWI蛋白结合形成piRNA介导的沉默复\r\n合体(piRNA-induced silencing complexes, piRISC), \r\n在配子发生过程中行使重要的功能[1-8]。在动物中, \r\npiRNA最基本和最保守的功能是沉默转座子(trans\u0002posable element, TE)。这一功能通过转录后基因沉默\r\n(post-transcriptional gene silencing, PTGS)和转录基因沉默(transcriptional gene silencing, TGS)两种机制来实\r\n现[9]。其中, 转录后基因沉默依赖于piRNA介导的沉\r\n默复合体识别并切割靶标转座子RNA, 而转录基因沉\r\n默则是通过改变转座子所在染色质区域内DNA甲基\r\n化或组蛋白修饰来抑制转座子的转录的[10]。除了上\r\n述功能之外, 越来越多的研究表明, piRNA还参与对\r\nmRNA和长非编码RNA的表达调控[11-13], 在组织再生、\r\n肿瘤的发生发展和胚胎发育等生物学过程中扮演着\r\n重要的角色[14-19]。 <\/p>

    PIWI家族蛋白是协助piRNA产生并与其结合\r\n发挥功能的重要因子, 广泛存在于线虫、昆虫、鱼\r\n类和哺乳动物等动物类群的生殖细胞中, 与生殖细\r\n胞的发生和成熟过程有着紧密的联系[20]。果蝇中存在3种PIWI家族蛋白, 分别是Piwi、Aub(Aubergine)\r\n和Ago3(Argonaute3), 它们对生殖干细胞(germline \r\nstem cell, GSCs)和雌雄育性的维持都是必需的[21]。\r\n斑马鱼中存在ZILI和ZIWI两种PIWI蛋白, 任何一种蛋白发生缺失都会造成雄性和雌性生殖能力的丧失[22-23]。在哺乳动物中, 以小鼠为模型对piRNA\r\n通路进行了大量研究。小鼠表达3种不同的PIWI家\r\n族蛋白, 分别是PIWIL1(MIWI)、PIWIL2(MILI)和\r\nPIWIL4(MIWI2)。任意一种Piwi基因的缺失均会导致雄性小鼠生精细胞发育异常, 进而造成不育。但令人意外的是, 对雌性小鼠的育性却没有观察到任\r\n何影响[24-26]。其他piRNA通路中关键蛋白, 如PLD6\r\n和MOV10L1等的缺失, 同样只影响到雄性小鼠, 而\r\n非雌性小鼠的生殖能力[27-30]。基于上述研究结果, \r\npiRNA研究领域内形成了一种被广泛接受的观点: \r\npiRNA通路对哺乳动物的雌性生殖不是必需的。 <\/p>


<\/p>

2 小鼠动物模型的一叶障目<\/strong> <\/p>

    与哺乳动物雄性生殖领域不同的是, 对雌性生\r\n殖领域的研究长期受制于取材方面的困难—相比于精子, 卵细胞稀少且珍贵。由于微量样品小RNA\r\n高通量测序方法的匮乏, 前人在对卵细胞小RNA进\r\n行表达谱研究时, 动辄需要用到几百甚至上千个卵细胞, 这成为制约卵细胞小RNA研究的瓶颈之一。\r\n目前对除小鼠以外其他哺乳动物雌性生殖细胞发\r\n育过程中小RNA的组成和Piwi基因表达情况, 以及\r\npiRNA通路的功能都知之甚少。前期的研究显示\r\n小鼠卵细胞中表达一种特殊结构的Dicer蛋白, 可以\r\n高效产生endo-siRNAs(endogenous siRNAs)[31], 而\r\nendo-siRNAs具有抑制转座子活性的功能, 很可能与piRNA存在功能上的冗余[32], 削弱了卵细胞发育对\r\npiRNA的依赖性。此外, 在小鼠基因组中缺少了一\r\n种广泛存在于包括人类在内的大部分哺乳动物基因组中的Piwi家族基因—Piwil3[33]。以牛为动物模\r\n型的研究表明, Piwil3基因特异性表达于卵细胞和胚<\/p>

胎中[34]。由Piwi家族蛋白与piRNA的产生及功能发挥有着极为紧密的联系, 上述观察提示, 在雌性生殖细胞中小鼠piRNA通路的组成和功能可能与大部分哺乳动物存在较大差异。<\/p>

工欲善其事, 必先利其器。为了解答前述问题, 我们前期发明了微量小RNA高通量测序方法CAS[1]<\/span>seq, 发现了人类卵细胞与小鼠卵细胞中小RNA组成有着显著的差别: 相比endo-siRNAs在小鼠卵细胞中的大量表达, 人类卵细胞中完全不表达endo-siRNAs, 却高表达一种长度约为19 nt的新型小RNA。 这种小RNA具有piRNA的大部分典型特征: 在基因 组上成簇分布, 序列具有明显的1U/10A偏好性, 但长度明显短于已知的piRNA类型, 并缺乏已知种类的piRNA通常含有的3’末端2’氧甲基修饰。我们通过免疫共沉淀测序发现这种小RNA与Piwi家族的蛋白—PIWIL3直接结合, 为了与经典的23–31 nt piRNA相区分, 我们称其为卵细胞短piRNA(oocyte short piRNA, os-piRNA)[8]。我们进一步在CAS-seq 基础上建立了单细胞小RNA测序技术 eCAS-seq (enhanced CAS-seq), 并结合单细胞转录组测序, 分析了人类卵细胞发育过程中piRNA、mRNA和转座子RNA的动态改变, 发现了piRNA与人类卵细胞发育过程中的转座子沉默现象存在密切关联。但人卵细胞中不表达特殊的Dicer异构体, 也不产生endo[1]<\/span>siRNA, piRNA的组成也与小鼠卵细胞存在巨大差异。因此, 以小鼠为动物模型所得到的关于piRNA 功能的研究结论很可能不适用于人类。<\/p>

那么, 哪些物种的雌性生殖细胞中piRNA通路 的组成和功能和人类相似, 可以作为动物模型来研究piRNA相关的生物学过程呢？为了回答这个问题, 我们搜集了9个科共计11种不同哺乳动物的卵细胞, 对它们卵细胞中小RNA和转录本的表达谱进行了深度测序, 从进化角度分析了物种间小RNA组成 的演变, 发现了卵细胞中小RNA的组成和表达谱有很强的种属特异性(未发表数据)。11个物种中仅有小鼠卵细胞中大量表达endo-siRNAs, 其他物种卵细胞中丰度最高的小RNA类型都是piRNA。而小鼠基因组在进化中缺失了Piwil3基因且完全不表达os[1]<\/span>piRNA, 其他piRNA的表达量也较低。因此, 在卵细胞中小RNA的表达与功能方面, 小鼠在进化中是一个特殊的物种, 无法代表其他哺乳动物。“piRNA在哺乳动物雌性生殖中无足轻重”这一结论很可能是过度依赖小鼠作为动物模型所导致的“一叶障目, 不见泰山”。回顾以往的研究不难发现, 这样的例子并不罕见。一个典型的例子是顶体蛋白(Acrosin): 顶体蛋白是储存于哺乳动物精子顶体(acrosome)中的一种重要的蛋白酶, 它可帮助精子穿透透明带与卵子融合。顶体蛋白缺失的小鼠依然可育[35], 这与在金黄地鼠和人类中观察到的现象完全不同[36-37]。因此, 我们认为想要弄清楚piRNA在哺乳动物雌性生殖中是否具有重要功能, 必须选择一个能够代表大部分哺乳动物的模式动物开展研究。<\/p>

 <\/p>

3 金黄地鼠动物模型的拨云见日 <\/strong><\/p>

金黄地鼠又称叙利亚仓鼠(syrian hamster), 属于啮齿目仓鼠科。它易于饲养、生育力强, 作为模式动物至今已有近60年的历史, 广泛应用于肿瘤、免疫、生理和生殖等研究领域[38-39]。金黄地鼠有着固定的发情周期(4天), 对超排激素响应好, 妊娠期短 (16天), 这些优势使其成为生殖研究中优秀的动物模型。更重要的是, 我们通过单细胞小RNA测序发现, 金黄地鼠卵细胞中Piwi基因和piRNA的组成和表达特征与人和食蟹猴相似, 在哺乳动物中更具代表性。因此, 我们选择金黄地鼠为模式动物来研究包括人类在内的大多数哺乳动物中piRNA与雌性生殖的关系。Piwil1和Mov10l1在金黄地鼠的雌性和雄性生殖细胞中均高表达。免疫共沉淀测序(RIP-seq)结果显示, Piwil1结合两种不同长度的piRNA, 分别是具有3’末端氧化修饰的23 nt和29 nt piRNA。而Mov10l1 为保守的RNA解旋酶, 参与到几乎所有piRNA的加工生成。我们与李建民教授合作, 通过CRISPR-Cas9 基因敲除技术分别获得了Piwil1和Mov10L1基因敲除的金黄地鼠, 结果发现, Piwil1和Mov10l1突变的雌性和雄性金黄地鼠均不可育[40]。有趣的是, 虽然 Piwil1和Mov10l1突变与小鼠类似, 均造成雄性金黄 地鼠的育性丧失, 但具体表型却与小鼠突变体有明显的差别。金黄地鼠Piwil1突变体无法形成成熟的精子, 睾丸和附睾切片结果显示圆形精子和变形精子不能产生, 但在睾丸中存在着大量异常的粗线期类似(pachytene-like)精母细胞(spermatocyte)的生精细胞。我们采用染色质铺展技术详细统计了突变体中生精细胞所处的发育时期, 结果显示相较于野生型金黄地鼠, 突变体中早期粗线期(early pachytene) 和晚期双线期(late diplotene)细胞的占比异常增高。而Mov10l1金黄地鼠突变体雄性生殖障碍更加严重, 绝大多数的曲细精管变为空腔, 仅有少部分(5%)依然存在少量异常的生精细胞。而在小鼠中, Piwil1突变后生精细胞可以发育到圆形精子时期[26], Mov10l1 突变后生精细胞产生大量异常的偶线期类似(zygo[1]<\/span>tene-like)的精母细胞[29-30]。说明piRNA通路在小鼠和金黄地鼠雄性生殖细胞发育中有着相似、但又具有物种特异性的必要功能。<\/p>

令人意外的是, 我们发现与小鼠不同, Piwil1和 Mov10l1突变均影响到了金黄地鼠雌性生殖能力。 Piwil1和Mov10l1突变体成熟卵细胞数目和形态正常, 可以正常受精并发育到2细胞时期, 但随后发育停滞。将野生型的胚胎移植到Piwil1突变体内可以 正常的发育并出生; 而母源Piwil1突变的胚胎移植 到野生型金黄地鼠体内, 依旧无法继续发育。以上结果证明了胚胎发育障碍源自于Piwil1突变卵细胞 本身不再具有维持胚胎生长的潜能, 而这种潜能的 丧失极有可能与piRNA的缺失相关。我们分析了这些突变体和野生型金黄地鼠不同发育时期的卵细胞 或早期胚胎的小RNA和转录组的变化, 发现Piwil1 突变后造成卵细胞中23 nt和29 nt piRNA的缺失, 而 Mov10l1突变则导致几乎所有长度piRNA的大幅减少, 这与PIWIL1和MOV10L1在piRNA加工中所扮演的角色相吻合[10,41-42]。<\/p>

在雄性生殖细胞中, piRNA的缺失通常会造成转座子的异常表达和积累[20]。我们分析了金黄地鼠卵细胞和胚胎中转座子的表达变化。结果显示, 在 Piwil1突变的GV和MII卵细胞及母源Piwil1缺失的1 细胞胚胎中转座子Line1和ERV异常积累。同时, 突变体中积累的转座子与缺失的对应序列的piRNA之间存在着明显的负向关联, 说明PIWIL1-piRNA参与 抑制转座子表达, 进而维持卵细胞的发育潜能。<\/p>

胚胎发育停滞在2细胞时期是一个常见的胚胎发育障碍, 有相当多的母源基因表达异常均会造成这一表型。例如, Mater、Zfp36l2、Brg1、Floped、 Filia、Sebox、BTG4和PABP1L等[43-51], 此外初级合子基因激活(minor zygotic genome activation)和主要合子基因激活(major zygotic genome activation)的失败也会导致类似发育停滞[52]。得益于全面的Piwil1 突变体早期胚胎转录组数据, 我们分析了胚胎发育停滞前出现的异常事件, 发现野生型胚胎从卵细胞激活后第9小时(9 hours post egg activation, 9 h.p.e.a.) 到33 h.p.e.a.和从33 h.p.e.a.到44 h.p.e.a.时期均出现了 大量基因表达的上升, 指示胚胎中合子基因的激活[52- 53]。而在Piwil1突变体中没有观察到明显的基因转录 激活, 表明合子基因激活失败。已有研究证明, 胚胎合子基因激活与母源RNA降解相偶联[53], 而且在果蝇和埃及伊蚊中已有报道显示, piRNA参与了母源RNA降解[19,54]。因此, 我们分析了Piwil1突变体中母源RNA降解情况, 结果显示分别存在着106和158 个母源RNA在MII卵细胞到9 h.p.e.a.和9 h.p.e.a.到 33 h.p.e.a.时期降解速率减缓。以上降解异常的母源 RNA在突变体中积累的倍数与其含有piRNA靶标序列的数目成正比, 提示着这些母源RNA的非正常降解与piRNA的缺失相关。 总之, 使用金黄地鼠开展piRNA在生殖发育中 的功能研究, 证明了piRNA对金黄地鼠雌性和雄性生 殖都是必要的, piRNA在抑制转座子表达和维持合 子基因激活中具有关键的作用(图1A)。由于金黄地鼠与人和其他大部分哺乳动物具有类似的Piwi基因表达和小RNA组成, 该结果也强烈暗示了piRNA可 能在人类及其他大部分哺乳动物雌性生殖中有着不 可替代的重要功能(图1B)。值得一提的是, 在同期的 Nature Cell Biology<\/em>上, 另外两个实验室也同时利用 金黄地鼠作为模式动物报道了这一重要结论[40,55-56]。<\/p>

4 总结与展望<\/strong> <\/p>

piRNA是在生殖细胞中抵抗转座子表达以保护 基因组稳定的一种免疫机制, 在物种间具有相当保守的特征和功能机制[9,57-58]。基于小鼠动物模型的研 究结论认为piRNA对哺乳动物雌性生殖过程可有可无, 看似符合逻辑, 但以金黄地鼠作为模式动物的实 验结果却证明这个推论是错误的。毫无疑问, 小鼠 作为优秀的动物模型, 为我们理解基因功能以及其 他基本生物学问题上作出了巨大贡献。但以小鼠为动物模型的研究结论并不总是放之四海而皆准的, 一些基于小鼠模型研究被认为功能冗余或者没有功能的基因, 很可能在其他哺乳动物中具有重要的功能。事实上, 越来越多的研究表明, 一些已经被遗传学确认与人类疾病发生发展密切相关的基因, 在小鼠中敲除或突变后并不能观察到相应的表型[35-37]。 因此, 我们需要破除已有观念的局限性, 在开展基因功能研究前, 特别是与人类生殖、发育和疾病相关 的基因, 首先应该进行基因的进化保守性和表达谱分析, 理性选择不同的模式动物, 再构建合适的动物 模型开展功能和机制的研究, 达到事半功倍的效果。 对于piRNA在哺乳动物雌性生殖中所扮演的角色及其机制, 我们所知仍然有限。但通过以金黄地鼠动物模型的研究工作, piRNA在雌性生殖中的神秘面纱正被逐步揭开。今后, 针对临床卵细胞发育 和功能异常, 以及早期胚胎发育阻滞患者的piRNA 表达情况、piRNA通路相关基因的突变进行检测, 并在金黄地鼠模型中解析其功能和机制, 将有助于 揭示piRNA通路与女性生殖障碍的关联, 为开发精 准的诊疗方法提供新的思路和重要途经。<\/p>

\"领域前沿中国.jpg\"/ A: Piwil1基因突变引起转座子异常积累、母源RNA降解异常和合子基因激活失败, 最终导致胚胎发育停滞在2细胞时期。B: 小鼠、金黄地鼠\r\n和人类的卵细胞中PIWI蛋白和piRNA的种类、是否含有endo-siRNA以及piRNA通路是否具有功能的比较。金黄地鼠和人类具有相似的piRNA\r\n通路, 提示piRNA通路在人类卵细胞中很可能同样具有重要的生物学功能。<\/p>

A: the disruption of Piwil1 leads to abnormal accumulation of transposon elements, aberrant degradation of maternal RNA, and inhibited zygotic ge\u0002nome activation. Finally, the embryos are arrested at 2-cell stage. B: the comparison of the species of PIWI proteins and piRNAs, the presence of endo\u0002siRNAs, and the function of piRNA pathway in the oocytes of mouse, golden hamster, and human. The similar characters of piRNA pathway in golden \r\nhamsters and humans suggest that piRNA pathway is also essential for human female fertility. <\/p>

图1 piRNA通路对哺乳动物雌性生殖是必需的 <\/span><\/p>

Fig.1 piRNA pathway is essential for mammalian female fertility<\/span><\/p>

参考文献 (References)<\/strong><\/p>

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吴立刚, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。1996年毕业\r\n于上海交通大学生物科学与技术系获学士学位; 2001年毕业于中国科学院上海植物生理研究所遗传学专业获博士学位; 2001年至2008年在美国纽约大学(NYU)医学院从事博士后研究; 2008年10月起任中科院上海生科院生化与细胞所(现中国科学院分子细胞科学卓越创新中心)\r\n研究员。吴立刚研究组主要研究mRNA\r\n的稳定性调控、小RNA介导的基因沉默, mRNA和siRNA药物的设计开发, 以及单细胞小RNA高通量测序技术。代表性工作发表在Nature Cell\r\nBiology<\/em>、Science Advances、Nature Communications<\/em>等期刊上, 发表论文40余篇, 单篇引用超1 000次, 研究成果获得Nature Reviews Molecular\r\nBiology、Nature Cell Biology、PNAS、eLife<\/em>等国际期刊的专评。 <\/p>

http://cemcs.cas.cn/sourcedb_cemcs_cas/zw/pi/202008/t20200823_5670123.\r\nhtml<\/p>","cshort2":"

\"吴立刚<\/p><\/td>

吴立刚, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。1996年毕业 于上海交通大学生物科学与技术系获学士学位; 2001年毕业于中国科 学院上海植物生理研究所遗传学专业获博士学位; 2001年至2008年在 美国纽约大学(NYU)医学院从事博士后研究; 2008年10月起任中科院上海生科院生化与细胞所(现中国科学院分子细胞科学卓越创新中心) 研究员。吴立刚研究组主要研究mRNA 的稳定性调控、小RNA介导的基因沉默, mRNA和siRNA药物的设计开发, 以及单细胞小RNA高通量测序技术。代表性工作发表在Nature Cell Biology<\/em>、Science Advances、Nature Communications<\/em>等期刊上, 发表论文40余篇, 单篇引用超1 000次, 研究成果获得Nature Reviews Molecular Biology、Nature Cell Biology、PNAS、eLife<\/em>等国际期刊的专评。 <\/p>

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[摘要]      在动物受精过程中, 卵母细胞皮层颗粒所分泌的蛋白酶在防止多精入卵中起着重要作用。在有花植物的有性生殖过程中, 受精过程则更为复杂。这一过程涉及到花粉管所运输的一对不可移动的精子分别与卵细胞和中央细胞融合的过程。在通常情况下, 每个胚珠只会吸引一根花粉管, 从而有效地降低多精入卵可能性。植物受精后防止多余花粉管进入胚囊的机制长期以来一直不清楚。武汉大学植物生殖研究团队最近的一项工作发现卵细胞本身在防止多花粉进入胚囊的过程中发挥了重要的作用。卵细胞特异性地表达两个天冬氨酸蛋白酶基因ECS1和ECS2, 其mRNA在成功受精之后会快速降解。ECS蛋白在卵细胞的顶端区域以类似于动物皮层颗粒网络的形式分布, 且其分泌过程也是受精依赖的。ecs1ecs2双突变体的胚珠呈现吸引多花粉的表型。ECS1和ECS2能够特异性地切割花粉管吸引物质LURE1。ECS1和ECS2在助细胞中的异位表达则会导致LURE1蛋白水平的降低及花粉管吸引能力的减弱。因此, ECS1和ECS2快速防止了多余花粉管进入胚囊。上述发现揭示植物的卵细胞能够感知受精并建立起一种受精依赖的快速防止多花粉管进入胚囊的机制。<\/p>

[关键词]      卵细胞; 花粉管; 多精入卵; LURE1; 天冬氨酸蛋白酶; 受精; 拟南芥<\/p>


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Fertilization-Dependent Mechanism of Egg Cell Preventing Polytubey <\/p>


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YU Xiaobo1,2, SUN Mengxiang2*<\/p>

(1Ministry of Education College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China; <\/p>

2College of life sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China)<\/p>

[Abstract]       In the process of fertilization in animals, proteases secreted from cortical granules of egg cells function to prevent polyspermy. In flowering plants, fertilization is more complex and involves a pair of non-motile sperm cells deliveres by a pollen tube, and then two sperm fuses with an egg cell and a central cell respectively. Usually, each ovule only attracts one pollen tube and thus efficiently reduces the possibility of polyspermy. However, the mechanism of plant preventing polytubey has remained unknown foe decades. Recently, it reports that the egg cell itself plays a critical role in preventing polytubey. Two aspartic proteases, ECS1 and ECS2, are specifically expressed in the egg cell and degraded soon after successful sperm-egg fusion. ECS locates at the apical domain of the Arabidopsis egg cell in the form of a cortical network. The secretion of ECS is triggered by sperm-egg fusion. The ecs1ecs2 double mutants showed polytubey phenotype. Further study reveales that ECS1 and ESC2 can cleave pollen tube attractant LURE1 specifically and thus quickly block the pollen tube attraction to prevent polytubey. These results indicate that plant egg cell can sense successful fertilization and establish a fertilization dependent mechanism to prevent polytubey.<\/p>

[Keywords]        egg cell; polytubey; polyspermy; LURE1; aspartic proteases; fertilization; Arabidopsis<\/p>


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1   植物防止多精入卵研究背景<\/p>

在哺乳动物研究中科研人员已经揭示了防止多精入卵的分子机制[1]。多精入卵通常会导致譬如胚胎发育致死、基因组不平衡、基因组剂量和染色体分离缺陷等一系列严重的后果[1]。动物防止多精入卵的机制主要与卵母细胞皮层分布的皮层颗粒(cortical granules)介导的皮层反应(cortical reaction)有关[2]。皮层颗粒分布于成熟卵母细胞的皮层, 精卵融合会触发皮层颗粒从卵母细胞中分泌出来, 这个过程不再更新, 且具有Ca2+依赖性[2]。皮层颗粒中所包含的物质十分复杂, 其中蛋白酶是皮层颗粒的主要成分之一。皮层颗粒所包含的蛋白酶Ovastacin能够分泌到透明带中并切割ZP2(zona pellucida glycoprotein 2), 从而阻止多精入卵[3]。有花植物的有性生殖过程则更为复杂, 涉及到花粉管所运输的两个不可移动的精细胞分别与卵细胞和中央细胞融合的过程, 其中一个精子与卵细胞融合形成合子, 最终发育成为胚胎, 而另一个则会和中央细胞融合, 发育成为胚乳[4]。在双受精过程中, 雌配子体(胚囊)与雄配子体(花粉管)之间存在着复杂的细胞间通讯, 并在花粉管导向、花粉管破裂、花粉管内含物释放及精卵融合等过程中发挥作用[5]。其中, 花粉管导向是双受精过程顺利完成的必要保证, 这个过程被证实是由卵细胞毗邻的助细胞所分泌的花粉管吸引物质介导的。这些花粉管吸引物质如玉米中的EA1[6], 拟南芥中的LURE[7]、XIUQIU[8], 蓝猪耳中的LURE[9]等, 具有种属特异性。一旦花粉管释放两个精子并完成双受精之后, 其他花粉管就不再被胚珠吸引, 这个过程常被称为多花粉管排斥。在拟南芥中, 这一排斥机制起始于花粉管到达胚珠珠孔端所触发的丝状器中积累的NO分子。NO分子能够修饰花粉管吸引物质LURE1, 使其丧失分泌性及与LURE1受体的结合能力, 从而阻止多花粉吸引(图1A)[10]。另外, 卵细胞或中央细胞的单受精并不能完全建立多花粉管排斥机制, 这一事实表明, 卵细胞和中央细胞共同参与了多花粉管的排斥机制[11]。双受精完成之后不久, 受精的中央细胞会与宿存的助细胞融合, 从源头上清除了合成花粉管吸引信号LURE的来源, 这一过程被认为是一种慢速的花粉管排斥机制(图1C)[12]。如果受精失败, 受精恢复(fertilization recovery)机制会被激活, 宿存的助细胞能够继续吸引额外的花粉管以保证胚珠成功且完全的双受精[13]。但是在多花粉排斥机制的建立过程中卵细胞如何成功地感知受精, 在排斥多花粉吸引的分子机制以及植物卵细胞中是否也存在与动物的皮层反应类似的细胞学过程等问题都不清楚。在我们最近的一项研究中, 关于卵细胞特异表达因子ECS1(egg cell specific 1)和ECS2的研究, 对这些问题进行了阐明, 填补了植物双受精过程中多花粉管排斥机制中的重要空白(图1B)[14]。<\/p>

A: NO分子抑制花粉管吸引物质LURE1; B: 精卵融合触发分泌的ECS1和ECS2蛋白酶降解LURE1; C: 受精中央细胞与宿存的助细胞融合机制。<\/p>

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A: NO inactivates pollen tube attractant LURE1; B: sperm-egg fusion triggers secretion of ECS1 and ECS2 protease, to degradate LURE1; C: fertilized central cell fuses with persistent synergid cell.<\/p>

图1   植物受精过程中防止多花粉管吸引的三种机制<\/p>

Fig.1   Three mechanisms of preventing polytubey during plant fertilization<\/p>


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2   ECS1和ECS2在卵细胞中特异性表达的研究<\/p>

得益于拟南芥卵细胞分离技术的建立和单细胞转录组测序技术的应用, 我们成功地鉴定了一系列的卵细胞特异表达基因。其中, 两个编码具有分泌性的天冬氨酸蛋白酶的基因引起了我们的注意。依据它们的表达模式, 这两个基因分别被命名ECS1和ECS2[14]。启动子活性分析和GFP融合蛋白分析证实, ECS1和ECS2只在卵细胞中特异性地表达。ECS1和ECS2的GFP信号在刚刚完成细胞化的卵细胞中就开始出现并持续积累; 受精之后, ECS1和ECS2的GFP荧光信号快速地减弱并在合子分裂之后彻底消失。在mRNA水平上, 原位杂交显示, ECS1和ECS2的mRNA特异性地定位于卵细胞, 并于受精之后快速地降解并消失, 这暗示, ECS1和ECS2中存在一个受精触发的mRNA降解机制。到目前为止, 仅有为数不多的卵细胞特异表达因子的生物学功能被鉴定研究。除ECS1和ECS2以外, 卵细胞特异性表达的EC1在双受精过程也能够激活精子[15]。今后, 更多的卵细胞特异表达基因的生物学功能研究、转录表达调控机制研究及受精触发的mRNA降解机制研究将为植物有性生殖过程提供新的见解。<\/p>


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3   ECS1和ECS2蛋白在受精过程中的动态变化规律<\/p>

为了研究ECS1和ECS2蛋白在受精过程中的动态变化规律, 我们分别构建了ECS1和ECS2的GFP和mCitrine融合蛋白株系并通过激光共聚焦显微镜进行了详细的跟踪观察。结果表明, ECS1和ECS2仅在成功受精后才能分泌。通过使用分别标记ECS1和ECS2、助细胞和卵细胞的三标记材料, 我们发现包含ECS1和ECS2的囊泡以类似于动物皮层颗粒网络的形式积累在成熟卵细胞的顶端区域。精卵融合之后, ECS1和ECS2几乎完全向降解助细胞所在的胞外空间分泌。分泌之后, 受精卵细胞中的囊泡也随之消失, 保留在受精卵细胞中的荧光信号十分微弱并在受精卵发育晚期消失殆尽。为了研究ECS蛋白具体的分泌时间, 我们使用精子表达的LAT52::DsRed或HTR10::HTR10-mRFP来标记花粉管或精子。结果发现, 花粉管进入胚珠及以助细胞降解、花粉管破裂与精子释放等过程中都不能够触发卵细胞中的ECS蛋白的分泌, 我们推测这一分泌事件是通过精卵融合触发的。在gcs1的突变体中, 突变的精子不能成功地与卵细胞或中央细胞融合[16]。为了验证这一推测, 我们使用了gcs1的突变体花粉来授粉ECS2-GFP融合蛋白材料的柱头。虽然精子能够成功释放并与卵细胞正常黏附, 但是精卵融合不能成功融合就不会触发ECS蛋白的分泌。在gex2突变体的受精<\/p>

过程中, 会出现一定比例的单受精表型[17]。我们使用gex2突变体花粉授粉ECS2-GFP材料柱头, 结果发现, 精子–中央细胞的成功融合也不会触发ECS蛋白从卵细胞中的分泌, 进一步证明了ECS蛋白的分泌只能依赖于精卵的成功融合(图2)。最后, 我们测试了缺乏信号肽的ECS蛋白是否能够从卵细胞中分泌, 在受精过程中其GFP信号一直滞留在卵细胞中。在这个部分的研究中, 各种荧光蛋白标记材料、受精缺陷相关突变体以及活体荧光的动态观察很好地促进了双受精过程的观察与研究。ECS1和ECS2的融合蛋白株系也是今后进一步研究卵细胞囊泡定位、分泌以及精卵融合机制良好的标记株系。<\/p>

\"领域前沿fig-2.jpg\"/<\/p>

图2   精卵融合触发的卵细胞中ECS1/2分泌模式图<\/p>

Fig.2    Schematic diagram of ECS1/2 secretion triggered by sperm-egg fusion<\/p>


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4   ECS1和ECS2在受精过程中的生物学功能及其分子机制研究<\/p>

ECS1和ECS2编码A1类天冬氨酸蛋白酶家族的两个成员, 蛋白序列分析表明, 其具有两个天冬氨酸蛋白酶经典的活性位点DTGS和DSGT。ECS1和ECS2的蛋白质序列与疾病抗性有关的蛋白CDR1同源性最高[18]。为了研究ECS1和ECS2在双受精过程中的功能, 我们分析了这两个基因的T-DNA插入突变体esc1-1、ecs1-2、ecs2-1和ecs2-2。结果表明, ecs1和ecs2的纯合突变体的营养生长及生殖过程都没有任何表型。考虑到它们具有极其相似的表达模式和序列相似性, 我们分别构建了两个独立的双突变株系, 即ecs1-1ecs2-1和ecs1-2ecs2-2。表型分析发现, 这两个双突株系都具有相似的多花粉管吸引表型。这一表型能够被ECS1或ECS2恢复, 进一步表明其多花粉管吸引的表型是由ECS1和ECS2基因突变引起的。由于配子融合缺陷也会导致多花粉管入胚囊的表型。为此, 我们观察了ecs1ecs2突变体中的配子融合过程。通过使用HTR10::HTR10-mRFP标记株系标记精核, 我们发现, 在ecs1ecs2双突变体中受精过程是完全正常的。然而, 我们发现在授粉后6~8 h, 大约16.4%的胚囊中存在额外的一对精子。这一结果表明, ECS1和ECS2参与了成功受精后的多花粉管排斥机制的建立。<\/p>

为了阐明ECS蛋白分泌所介导的多花粉管排斥的分子机制, 我们验证了这两个蛋白酶是否能够结合并切割花粉管吸引物质。Pull-down实验分析证明, ECS1和ECS2能够与花粉管吸引物质LURE1.2结合。为了研究蛋白酶ECS1和ECS2是否能够切割LURE1, 我们在小叶烟草叶子和HEK293T细胞中对ECS1和LURE1.2分别进行了共表达试验。结果发现, 在两个共表达体系中LURE1蛋白都出现了显著的下调。这一结果证实了ECS1和ECS2的确能够切割LURE1。为了鉴定ECS1和ECS2酶切花粉管吸引物质LURE1的切割位点, 我们根据LURE1.2的蛋白质序列设计了7个荧光多肽底物并使用重组的ECS1和ECS2蛋白对这7个荧光多肽底物进行了酶活活性测定。结果表明, ECS蛋白酶能够高效地切割LURE1.2的中部和C-端区域。生化实验也表明, ECS1和ECS2具有相似的生化特性, 其最适pH值为5.0且在碱性条件下没有任何蛋白酶活性。为了验证在植物体内ECS1和ECS2是否能够切割LURE1, 我们通过免疫荧光技术观察LURE1在野生型和ecs1ecs2双突变体中的蛋白水平变化。结果表明, 在授粉过程中野生型与双突变体的LURE1蛋白水平相当; 但当授粉10 h(受精2~4 h)后, LURE1的蛋白水平快速下降, 而在ecs1ecs2突变体中则几乎保持不变。进一步地, 通过体外花粉管吸引实验也发现, 将LURE1.2与ECS重组蛋白酶混合后使其丧失了花粉管吸引的能力。<\/p>

以上实验结果表明, 在成功受精后不久, ECS的蛋白酶活性对于清除花粉管吸引物质LURE1是必需的。为了最终证明ECS介导的LURE1降解对于阻止花粉管吸引的重要性, 我们使用助细胞特异启动子DD31驱动ECS1和ECS2在助细胞中的异位表达。结果发现, 与卵细胞的受精触发分泌不同, 助细胞中ECS蛋白组成型地向丝状器分泌。免疫荧光和LURE1.2-GFP荧光分析表明, LURE1.2的蛋白水平显著下降。不仅如此, 在野生型中, 授粉后6 h后超过50%胚珠已经吸引花粉管, 而在过表达株系中, 仅有小于10%的胚珠能够吸引花粉管。这一结果与LURE1突变体中授粉后4~6 h的结果保持一致, 因此证实了ECS介导的LURE1降解对于花粉管吸引具有关键性作用。我们也异位表达了缺失信号肽的ECS1和ECS2以及卵细胞表达的subtilisin-like蛋白酶SBT4.13[19], 结果发现其都不能影响LURE1.2蛋白水平, 也不能影响花粉管吸引比率。最后, 为了证明ECS1和ECS2的蛋白酶活性对于阻止多花粉吸引是必需的, 我们将ECS1和ECS2的蛋白酶活性位点发生突变后, 结果发现其丧失了切割LURE1底物的能力。活性位点突变的ECS1和ECS2也不能恢复突变体的表型。<\/p>

综上分析, 该工作证明了编码两个天冬氨酸蛋白酶基因ECS1和ECS2特异性地在卵细胞中表达, 并以皮层颗粒网络的形式积累在成熟的卵细胞中。当精卵成功融合之后, ECS1和ECS2蛋白向降解助细胞的胞外空间分泌, 这一过程与动物中的Ca2+触发的皮层反应相似[20]。在植物中, 在玉米[21-22]和拟南芥[23-24]中体外精卵融合导致的Ca2+上升已被报道。ECS蛋白的分泌过程是否由Ca2+触发还有待进一步研究验证。<\/p>


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5   展望<\/p>

尽管动植物在卵的形态结构、精子的移动性等方面有明显差异, 但是我们的这一研究成果表明, 受精依赖的蛋白酶释放以阻止多精入卵的机制在动物和植物中可能是保守的。值得一提的是, 虽然卵细胞调控的ECS蛋白酶途径参与防止多花粉的进入, 但胚乳与宿存助细胞的融合也能够清除花粉管吸引物质LURE1和XIUQIU的来源, 最终终止花粉管吸引[12]。这是一个慢速的多花粉管排斥过程。因此, 卵细胞或中央细胞的单受精都不足以建立起一个完整的多花粉排斥机制[11]。此外, 多花粉排斥机制在玉米中仅有96%有效[25], 拟南芥中则为98%[11,26]。这表明, NO[10]或ECS1/2[14]所介导的花粉管吸引物质失活都不能有效地清除其他弱花粉管吸引物质。考虑到在植物中多精入卵的比率非常低[25,27], 远远低于多花粉管吸引的比率, 这一事实暗示植物中也存在着一个快速的阻止多精入卵的排斥机制。体外受精实验表明, 配子融合会释放细胞壁物质[28], 这可能是植物多精入卵的最终排斥机制。ECS1和ECS2是否能够参与降解配子激活、黏附、融合等相关蛋白以及细胞壁物质的排斥机制还有待进一步研究。其他的蛋白酶譬如SBT4.13也有可能参与这一过程, 其蛋白底物也还有待鉴定。<\/p>

近年来, 得益于单细胞分离、单细胞组学、高分辨率动态成像、免疫荧光等技术在有性生殖领域的应用, 双受精过程取得了一系列突破性的进展并成为植物科学研究的热点领域。随着双受精过程中分子调控途径的不断深入研究, 进一步挖掘动物与植物的普适生殖规律、低等植物到高等植物有性生殖进化规律, 将大大拓展植物有性生殖的理论研究内涵。另外, 植物的有性生殖过程与粮食作物的产量和品质密切相关, 加强在水稻、玉米及小麦等粮食作物中的有性生殖基础研究不仅能够为被子植物有性生殖过程提供新的见解和研究思路, 也为粮食产量、品质改良等民生问题提供宝贵的实践经验, 其重要价值将在未来逐渐展现出来。<\/p>


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参考文献 (References)<\/p>

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孙蒙祥, 武汉大学教授、博士生导师。1982年本科毕业于华中师范大学。1987年、1994年先后于武汉大学获得硕士和博士学位。1995年后分别在荷兰Wageningen University、意大利Siena University、德国University of Hamburg等从事博士后和合作研究。主要研究领域为植物生殖发育, 具体方向为被子植物受精与早期胚胎发生的分子机制。近年, 先后揭示了植物如何防止多精入卵、杂交后父本基因组激活的时间、父母亲本对杂种胚胎转录组的同等贡献、种子发育中胚乳的独立性等一系列重要机制。在<\/span>Nature、Nature Plants、Developmental Cell、PNAS、Current Biology、Nature Communications、Plant Cell<\/em>等期刊上发表论文120多篇。<\/span><\/p>","cshort2":"

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孙蒙祥, 武汉大学教授、博士生导师。1982年本科毕业于华中师范大学。1987年、1994年先后于武汉大学获得硕士和博士学位。1995年后分别在荷兰Wageningen University、意大利Siena University、德国University of Hamburg等从事博士后和合作研究。主要研究领域为植物生殖发育, 具体方向为被子植物受精与早期胚胎发生的分子机制。近年, 先后揭示了植物如何防止多精入卵、杂交后父本基因组激活的时间、父母亲本对杂种胚胎转录组的同等贡献、种子发育中胚乳的独立性等一系列重要机制。在Nature、Nature Plants、Developmental Cell、PNAS、Current Biology、Nature Communications、Plant Cell<\/em>等期刊上发表论文120多篇。
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新型肠道间质细胞MRISC调控炎症过程中<\/strong><\/span><\/p>

肠道干细胞的损伤修复<\/strong><\/span><\/p>

伍宁波 孙宏翔 谭剑美 苏冰*<\/p>

(上海交通大学医学院, 上海市免疫学研究所, 上海 200025)<\/p>


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[摘要]       炎症和损伤能迅速激发肠道干细胞增殖促进组织修复再生。肠道微环境组分中的重要成员—肠道间质细胞在这个过程中起到了非常重要的调控作用。近年来, 随着单细胞测序技术的快速发展, 研究人员揭示了肠道间质细胞是一类异常复杂且具高度异质性的细胞群。目前, 领域内对不同肠道间质细胞亚群的基因特征、空间分布、潜在功能以及调节的细胞和分子机制仍知之甚少。该文总结了该团队发现肠道间质细胞新亚群MRISC(MAP3K2-regulated intestinal stromal cell)的过程, 并详细描述了MRISC在肠道炎症和损伤过程中通过特异调控肠道干细胞微环境的R-spondin1-Wnt信号参与肠道上皮组织损伤修复的作用和机理, 为MAPK信号在肠道疾病研究和治疗中的应用提供了新思路。<\/p>

[关键词]       肠道间质细胞; 肠道干细胞微环境; MRISC; R-spondin1<\/p>


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Novel Intestinal Mesenchymal Stromal Cell MRISC Regulates Intestinal Stem Cell upon Damage-Induced <\/strong><\/p>

Tissue Repair and Inflammation<\/strong><\/p>

WU Ningbo, SUN Hongxiang, TAN Jianmei, SU Bing*<\/p>

(Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China)<\/p>


<\/p>

[Abstract]     Inflammation and tissue damage could rapidly stimulate intestinal stem cell proliferation and promote tissue regeneration. Intestinal mesenchymal stromal cell, one of the key components of intestinal micro-environment, plays an essential regulatory role in this process. With the advancement of single cell sequencing technologies, researchers revealed intestinal mesenchymal stromal cells as a complex and highly heterogeneous cell population. Currently, the gene signature, spatial distribution, potential function, cellular and molecular regulatory mechanisms of these distinctive stromal cell populations are still poorly understood. This paper revisited the course of MRISC (MAP3K2-regulated intestinal stromal cell) discovery, and described the role and mechanism of MRISC involved in intestinal epithelial repair by specifically regulating the R-spondin1-Wnt signal of the intestinal stem cell niche during intestinal inflammation and injury. This work provided new insights in application of MAPK signal<\/p>

perturbation to the research and therapies of intestinal diseases.<\/p>

[Keywords]      intestinal stromal cell; intestinal stem cell niche; MRISC; R-spondin1<\/p>


<\/p>

       肠道受到损伤和产生炎症时, 肠道上皮干细胞能迅速作出响应启动增殖分化过程以促进组织修复再生[1]。肠道间质细胞紧密连接着上皮细胞, 是肠道微环境组分中的重要成员, 在上皮细胞中起到支撑的作用。在FGF、TGF-β、Hedgehog与PDGF等信号调控下, 肠道间质细胞可分化为多种复杂群体, 它们通过与淋巴细胞、髓系细胞、上皮细胞和神经细胞的相互作用, 协同调控肠道上皮干细胞的功能以维持肠道稳态[2-3]。<\/p>

       借助谱系示踪技术, 肠道间质细胞的功能异质性正在逐步被阐明。不同的肠道间质细胞群体通过分泌相应的生长因子与细胞因子可有效调节肠道结构完整性与稳态。然而, 研究人员至今仍然不清楚这些新发现的肠道间质细胞群体在肠道稳态维持与疾病条件下, 通过何种机制精确调控着肠道功能。得益于单细胞测序技术的快速发展, 研究人员认识到肠道间质细胞是一大类复杂且具有高度异质性的细胞[4]。Foxl1+特洛细胞[5]及CD81+滋养细胞[6]的发现, 提示肠道可能存在多种不同分化方向或状态且功能特异的肠道间质细胞亚群。目前领域内对不同肠道间质细胞亚群的特征、空间分布、在组织损伤修复中的潜在功能以及调节的细胞和分子机制知之甚少。因此, 对新型肠道间质细胞亚群的身份鉴定<\/p>

上游刺激信号的发现以及转录和表观遗传调控通路的阐明已成为间质细胞领域最基础和重要的科学问题。<\/p>

MAP3K2是在进化上保守的苏/丝氨酸蛋白激酶, 在许多组织和器官中组成性表达, 可以响应多种生长信号和应激信号, 调节细胞的增殖、分化等过程[7-8]。我们检测发现, MAP3K2在肠道组织中表达非常高。利用DSS诱导的小鼠肠炎模型, 我们发现, MAP3K2缺失会造成肠炎加重的表型。进一步检测发现, MAP3K2缺失导致肠道LGR5+干细胞减少。这提示, MAP3K2可能通过维持损伤状态下肠道中LGR5+干细胞的数量和功能起到关键的肠炎保护作用。<\/p>

       为了阐明MAP3K2究竟影响了何种细胞, 从而造成小鼠肠炎加重, 我们首先采取了骨髓移植后再进行DSS处理观察肠炎严重程度的方法, 证明了MAP3K2在非骨髓来源细胞中的作用是导致敲除型小鼠肠炎加重的原因。随后, 我们构建了Map3k2条件性敲除小鼠, 和Vil1-Cre小鼠杂交, 得到上皮特异性敲除小鼠。结果有些意外, 肠道上皮细胞中的MAP3K2信号并不能介导肠炎保护作用。在排除了免疫细胞和上皮细胞的作用后, 我们最终利用Col1a2-CreERT2小鼠在gp38+的基质细胞中特异性敲除Map3k2, 证明了gp38+基质细胞中的MAP3K2信号介导了肠炎保护作[9]。<\/p>

       为了探究基质细胞中MAP3K2信号通过何种分子机制影响肠道干细胞功能, 我们对野生型和敲除型小鼠正常条件下和DSS处理的结肠组织进行转录组测序分析。我们重点分析了对于肠道干细胞增殖和分化有重要作用的信号通路, 如Notch、EGF和Wnt信号通路[10-11]。我们发现, 敲除型小鼠结肠内Notch信号通路和EGF信号通路没有明显区别, 但是DSS诱导的肠炎早期, Wnt信号通路的激活程度较野生型明显下降。这提示, MAP3K2可能通过调节损伤情况下肠道干细胞Wnt信号的活化强度来促进上皮的损伤修复。通过进一步仔细分析Wnt通路各部分基因的表达, 我们找到了一个非常重要的Wnt信号调控分子R-spondin1。R-spondin1可以结合表达在肠道干细胞表面的LGR5分子, 阻止Wnt受体的降解, 从而持续激活Wnt信号, 这对肠道干细胞维持自我更新及分化有着重要作用[12-13]。我们的测序结果显示, Map3k2敲除肠炎小鼠结肠中R-spondin1表达下降, 这提示我们在炎症损伤条件下, MAP3K2可能通过调控肠道间质细胞产生的R-spondin1来激活肠道干细胞的Wnt信号从而促进损伤修复[9]。<\/p>

        为了验证R-spondin1对肠道上皮细胞的作用, 我们在DSS诱导肠炎的同时腹腔注射重组R-spondin1, 结果发现, 补充R-spondin1可以显著减轻Map3k2敲除型小鼠的肠炎严重程度, 且其上皮干细胞标志物Lgr5表达量也显著上升。我们进一步借助肠道原位注射手术, 将重组R-spondin1递送至结肠黏膜下层, 结果显示, Map3k2敲除型小鼠结肠接受重组R-spondin1后Lgr5表达水平与野生型相当, 进一步验证了MAP3K2是通过影响R-spondin1的产生来调控肠道上皮细胞的损伤修复[9]。<\/p>

        目前, 已知R-spondin1主要由肠道间质细胞分泌[14]。然而, 肠道间质细胞具有高度异质性, R-spondin1具体来源于何种间质细胞尚不清楚。有研究报道, 在体外培养CD90+间质细胞能促进肠道干细胞的生长和分化, 但具体机制尚不清楚[15]。我们分选出CD326+结肠上皮细胞、CD45+免疫细胞、CD90–间质细胞和CD90+间质细胞, 用qRT-PCR检测Rspo1基因的表达。我们发现, R-spondin1主要表达在CD90+间质细胞。在DSS处理之后, 在野生型CD90+间质细胞中R-spondin1的表达显著上升, 而在Map3k2敲除的CD90+间质细胞中的表达却没有变化。这些结果说明, MAP3K2影响了肠道CD90+间质细胞中R-spondin1的产生[9]。<\/p>

        CD90仍然是一个间质细胞表达较为广泛的分子。为了更好地阐明CD90+间质细胞的特征和功能, 我们分选了CD90+间质细胞进行单细胞测序。我们发现, CD90+间质细胞中包含了9个不同的基质细胞亚群。其中间皮细胞、Cluster 2和Cluster 5高表达R-spondin1, 考虑到间皮细胞位于肠腔最外侧远离隐窝干细胞所在的位置[16], 我们将重点放在Cluster 2和Cluster 5两群间质细胞上。通过差异基因分析, 我们发现, Cluster 5高表达CD34和CD81分子, 不表达CD138分子。而Cluster2不表达CD34和CD81分子, 高表达CD138分子。我们用流式的方法分选了这两群细胞, 然后检测R-spondin1表达, 最终确认只有Cluster 5中R-spondin1的表达受到了MAP3K2的调控, 因此, 我们把这群新细胞命名为MRISC(MAP3K2-regulated intestinal stromal cell)[9]。<\/p>

        为了验证MRISC具有维持肠道干细胞的功能, 我们采用流式细胞术分选了MRISC, 通过与肠道类器官共培养以及肠道原位细胞注射实验, 我们在体外和体内实验中证明了MRISC通过MAP3K2调节R-spondin1信号, 促进肠道干细胞的增殖和修复功能。同时, 为了找到这群细胞在肠道中的位置, 我们构建了Rspo1-tdTomato荧光报告小鼠。利用此小鼠, 结合CD34和CD81的免疫荧光染色, 我们发现, MRISC特异性地位于肠道隐窝底部的肠道干细胞周围(图1A)[9]。<\/p>


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\"领域前沿.jpg\"/<\/p>

A: 免疫荧光染色显示, MRISC(CD34+CD81+tdTomato+)(白色)位于肠道隐窝干细胞底部; B: 维恩图显示, 小鼠结肠MRISC具有与CD34SP间质细胞、CD138+间质细胞以及Myofibroblast不同的染色体开放区域。<\/p>

A: image showed that MRISC (CD34+CD81+tdTomato+) (white) was located at the bottom of intestinal stem cells; B: Venn diagram showed that the MRISC of mouse colon had different chromosomal open regions compared with CD34SP stromal cells, CD138+ stromal cells and myofibroblast.<\/p>

图1    MRISC具有独特的位置和表观遗传特征(根据参考文献[9]修改)
<\/p>

Fig.1   MRISC has unique location and epigenomic features (modified from reference [9])<\/p>

        为进一步研究MAP3K2特异调控新型肠道间质细胞MRISC中R-spondin1表达的分子机制并探索其表观遗传的特征, 我们分选了MRISC和其他几种主要的肠道间质细胞, 进行ATAC-Seq测序分析。结果显示, MRISC有着与其他间质细胞非常不同的表观遗传调控特征(图1B), 并发现MRISC的核心转录调控因子KLF2直接受MAP3K2信号调控。我们在体外实验中进一步发现了“活性氧(reactive oxygen species, ROS)-MAP3K2-ERK5-KLF2”这一全新的诱导R-spondin1产生的分子通路[9]。<\/p>

        我们课题组长期聚焦于MAP3K2的功能研究, 目前的研究发现不同细胞的MAP3K2信号对于肠道稳态平衡发挥着不同的作用。在此项研究中, MRISC中的MAP3K2信号通过调节R-spondin1-Wnt通路, 促进肠道损伤修复, 降低肠道炎症反应。而我们另一项研究显示, 在肠道T细胞中MAP3K2可以激活JNK促进肠道IL-18诱导的Th1细胞分化, 促进T细胞介导的肠炎反应[8]。而在巨噬细胞研究方面, 安华章教授团队[7]研究证实, MAP3K2是TLR9信号通路中ERK1/2活化的关键因子, 在促进巨噬细胞炎症细胞因子生成中发挥了重要作用[17]。此外, MAP3K2有一个同源性非常高的MAP3K家族分子—MAP3K3, 两者结构具有71%的同源性, 其催化结构域的同源性高达95%, 它们在细胞中的功能存在一定的互补性。在间质细胞中, MAP3K3表达很低, 因此主要由MAP3K2发挥调控功能。而在我们之前的研究中, MAP3K3在血管内皮细胞中表达很高, 发挥了调控胚胎心血管系统的早期发育[18]和维持血管屏障[19]的功能。而在T细胞中, MAP3K2与MAP3K3表达都很高, 两者一起调节ERK1/2的激活, 抑制Treg和Th7细胞的分化[7]。因此, 在临床治疗中, 结合MAP3K2与MAP3K3的表达情况, 寻找细胞特异性的MAP3K通路抑制剂可能会对肠炎的治疗更加有效。<\/p>


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参考文献 (References)<\/strong><\/p>

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苏冰, 上海交通大学医学院上海市免疫学研究所所长, 上海市免疫学研究所研究员, 上海交通大学医学院免疫学与微生物学系主任, 上海市免疫学研究所免疫与微生态相关疾病研究中心主任, 上海交通大学医学院–耶鲁免疫代谢研究院主任。1984年毕业于北京大学, 获得理学学士学位。1987、1991年在美国耶鲁大学分别获得硕士和博士学位。1991—1995年在美国加州大学圣地亚哥分校从事博士后研究工作。1995—2006年在美国德克萨斯大学/MD安德森癌症中心任助理教授、副教授、教授。2007—2014年在美国耶鲁大学医学院免疫生物学/血管生物学/移植研究系任副教授。2012年加入上海交通大学医学院, 担任上海市免疫学研究所所长。<\/p>","cshort2":"

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苏冰, 上海交通大学医学院上海市免疫学研究所所长, 上海市免疫学研究所研究员, 上海交通大学医学院免疫学与微生物学系主任, 上海市免疫学研究所免疫与微生态相关疾病研究中心主任, 上海交通大学医学院–耶鲁免疫代谢研究院主任。1984年毕业于北京大学, 获得理学学士学位。1987、1991年在美国耶鲁大学分别获得硕士和博士学位。1991—1995年在美国加州大学圣地亚哥分校从事博士后研究工作。1995—2006年在美国德克萨斯大学/MD安德森癌症中心任助理教授、副教授、教授。2007—2014年在美国耶鲁大学医学院免疫生物学/血管生物学/移植研究系任副教授。2012年加入上海交通大学医学院, 担任上海市免疫学研究所所长。苏冰教授长期致力于细胞信号转导研究, 尤其是MAPK和mTOR信号通路的调控机制及免疫调控作用, 取得了一系列原创性科学发现, 在Cell<\/em>、Nature<\/em>、Nature Genetics<\/em>、Nature Immunology<\/em>、Immunity<\/em>等杂志上发表论文90余篇, 他引超过14 000次。近年来苏冰教授聚焦于肠道黏膜免疫和炎症相关疾病的基础研究, 并与瑞金医院、仁济医院等临床科室合作开展临床转化研究。<\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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ProTracer—不间断记录体内细胞增殖的遗传示踪新技术<\/p>

石梦杨 何灵娟 周斌*<\/p>

(细胞生物学国家重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心,<\/p>

中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)<\/p>

[摘要]       器官内细胞数量和组织稳态可以通过细胞增殖调节并维持。大多数用于鉴别具有显著增殖能力的细胞的相关研究, 都是基于某一细胞亚群的谱系示踪, 而这会导致潜在的选择性偏差。该团队利用双同源重组酶系统, 开发了一种示踪增殖细胞的新技术—ProTracer, 该技术能够实现在多个器官中长时间不间断地记录整个细胞类群的细胞增殖。在肝脏中, ProTracer揭示了位于肝小叶中间区域的肝细胞在生理稳态、损伤修复和再生过程中具有优越的增殖能力。克隆分析实验结果表明, 大部分ProTracer标记的肝细胞发生了细胞分裂。综上, ProTracer技术通过遗传记录总细胞群的增殖事件, 能够应用于无偏好性检测具有显著再生能力的独特细胞亚群。<\/p>

[关键词]    细胞增殖; 谱系示踪; ProTracer; 双同源重组酶系统; 器官; 肝脏; 遗传记录; 再生<\/p>


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[Abstract]    Organ homeostasis is orchestrated by timed and spatially restricted cell proliferation. Studies identifying cells with superior proliferative capacity mostly rely on lineage tracing of a subset of cell populations, introducing a potential selective bias. Here, this group developed a genetic system (proliferation tracer, ProTracer) by incorporating dual recombinases to seamlessly record proliferation events of entire cell populations over time in multiple organs. In the liver, ProTracer revealed that a subpopulation of midzonal hepatocytes have superior proliferative capacity during homeostasis, injury repair, and regeneration. Clonal analysis showed that the majority of hepatocytes labeled by ProTracer have undergone cell division. By genetically recording proliferation events of entire cell populations, ProTracer enables unbiased detection of unique cellular compartments with enhanced regenerative capacity.<\/p>

[Keywords]     proliferation; lineage tracing; ProTracer; dual recombinases; organs; liver; genetically recording; regeneration<\/p>


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1 肝细胞再生研究背景<\/strong><\/p>

    体内器官稳态往往是由高度增殖的细胞来维持的[1-4]。这种特殊细胞大多有特定的标记基因, 并且得到了谱系示踪技术的证实[5-8]。然而, 使用单个标记基因只能定义某一种细胞类群, 从而会导致实验分析更聚焦于带有该标记的细胞命运, 而不会上升至总体细胞群水平上, 因而会存在潜在偏差。故由此而来的不同遗传命运图谱会得到相互矛盾的结论, 正如当前一些关于肝细胞再生来源的具有高度争议的研究[9-18]。有研究表明, 门静脉周围的肝细胞能够逐渐向中央静脉迁移[9]。然而, 这个从门静脉向中央静脉方向的肝细胞流动模型仍存在争议[10-11]。有谱系示踪研究表明, 位于肝小叶中央静脉周围的Axin2+肝细胞, 会从中央静脉至门静脉方向扩增, 维持肝脏稳态时的肝细胞更新[12]。然而, 其他谱系示踪研究团队却发现, 中央静脉周围的Axin2+或Lgr5+肝细胞对肝脏稳态维持和再生的贡献有限[17-18]。也有研究团队发现, 在肝损伤后, 肝门静脉周围的Sox9+肝细胞广泛增殖并修复受损肝脏[13]。此外, 有一些研究表明, 新生肝细胞的来源并非集中于某个区域, 而是分散在整个区域, 比如有研究报道分布在肝小叶各个区域的LGR4+肝细胞具有较强的扩增能力维持肝脏稳态[14], 另有研究报道, 在肝小叶所有分区中都有表达的端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)高表达的肝细胞比TERT低表达的肝细胞具有更强的增殖能力[16], 这些支持了有关肝细胞再生的一种“分布式模型”。最近有关肝细胞扩增的克隆分析表明, 在处于稳态和再生过程的肝脏中, 肝细胞之间的增殖能力无明显差异[19]。在稳态和再生过程中, 肝细胞的更新主要是通过已有肝细胞的增殖来维持的[20], 而在某些严重损伤的情况下, 肝细胞可以被胆管细胞的转化所取代[21-24]。鉴于肝小叶不同区域的肝细胞增殖能力具有异质性, 故当前的关键问题应该围绕不同肝细胞亚群对肝脏稳态和再生的贡献展开, 由于上述依赖单个标记基因或稀疏标记的谱系示踪研究追踪的只是肝细胞某个亚群, 不同的标记得出不同的结果, 使得目前很难判断新生肝细胞的真正来源。因此, 长时间不间断地对整个肝细胞类群的增殖进行的无偏好性检测, 可以阐明在肝脏稳态和损伤修复过程中新生肝细胞的来源。<\/p>


<\/p>

2 细胞增殖遗传记录系统的设计与构建<\/strong><\/p>

    Ki67是一种广泛使用的细胞增殖标记物[25], 近期报道的两种基于Ki67-CreER的谱系示踪方法是在注射他莫昔芬(Tamoxifen, Tam)后诱导标记Ki67+增殖细胞[25-26]。若要有效维持小鼠体内Cre酶活性, 需要进行连续几周或几个月的Tam注射, 但这可能会对组织产生毒性和副作用[27]。为此, 我们开发了一种基于双同源重组酶系统的策略, 实现通过单次Tam注射能够长时间不间断地记录细胞增殖事件。该遗传系统的构建涉及3种小鼠品系: DreER[28]、Ki67-CrexER(Ki67-Cre-rox-ER-rox)和R26-GFP[29](图1)。<\/p>

    我们首先构建并鉴定了Ki67-CrexER小鼠品系。Ki67和ESR(代表CrexER的表达)共染结果证实, CrexER的表达准确反映Ki67的表达。此外, 核酸类似物EdU掺入实验表明, CrexER和EdU的染色结果相似, 表明Ki67-CrexER表达在增殖细胞里。接着, 体外培养并监测Ki67-CrexER;R26-GFP小鼠细胞的增殖情况。 CrexER与CreER一样, 可以通过Tam注射后, 经由Cre-loxP重组发挥作用, 不同的是CrexER能通过Dre-rox重组转换为Cre[30]。活体成像结果显示, Ki67-CrexER;R26-GFP小鼠细胞经Tam诱导后, 增殖细胞表达GFP, 且单个表达GFP的细胞正经历细胞分裂。Ki67-CrexER;R26-GFP小鼠主动脉三维全器官成像显示, GFP+内皮细胞几乎总是成对出现。上述实验结果表明, Ki67-CrexER;R26-GFP标记的是增殖的细胞。此外, 我们发现, Ki67-CrexER/CrexER纯合小鼠正常生长, 且细胞正常增殖, 提示Ki67-CrexER等位基因维持Ki67内源性表达。<\/p>

    该系统的精妙之处在于, 通过单剂量注射Tam启动该系统后, 它将永远保持打开状态, 从而可以在此后的任何时间窗口内如实且特异地记录细胞增殖情况。我们将该系统模型称为ProTracer(proliferation tracer)。<\/p>


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3 ProTracer可以有效记录体内细胞增殖<\/strong><\/p>

     ProTracer小鼠(R26-DreER[28];Ki67-CrexER; R26-GFP)能够在大多数器官和组织中遗传记录增殖细胞。通过Southern blot对ProTracer小鼠的多个组织的基因组DNA分析, 我们发现Tam诱导后, DreER将Ki67-CrexER转变为Ki67-Cre效率为50%~100%, 且肝脏中最高。在经由Tam注射激活系统后的第2天和第28天, 全器官荧光成像和GFP免疫荧光检测结果表明, GFP信号仅来自发生Cre-loxP重组的Ki67+细胞。<\/p>

    为便于将ProTracer系统与先前报道的细胞增殖示踪技术进行比较, 我们还构建出Ki67-CreER;R26-GFP小鼠。经Tam注射后的第2天, ProTracer和Ki67-CreER;R26-GFP小鼠所有被检测组织(除了高增殖的肠上皮)GFP信号均很少。而Tam实验后第28天, ProTracer小鼠的GFP信号明显多于Ki67-CreER;R26-GFP小鼠。这一结果说明了ProTracer长时间持续捕捉细胞增殖事件的能力。<\/p>

在没有Tam处理的情况下, Ki67-CreER;R26- GFP和ProTracer小鼠中几乎检测不到任何GFP+细胞。且Tam处理的R26-DreER;R26-GFP小鼠中也没有任何GFP+细胞, 排除了系统中潜在的DreER-loxP重组。这些研究结果表明, Tam处理的ProTracer小鼠不同器官或组织中检测到的GFP+细胞依赖于DreER-rox重组和随后的Cre-loxP重组。综上, 这些结果突出了ProTracer能够实现长时间不间断地记录不同组织器官中的细胞增殖。<\/p>


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\"image.png\"/<\/p>


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Tam诱导的DreER-rox重组将Ki67启动子驱动的CrexER转换为Cre, 启动系统持续记录从T1到Tn间所有的细胞增殖事件。<\/p>

Tam-induced DreER-rox recombination switches CrexER into Cre driven by the Ki67 promoter, which primes the system to continuously record all cell proliferation events from T1 to Tn.<\/p>

图1 ProTracer策略示意图(根据参考文献[31]修改)<\/p>

Fig.1 Schematic showing the ProTracer strategy (modified from reference [31])<\/p>


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4 ProTracer系统对生理稳态情况下肝细胞增殖能力鉴定<\/strong><\/p>

    我们利用ProTracer系统来检测所有肝细胞群的增殖, 研究新生肝细胞产生的来源和位置。肝小叶被分为三个不同的区域[32-34]: 门静脉周围区[分子标记为E-钙黏蛋白(E-cadherin, E-CAD)]为1区; 最靠近中央静脉的中央区域(由谷氨酰胺合成酶GS标记)为3区; 其余的中间区域(E-CAD–GS–)为2区[35](图2A)。Southern blot结果表明, 经Tam注射后, ProTracer小鼠肝细胞中几乎所有Ki67-CrexER都转换为了Ki67-Cre, 而溶剂玉米油处理的对照组没有。我们还通过将R26-DreER与rox报告小鼠R26-rox-Stop-rox-tdTomato (R26-RSR-tdTomato)杂交, 发现经Tam注射后R26-DreER重组发生在肝脏的几乎所有肝细胞中。<\/p>

    为检测肝小叶原位肝细胞增殖情况, 我们在Tam诱导后不同时间点采集ProTracer小鼠的肝脏样本。第0天和第2天免疫荧光染色结果显示, 肝切片上没有或鲜有GFP+肝细胞。从第2周到第8周, 观察到逐渐增多的GFP+肝细胞, 且主要集中在2区。在第8~12周, 我们检测到1区GFP+肝细胞数量增加, 但其密度仍显著低于2区。肝小叶中2区GFP+肝细胞明显增多, 提示该区域有更多新的肝细胞生成。值得注意的是, 在第4~12周, 3区GFP+细胞的数量没有显著变化(图2B)。于是, 我们进一步使用GS-CreER驱动系统独立检测在肝脏稳态期间, 3区肝细胞是否显著扩张。通过使用GS-flagBFP和GS-CreER敲入小鼠系, 我们证实了GS特异性表达于中央周围肝细胞即3区肝细胞。然而, 对这些GS+肝细胞的遗传示踪结果显示, 它们在8周之后并没有显著扩大或减少。谱系示踪和ProTracer数据均表明, 3区肝细胞在肝脏稳态期间不会显著扩张。综上所述, 这些基于对总肝细胞群监测的数据表明, 在肝脏稳态期间, 肝细胞增殖率在2区最高, 1区中等, 3区最低。<\/p>


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\"image.png\"/<\/p>


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A: 上图从门静脉周围到中央区的三个肝分区。下图为谷氨酰胺合成酶(GS)和钙黏蛋白(E-CAD)免疫荧光染色。①、②、③分别表示1区(E-CAD+)、2区(E-CAD–GS–)和3区(GS+)。虚线箭头表示血流方向。B: 肝小叶各区域表达绿色荧光蛋白的肝细胞(Hep)百分比。数据为x_±s; n=5。*P<0.05。插图为每个区域5个时间窗(第2周至第4周、第4周至第6周、第6周至第8周、第8周至第10周和第10周至第12周)中肝细胞的增殖率。每个数值代表五个单独的生物样本。<\/p>

A: three liver zones from the periportal to the pericentral regions. Lower panel shows immunostaining for GS (glutamine synthetase) and E-CAD (E-cadherin). ①, ② and ③ indicate zone 1 (E-CAD+), zone 2 (E-CAD–GS–), and zone 3 (GS+), respectively. Dashed arrow indicates blood flow. B: quantification of the percentage of Hep (hepatocytes) expressing GFP in each zone of the liver lobule. Data are x_±s; n=5. *P<0.05. Inset is proliferation (proli.) rate of hepatocytes per week from five time windows (weeks 2 to 4, 4 to 6, 6 to 8, 8 to 10, and 10 to 12) in each zone. Each figure is representative of five individual biological samples.<\/p>

图2 肝脏的三个分区及增殖情况(根据参考文献[31]修改)<\/p>

Fig.2 Three liver zones and regional hepatocyte proliferation (modified from reference [31])<\/p>


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5 肝细胞特异性ProTracer揭示肝脏中明显的“甜甜圈”型增殖模式<\/strong><\/p>

    为了更清楚地辨别整个器官细胞的增殖模式并特异地监测肝细胞谱系, 我们对ProTracer系统进行下一步优化, 将Alb-DreER[36]小鼠与含有双同源重组酶激活的报告基因Ai66的Ki67-CrexER[37]小鼠杂交(图3A)。经Tam注射后, Alb-DreER在肝脏的所有三个分区中均有效地重组肝细胞。Alb-DreER;Ki67-CrexER;Ai66小鼠肝脏切片免疫荧光染色分析结果证实, 所有tdTomato+细胞为Fah+和HNF4a+肝细胞, 而非CK19+导管细胞、Desmin+星状细胞、PDGFRa+成纤维细胞、VE-CAD+内皮细胞和F4/80+巨噬细胞。以上结果证明了由肝细胞特异性ProTracer记录的是特异性肝细胞的增殖, 而不是其他类型细胞的增殖。<\/p>

    我们在Tam诱导Alb-DreER;Ki67-CrexER;Ai66小鼠后的第6周收集了小鼠肝脏样品。肝脏全器官荧光成像结果显示, 肝细胞特异性的tdTomato+增殖信号以独特的类似甜甜圈形状呈现(图3B)。用tdTomato、GS和E-CAD抗体对肝脏切片进行免疫荧光染色, 证实了这种高度区域性的增殖结果, 并表明了大多数具有增殖活性的肝细胞发生在2区(图3C和图3D)。作为技术对照, 在没有注射Tam的情况下, Alb-DreER;Ki67-CrexER;Ai66小鼠肝脏中未观察到任何tdTomato+肝细胞。<\/p>

    在已知AAV8-TBG-Dre(AAV8-Dre)具有强的肝细胞趋向性[38]的基础上, 为避免经Tam注射引起的潜在偏差, 我们通过给Ki67-CrexER;R26-GFP小鼠注射AAV8-Dre来在肝细胞中特异性地激活ProTracer系统。在AAV注射8周后的小鼠肝脏中, GFP+细胞呈肝细胞特异性标志物HNF4a+和FAH+。肝脏切片免疫荧光染色结果表明, 大部分GFP+肝细胞位于2区, 而1区或3区明显较少, 进一步证实了在肝脏稳态期间观察到的中间区域性肝细胞增殖的结果。<\/p>

    我们还探讨了在长期研究过程(如几周到几个月)中, ProTracer系统是否可以扩展为活体小鼠中肝细胞增殖事件的无创监测。我们用荧光素酶小鼠替代荧光报告基因小鼠, 并使用AAV8-Dre[38]实现肝细胞特异性ProTracer激活。在AAV8-Dre诱导的ProTracer激活后, 对同一只活小鼠每两周进行荧光素酶信号监测, 我们发现AAV8-Dre组的荧光素酶活性逐渐增加, 而AAV8-对照组没有。这表明随着时间的推移, 肝细胞增殖逐渐增加。该数据还进一步表明, 肝脏中增殖的甜甜圈样信号是在组织稳态过程中肝细胞增殖逐渐积累的结果。<\/p>


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\"image.png\"/<\/p>

A: 肝细胞特异性ProTracer系统的实验策略。B: Tam诱导肝脏特异性ProTracer小鼠6周后, 肝脏全器官荧光成像结果图。C: 对肝切片进行tdTomato、GS、E-CAD和β-catenin免疫荧光染色图。D: tdTomato+肝细胞在肝小叶各区域的百分比。数据为x_±s; n= 5。*P<0.05。<\/p>

A: the experimental strategy used for hepatocyte-specific tracing of cell proliferation. B: whole-mount fluorescence image of liver collected from hepatocyte-specific ProTracer mouse at six weeks after Tam induction. C: immunostaining for tdTomato, GS, E-CAD, and β-catenin on liver sections. D: quantification of the percentage of hepatocytes expressing tdTomato in each zone of the liver lobule. Data are x_±s; n=5. *P<0.05.<\/p>

图3 肝细胞特异性ProTracer系统(根据参考文献[31]修改)<\/p>

Fig.3 Hepatocyte-specific ProTracer (modified from reference [31])<\/p>


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6 大多数被ProTracer标记的Ki67+肝细胞发生了细胞分裂<\/strong><\/p>

      大多数肝细胞是多倍体和双核的[39], 因此, 表达细胞周期标记物(如Ki67)并不一定代表肝细胞发生了细胞分裂, 有可能是发生了多倍体化或者核分裂[40-41]。为确定ProTracer标记的Ki67+细胞进行细胞分裂和多倍体化的比例, 我们用低剂量AAV8-Dre对Ki67-CrexER;R26-GFP小鼠中Ki67+肝细胞进行稀疏GFP标记。通过稀疏标记实验, 我们发现存在成对的邻近的GFP+肝细胞, 表明这些细胞发生了细胞分裂, 而单个的GFP+肝细胞有2个或2个以上细胞核表明是多倍体而没有细胞分裂。为了在三维肝小叶中准确检测这些事件, 我们在50~100 μm厚的肝切片上分析了多个免疫荧光染色Z轴叠图, 结果表明大多数GFP+细胞显示为一对相邻的肝细胞。连续切片和定量数据分析显示, 超过90%的GFP+肝细胞呈2个及以上的细胞聚集状态, 单独GFP+的肝细胞的占比最小。同样, 这些肝细胞大部分位于肝小叶的2区。以上数据表明, ProTracer标记的Ki67+肝细胞大部分发生了细胞分裂。<\/p>


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7 基于Ccna2的ProTracer显示肝细胞高度区域性增殖<\/strong><\/p>

    为证实上述观察结果, 我们利用曾用于检测细胞增殖的第二个细胞周期基因Ccna2[42]构建并培育Ccna2-CrexER小鼠。我们将Tam注射到R26-DreER; Ccna2-CrexER;R26-GFP小鼠体内, 6周后采集肝脏进行分析。肝切片免疫荧光染色结果显示, GFP信号在2区更为明显。定量结果显示, 与1区和3区相比, 2区肝细胞增殖率明显更高。<\/p>

    为了进一步增加独立于Tam但能特异性标记肝细胞Ccna2的ProTracer分析, 我们用AAV-Dre病毒诱导Ccna2-CrexER;R26-GFP小鼠, 并在12周后收集肝脏。全器官荧光成像显示出饱满的GFP+信号的圆形图案。免疫荧光染色肝脏切片及定量数据结果显示, GFP+肝细胞密度在2区最高, 3区最低, 这一结果与我们基于Ki67的ProTracer实验一致。综上所述, 基于ProTracer的细胞增殖基因(Ki67和Ccna2)记录显示了肝细胞在肝稳态期间增殖的空间异质性, 并揭示了肝小叶中肝细胞增殖的高度区域性。<\/p>


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8 肝损伤和再生情况下肝细胞增殖情况<\/strong><\/p>

    成人肝细胞在受伤的情况下发生自我增殖, 以替代损坏的肝细胞维持细胞稳态, 因而具有显著的再生能力[3]。为研究肝再生过程中肝细胞的增殖, 我们首先进行了部分肝切除术(partial hepatectomy, PHx)模型, 这是一种不引入分区偏差的损伤模型[43]。在Tam诱导ProTracer小鼠1周后进行PHx手术, 在手术后的第24、40天小鼠和2、3、4、7天分析肝脏样本。PHx后第1天至第7天, 全器官荧光成像图显示肝脏中的GFP+信号逐渐增强。免疫荧光染色发现PHx后的第24 h鲜有GFP+肝细胞。PHx后的第40 h, GFP+的肝细胞首先出现在1区, PHx后的第2天, GFP+肝细胞平缓增加, 大部分位于1区和2区。PHx后的第3天和第4天, 肝小叶中GFP+肝细胞显著增加, 大部分位于2和1区, 2区肝细胞增殖已高于1区。第7天, 所有肝区均检测到GFP+肝细胞, 大多数肝细胞标记在1区和2区, 3区部分肝细胞未被标记(图4A)。<\/p>

    为记录3区在肝损伤后修复和再生过程中的增殖事件, 我们对ProTracer小鼠使用导致3区肝细胞急性损伤的四氯化碳(CCl4)处理。在CCl4处理后的第2、4、7天, 我们收集ProTracer小鼠的肝脏样本进行分析。全器官荧光成像显示, CCl4处理后第2天至第7天, 肝脏中GFP+信号增加。肝切片的免疫荧光染色结果显示, CCl4处理后第2天和第4天, 2区富集了GFP+肝细胞。第7天, 2区和3区大多数肝细胞为GFP+。考虑到CCl4主要导致3区肝细胞死亡, 可能是2区肝细胞在第2天率先参与修复或再生过程, 并在第4天至第7天弥补3区肝细胞的损失。此外, 我们对ProTracer小鼠进行1区损伤模型胆管结扎手术(bile duct ligation, BDL), 并在BDL损伤后的第3、4、7天收集肝脏进行分析。我们发现, 在BDL模型中, 门静脉周围区损伤, GFP+肝细胞在2区高度富集, 诱导导管反应(图4B)。综上所述, 这些数据也表明, 损伤后肝脏修复和再生过程中均呈现肝细胞生成能力的高度区域性。<\/p>


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\"image.png\"/<\/p>


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A、B分别为PHx手术模型和BDL手术模型下, 肝小叶各区域表达绿色荧光蛋白的肝细胞(Hep)百分比。数据为x_±s; n=5。*P<0.05。ns: 无统计学差异。A显示GFP+肝细胞百分比随PHx手术后时间推进的趋势。B显示的BDL手术后相关的数据。<\/p>

Both A and B are quantification of the percentage of hepatocytes (Hep) expressing GFP in each zone of the liver lobule. Data are x_±s; n=5. *P<0.05; ns: nonsignificant. A indicates the trend of GFP+ hepatocyte percentage over time on the basis of quantification data after PHx. B indicates the data analysed after BDL.<\/p>

图4 用ProTracer检测肝再生过程中的肝细胞增殖(根据参考文献[31]修改)<\/p>

Fig.4 Hepatocyte proliferation examined by ProTracer during liver regeneration (modified from reference [31])<\/p>

9 应用与展望<\/strong>
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    ProTracer系统能监测和记录在稳态和疾病背景下的组织细胞增殖事件。ProTracer策略有三个突出的特点值得强调。第一, 它允许对动物寿命中的任何时间窗口正在进行的细胞增殖事件进行长时间无缝隙记录(图2B和图4A), 从而实现数月至数年的长期研究。第二, 它可以用于研究某一特定细胞系的增殖。这对于研究极少增殖的细胞类型(如心肌细胞或神经元)尤其有益。与传统的基于化学和免疫荧光染色的方法相比, ProTracer能提高信噪比和分辨率, 将稀有的感兴趣细胞的增殖信号从其他增殖细胞背景中分离出来, 从而特异性的检测该细胞增殖。第三, ProTracer允许对活体动物细胞增殖进行无创的长期监测, 可以不间断地在几个星期、几个月甚至更长时间的窗口内检测同一动物的细胞增殖动态。<\/p>

    肝脏再生领域的一个关键问题是不同肝细胞亚群对肝脏稳态和再生的贡献。不同的研究得出的结论不同[12,17,44]。相较于这些依赖于单独标记基因的谱系示踪研究, ProTracer系统支持对给定类型的所有细胞进行群体水平分析。与最近的研究结果一致[17-18,44], 我们的实验数据不支持之前提出的Axin2+中心周肝细胞是肝干细胞的观点[12]。之前还有研究表明, 所有区域的肝细胞对肝脏稳态的贡献相同[14,16,18], 与此不同, ProTracer系统分析显示, 位于2区的肝细胞群在整个肝小叶中产生更多的新生肝细胞, 形成我们在各种增殖记录实验中观察到的类似于甜甜圈的形状。其他研究可能受限于不同肝细胞亚群的谱系示踪带来的潜在偏差或各自模型的低标记效率, 故没有识别出这个区域。而依赖于EdU掺入或Ki67染色的相关区域性肝细胞增殖分析的传统方法, 记录的时间可能太短, 以至于无法检测到我们基于ProTracer系统展开的研究中观察到的细胞增殖情况[14,18]。同样, 在稳态情况下, ProTracer系统的短期记录没有观察到肝细胞显示出区域增殖优势, 而需要连续记录数周至数月, 这可能是因为肝细胞在体内稳态时的低更新率[18]。ProTracer系统进一步表明, 在部分肝脏修复过程中, 2区肝细胞优先增殖, 这可能是因为大多数损伤发生在邻近的1区和3区[45]。而后续也有其他研究团队利用不同技术进一步证实, 肝内稳态由肝小叶中2区肝细胞维持[46]。<\/p>

    综上所述, 我们的发现以及ProTracer系统将使未来的研究能够进一步剖析不同肝细胞的再生潜力。而ProTracer系统的未来应用和进一步优化将极大地促进我们对细胞生成及其在多个器官发育、生长、再生和疾病中的动态变化的理解与研究。<\/p>

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周斌, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。2002年毕业于浙江大学医学院临床医学系并获得硕士学位; 2006年毕业于中国医学科学院中国协和医科大学并获得博士学位; 2006年至2010年在美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院从事博士后研究; 2010年9月起至2016年8月任中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究员; 2016年9月起至今任职于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员。<\/span>周斌研究员曾获得国际心脏研究会ISHR“杰出研究员奖”、“谈家桢生命科学创新奖”、科学探索奖等多项奖励。<\/span><\/p>","cshort2":"

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周斌, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员。2002年毕业于浙江大学医学院临床医学系并获得硕士学位; 2006年毕业于中国医学科学院中国协和医科大学并获得博士学位; 2006年至2010年在美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院从事博士后研究; 2010年9月起至2016年8月任中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究员; 2016年9月起至今任职于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员。周斌研究组主要开发遗传谱系示踪新技术, 研究哺乳动物体内细胞起源及命运调控机制, 代表性研究工作多次在Nature<\/em>、Science<\/em>、Nat Med<\/em>、Nat Genet<\/em>、Circulation<\/em>、Cell Stem Cell<\/em>、Dev Ce<\/em>ll<\/em>等国际学术期刊上发表。其中发现“哺乳动物新生期心脏具有重新生成冠状动脉的能力”入选2014年度“中国科学十大进展”; 创建的谱系示踪新技术解决了近20年来国际心血管领域内关于心脏干细胞与心肌再生的争议问题; 开发了细胞增殖的遗传学示踪技术, 从全新的角度揭示了器官修复再生的调控机制。周斌研究员曾获得国际心脏研究会ISHR“杰出研究员奖”、“谈家桢生命科学创新奖”、科学探索奖等多项奖励。<\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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【摘要】        高等动物体内气管、脑室管膜及输卵管等上皮组织具有一类富含运动纤毛的多纤毛细胞, 通过其细胞表面运动纤毛的周期性摆动可以清洁气管、驱动脑脊液流动和受精卵运动。运动纤毛发生或功能的异常则可导致气管炎、脑积水、不孕不育等多种遗传疾病。然而, 在多纤毛细胞分化过程中关于如何精确组装运动性纤毛复杂结构的分子机制仍不清楚。该研究运用蛋白组学、超高分辨率显微成像和电镜等多种技术, 发现多纤毛细胞特有的亚细胞结构–纤维状颗粒物是由中心体周围基质蛋白Pcm1相分离形成的具有液体特征的无膜细胞器, 不仅参与调控多纤毛细胞摇篮体的组装和空间分布, 而且在其多孔状结构中大量富集了特定的基体和纤毛的结构蛋白质, 并精确调控这些组分在运动纤毛发生的不同阶段定位到基体和纤毛中, 阐明了纤维状颗粒物作为组织者精确调控运动纤毛组装的分子机制。<\/p>

【关键词】 运动性纤毛; 纤维状颗粒物; 摇篮体; 基体; 轴丝; 中心粒扩增<\/p>


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【Abstract】 Motile cilia are present on the epithelial surface in large numbers to generate a directional fluid flow that is crucial for various biological processes, such as mucociliary clearance in airways, cerebrospinal fluid circulation in the brain, and fertility. Dysfunction of these cilia causes chronic tracheitis, hydrocephalus and infertility. In spite of the important role of motile cilia, little is known about the mechanism for accurate construction of intricate motile ciliary structures. Here, using a combination of proteomic analysis, super resolution microscopy, electron microscopy and live cell imaging, this article discovers that Pcm1 may undergo phase separation to form FGMs (fibrogranular materials), which regulate deuterosome size, number, and distribution, and selectively concentrate multiple important centriole-related proteins as clients. Disruption of FGMs markedly affects the ultrastructure of motile cilia. Together, these findings demonstrate that FGMs organize deuterosomes and centriole-related proteins to facilitate the faithful assembly of basal bodies and multiciliary axonemes.<\/p>

【Keywords】 motile cilia; fibrogranular material; deuterosome; basal body; axoneme; centriole amplification<\/p>


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      纤毛(cilia)是一种突出于细胞表面的特化的毛状细胞器, 其主要由微管构成, 包括基体(basal body)、转接区(transition zone)、轴丝(axoneme)和纤毛膜等结构(图1)。基体在纤毛发生早期由中心粒在远端附属物(distal appendage)作用下特化而成, 因此, 基体的基本结构类似于中心粒, 皆为由九组三联体微管组成的桶装结构。基体与细胞膜融合后在远端附属物顶部形成转接区, 从而将纤毛膜与细胞膜分隔开, 而轴丝则在基体微管的基础上向外延伸, 形成纤毛的主体微管结构, 与基体九组三联体微管不同, 轴丝是由九组二联体微管构成的[1-2]。纤毛的结构虽小, 但是其在胚胎发育及多种生理功能中发挥着重要作用。根据纤毛的功能, 可以划分为两大类(图1): (1) 初级纤毛(primary cilia), 生物体内几乎所有的细胞在一定条件下都可以形成初级纤毛, 通常一个细胞只能组装一根初级纤毛, 主要行使感知和传递细胞外信号刺激的功能[3-5], 比如在初级纤毛中特异性分布的Sonic Hedgehog(Shh)信号通路相关受体及下游蛋白在胚胎发育过程中参与调控多个器官及组织的生长发育, 另外多个GPCR受体如生长抑素受体3(shekel somatostatin receptor type 3, SSTR3)、血清素受体6(serotonin receptor 6, HTR6)、视紫红质(Rhodopsin)以及GPCR信号通路下游腺苷酸环化酶3(adenylyl cyclase 3, AC3)也都特异性分布于初级纤毛中[6-7]; (2) 运动性纤毛(motile cilia), 主要行使运动功能, 通过运动性纤毛的摆动, 可以在细胞表面形成液体流或为细胞运动提供动力。为了实现运动纤毛的运动功能, 在运动性纤毛中存在多个协调控制纤毛运动性的特殊结构如内/外动力蛋白臂(inner/outer dynein arm, IDA/ODA)、辐射轴（radial spoke)、连接蛋白–动力蛋白调节复合物(nexin-dynein regulatory complex)以及中央微管(central pair microtubule, CP)等[8-9]。运动性纤毛一般在细胞表面成束分布, 即在一个细胞中可以组装数量众多的运动性纤毛(图1), 但也存在一些特例, 如单细胞生物衣藻(Chlamydomonas)仅有两根运动性纤毛/鞭毛, 以及成熟的精子细胞只有一根运动纤毛/鞭毛。具有多根运动纤毛的细胞即多纤毛细胞(multiciliated cell, MCC), 其分布于多种终末分化的上皮组织, 例如气管上皮、室管膜上皮及输卵管上皮细胞等。MCC运动纤毛的持续摆动, 可以带动上皮细胞表面的液体流动, 从而行使湿润气管排除异物、营养脑细胞清除代谢废物以及协助受精卵运动等功能[10]。由于纤毛广泛分布于多种细胞类型并行使不同功能, 纤毛功能异常可以导致多种遗传疾病, 统称为纤毛病(ciliopathies), 初级纤毛功能异常的病人通常具有多指/趾、内脏移位、肥胖以及视网膜病变等临床表征, 而运动性纤毛功能缺失则通常导致慢性呼吸道炎症、脑积水和不孕不育等临床表征[2]。<\/p>


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A: 纤毛基体、转接区、轴丝超微结构示意图; B: 超高分辨率显微成像展示小鼠室管膜细胞表面的初级纤毛及运动纤毛; C: 扫描电镜展示非洲爪蟾胚胎多纤毛细胞表面运动性纤毛。<\/p>

A: diagrams for the typical ciliary ultrastructures of the basal body, transition zone, or axoneme; B: representative 3D-SIM images of primary and motile cilia in mouse ependymal cells; C: scanning electron microscope image of motile cilia in multiciliated cells of Xenopus embryos.<\/p>

图1 初生纤毛和运动纤毛超微结构及图像(根据参考文献[24]修改)<\/p>

Fig.1 The typical ciliary ultrastructures and images of primary and motile cilia (modified from reference [24])<\/p>

       在增殖细胞中, 中心粒的复制受到严格调控, 从而保证亲本的遗传物质可以稳定地遗传到子代细胞中。与增殖细胞不同, MCC为了组装数以百计的动纤毛则需要形成相应数目的中心粒/基体, 而且需要在极短的时间窗口内快速完成中心粒成熟(即获得远端附属物)、迁移并与细胞膜锚定、介导动纤毛组装等过程。因此, MCC的分化在生物体内受到一系列转录因子的精确调控。首先, MCC前体细胞在转录因子Gemc1、E2f5和Dp1等作用下激活下游多纤毛化因子Mcidas(multicilin)的转录; 紧接着, 在Mcidas与E2f4/E2f5-Dp1共同作用下激活转录一系列下游蛋白, 其中包括: 中心粒扩增相关蛋白如摇篮体蛋白Deup1, 中心粒结构蛋白如Cep120、Ofd1等以及动纤毛轴丝组装相关转录因子Foxj1等; 随后, Foxj1进一步转录一系列运动纤毛相关蛋白及下游转录因子[11-14]。由此可见, 在MCC分化早期, 参与MCC分化不同过程的不同蛋白几乎同时被大量地合成, 这些蛋白是如何实现归类贮存和按需使用的, 是一个重要且悬而未决的科学问题。<\/p>

        纤维状颗粒物(fibrogranular material, FGM)是一种存在于高等动物MCC的特殊的亚细胞结构。上个世纪六七十年代, 研究人员通过电镜在MCC中观察到这一广泛分布的纤维状颗粒样片状结构, 并发现依附于这种结构的摇篮体(deuterosome)可以介导中心粒从头合成(de novo amplification)[15-17]。由于摇篮体与FGM这一空间分布关系以及电镜技术的局限性, FGM一直被推测为摇篮体的前体。目前除了已知其中含有中心体周围基质蛋白Pcm1外[18], 其分子组成与确切功能一直不为人所知。结合FGM的结构特性以及MCC归类存储的分化需求, MCC是否有可能通过FGM实现不同蛋白的归类存储和按需使用呢？<\/p>

       为了研究MCC运动纤毛的分化过程, 在本研究中我们采用了小鼠气管上皮细胞(mouse tracheal epithelial cells, mTECs)和小鼠室管膜上皮细胞(mouse ependymal cells, mEPCs)体外分化系统。由于mTECs和mEPCs的体外分化过程可以重现MCC中心粒扩增至运动纤毛组装等分化的全部过程[19-20], 我们可以利用这两个系统开展运动纤毛的分子机制研究。我们以Pcm1为研究目标分析其与MCC分化的关系, 发现Pcm1蛋白水平随着mTEC分化进程显著提高, 提示Pcm1参与MCC分化过程。借助3D-SIM超高分辨率显微镜, 我们发现Pcm1标记的亚细胞结构在MCC分化早期就开始在细胞质中大量形成, 随着MCC分化细胞内该结构的数目逐渐减少但是其尺寸却显著变大。免疫电镜观察进一步证实, Pcm1标记的亚细胞结构确实为FGM。我们利用空间分辨率更高的聚焦离子束扫描电镜(focused ion beam scanning EM, FIB-SEM)进一步分析FGM的结构, 结果显示, FGM是一种由高度聚集的FGM核心结构以及填充其中及周边松散的纤维状颗粒(fibrous granule, FG)构成的类似海绵的多孔状结构。这种片形多孔状结构具有极大的表面积, 为大量吸附或存储蛋白提供可能。同时, 我们也发现, MCC分化过程中摇篮体常依附于FGM介导中心粒扩增(图2), 提示FGM可能与摇篮体存在某种生物学联系。<\/p>

       为了进一步研究FGM的功能, 我们利用siRNA在mEPC中人为敲低Pcm1蛋白水平并通过连续切片电镜观察证实, 敲低Pcm1后MCC细胞中FGM无法形成, 因此, 我们可以借助敲低Pcm1来研究FGM的功能。我们发现, 在MCC分化过程中破坏FGM形成并不影响最终中心粒以及运动纤毛的数量, 但是导致了摇篮体的数目、大小和分布的显著异常。与对照细胞相比, Pcm1敲低后MCC中摇篮体数目显著增多, 但是其尺寸却明显变小, 并且每个摇篮体介导组装的中心粒数目也显著减少, 另外摇篮体也不再聚集在亲本中心粒附近而是广泛地分布于整个细胞基质。结合FGM和摇篮体的空间分布关系, 这一结果提示, FGM参与了调控MCC摇篮体的组装和空间分布。<\/p>

       虽然Pcm1敲低导致摇篮体的形态和分布异常, 但并不影响MCC运动纤毛的数量, 那么, 这些形成的运动纤毛是否能正常行使运动功能呢？借助高速活体显微成像技术捕捉运动纤毛的运动轨迹, 我们发现在对照细胞中, 运动纤毛主要呈现规律性的麦浪式摆动, 而在Pcm1敲低的MCC中运动纤毛则是无规律的转动或彻底丧失运动能力。为了进一步了解Pcm1敲低如何影响运动纤毛的运动性, 我们利用电镜细致观察了纤毛的基体、转接区和纤毛轴丝的超微结构。结果显示, Pcm1敲低后纤毛基体的三联体微管结构、转接区和轴丝的二联体微管结构以及轴丝的中央微管结构等都不同程度的明显受损, 而纤毛超微结构损伤则极有可能最终影响了运动纤毛的规律性摆动。另外, 通过功能恢复实验, 我们证实了外源性表达的Pcm1蛋白可以恢复MCC中FGM的形成以及运动纤毛的正常摆动。因此, 这些结果表明, Pcm1介导组装的FGM对于MCC运动性纤毛的正确组装至关重要。<\/p>

       既然FGM对于运动纤毛超微结构的正确组装至关重要, 那么FGM又是如何参与调控这一过程呢？为了回答这一问题, 我们首先需要更为细致地了解FGM的分子组成。利用抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APEX)介导蛋白质邻近标记技术结合质谱分析, 我们发现很多中心粒相关蛋白如Cep135、Cep120、Ofd1、Pcnt和Cep215等都可以被特异性邻近标记。随后, 我们利用超高分辨率显微镜以及免疫电镜进一步证实这些中心粒相关蛋白定位于FGM。为了进一步了解Pcm1与这些新鉴定的FGM组分的关系, 我们在mEPC中敲低Pcm1, 然后通过免疫染色检测其在MCC分化过程中的空间分布。结果显示, Pcm1敲低后, 所有新鉴定蛋白的FGM定位消失, 并且各蛋白伴随中心粒扩增进程的中心粒定位的时序调控被显著破坏。以Cep135蛋白为例, 在对照细胞中, Cep135在细胞质中定位于FGM, 并且在中心粒复制早期并不定位至中心粒, 而在复制晚期逐渐呈现显著的中心粒定位。但是在Pcm1敲低的细胞中, 细胞质中FGM样分布的Cep135完全消失, 同时在中心粒复制早期Cep135即定位至中心粒。因此, 与我们的假设一致, 这些结果证实, FGM的确可以存储MCC分化相关的多种蛋白并且调控各蛋白的有序释放和按需使用, 从而实现FGM对运动纤毛正确组装的精确调控。<\/p>


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A: 聚焦离子束扫描电镜(FIB-SEM)展示多纤毛细胞中纤维状颗粒物与摇篮体的空间分布; B: Pcm1片段具有相分离的特性。红色和蓝色箭头分别标记多纤毛细胞摇篮体和纤维状颗粒物。<\/p>

A: focused ion beam scanning EM (FIB-SEM) revealed the spatial relationship between FGMs and deuterosomes in multiciliated cells; B: Pcm1 fragments phase-separated into hydrogels. The red arrowheads indicate deuterosome-procentriole complexes spatially adjacent to FGM cores, and the blue arrow indicates the FGM.<\/p>

图2 Pcm1相分离形成多纤毛细胞纤维状颗粒物亚细胞结构(根据参考文献[24]修改)<\/p>

Fig.2 Pcm1 undergoes phase separation to form fibrogranular materials in multiciliated cells typical ciliary<\/p>

ultrastructures and images of primary and motile cilia (modified from reference [24])<\/p>

       另外, 我们还发现Pcm1敲低后, 中心粒远端蛋白Cetn1可以显著地穿过纤毛转接区伸入至纤毛轴丝内部, 从而呈现中心粒以及轴丝基部两种区域性定位。进一步研究发现, Pcm1的结合蛋白Cep131则仅与Cetn1共定位于纤毛轴丝基部这一区域。我们还发现, 运动纤毛的中央微管和辐射轴也是在Cep131-Cetn1标记的这一结构基础上组装的, 因此, 我们将这一个新的纤毛亚结构命名为中央微管座(CP-foot)。尽管在对照细胞中也存在相应结构, 但Pcm1敲低后中央微管座显著增长并且影响了运动纤毛中央微管和辐射轴在轴丝中的空间分布, 这一个改变也可能是影响运动纤毛运动性的重要原因。<\/p>

       最后, 我们还对Pcm1如何介导FGM组装进行了初步研究。蛋白质相分离是最近几年新发现的一种蛋白质特性, 即在某种条件下细胞内的特定分子(蛋白质或蛋白质–核酸等)通过某种特定方式聚集起来, 从而在无序的细胞内部形成具有一定秩序的无膜结构[21]。蛋白质通过自身的结构特性发生蛋白分子间相互作用促使相分离的实现, 其中一类以具备多个折叠的结构域为特征, 而另一类则以内部无序区域(intrinsically disordered region, IDR)为特点[22-23]。我们首先通过活体成像观察在MCC分化过程中GFP-Pcm1是否具有相分离的特征, 我们发现GFP-Pcm1形成的FGM可以发生融合现象(即两个FGM接触并融合成一个较大的FGM), 而进一步的荧光漂白恢复实验(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)证明FGM可以与细胞质进行物质交换, 这些结果表明, 在MCC中GFP-Pcm1蛋白具备相分离的特征。通过预测Pcm1蛋白二级结构, 我们发现Pcm1蛋白富含IDR。通过在Escherichia coli中表达纯化His-GFP标签的Pcm1的蛋白片段(N: 316~824 aa; M: 1 072~1 337 aa; C: 1 694~2 024 aa)并进行体外液滴(liquid droplet)形成实验, 我们发现, Pcm1M可以相分离形成液滴, 而且该液滴同样具备融合以及与环境进行快速物质交换等特性。尽管Pcm1N和Pcm1C不能相分离形成液滴, 但是两者都可以形成透明的凝胶状物质(hydrogel)(图2)。综合上述结果, 我们推测, FGM可能是由Pcm1相分离形成的具有液体特征的、大型(直径可达2 μm)的、动态的无膜细胞器。<\/p>

       通过结合蛋白组学、超高分辨率显微成像、活细胞高速显微成像和多种电镜技术, 我们的研究工作不仅成功解析了FGM的分子组成, 而且明确了FGM在MCC分化过程中的重要功能[24]。我们发现, FGM在MCC分化过程中由Pcm1相分离形成的具有液体特征的无膜细胞器行使组织者的功能, 它们不仅可以黏附摇篮体, 参与调控MCC摇篮体的组装和空间分布, 而且在其多孔状结构中大量富集了特定的基体和纤毛的结构蛋白质, 通过某种未知的机制精确调控这些组分在纤毛发生的不同阶段定位到基体和纤毛中, 从而保证运动纤毛精细结构组装的有序性和正确性, 有效地避免由于运动纤毛功能异常导致的疾病发生。<\/p>


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参考文献 (References)<\/p>

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赵惠杰, 美国国立卫生研究院国家癌症研究所博士后。2007年毕业于南京大学生命科学院, 2014年在中科院上海生物化学与细胞生物学研究所获博士学位, 毕业后继续留所从事博士后研究, 2017年赴美国国立卫生研究院国家癌症研究所开展博士后研究。主要从事中心体及纤毛相关研究, 在多纤毛细胞中心粒扩增、运动性纤毛组装的分子机制以及运动纤毛与遗传性纤毛病等方面取得了重要进展。作为第一作者, 揭示了多纤毛细胞与增殖细胞中心粒复制的分子机理(ZHAO et al.<\/span> Nat Cell Biol<\/em>, 2013; ZHAO et al. <\/span>EMBO R<\/em>, 2019; ZHAO et al. <\/span>J Cell Sci<\/em>, 2020)及运动纤毛组装的调控机制(ZHAO et al. <\/span>Nat Commun<\/em>, 2021)。<\/span><\/p>","cshort2":"

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赵惠杰, 美国国立卫生研究院国家癌症研究所博士后。2007年毕业于南京大学生命科学院, 2014年在中科院上海生物化学与细胞生物学研究所获博士学位, 毕业后继续留所从事博士后研究, 2017年赴美国国立卫生研究院国家癌症研究所开展博士后研究。主要从事中心体及纤毛相关研究, 在多纤毛细胞中心粒扩增、运动性纤毛组装的分子机制以及运动纤毛与遗传性纤毛病等方面取得了重要进展。作为第一作者, 揭示了多纤毛细胞与增殖细胞中心粒复制的分子机理(ZHAO et al. Nat Cell Biol<\/em>,<\/span> 2013; ZHAO et al. EMBO R<\/em>, 2019; ZHAO et al.  J Cell Sci<\/em>, 2020)及运动纤毛组装的调控机制(ZHAO et al. Nat Commun<\/em>, 2021)。<\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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【摘要】 金属元素是生命体中的重要成分。近年来, 金属免疫学的发展令人瞩目, 其广度和深度正在被快速地拓宽和挖掘。锰元素是金属免疫学研究领域中的后起之秀, 越来越多的研究表明, 锰(离子)在免疫系统中扮演了很重要的角色, 锰离子所具有的免疫调控功能相当丰富, 其作用被大大低估。现有的研究结果提示, 锰离子在营养免疫和天然免疫等过程中发挥功能。该文对于锰金属免疫学进行了详述, 从多个层面介绍并分析了锰离子的免疫调控功能, 提出了锰离子作为细胞危险相关分子模式的工作模型, 并总结和展望了基于锰离子免疫调控功能而发展出的现有的及未来可能的不同应用。<\/p>

【关键词】 锰离子; 免疫调控; 天然免疫; 抗病毒; cGAS-STING通路; 危险相关分子模式; 佐剂; 肿瘤免疫疗法<\/p>


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【Abstract】 Metals are essential components of all living beings. The progress of metalloimmunology has been remarkable in recent years, in which the breadth and depth are being explored rapidly. Manganese is a promising member in the field of metalloimmunology. Increasing studies indicate that manganese (Mn2+<\/sup>) plays an indispensable role in the immune system with its actual immunomodulatory effects vastly underestimated. Available research results show that manganese (Mn2+<\/sup>) not only functions in nutritional immunity, but also in innate immunity and so on. This review introduces manganese metalloimmunology in detail, analyses Mn2+<\/sup>-dependent immunomodulation in multi-aspects, proposes a working model for Mn2+<\/sup> acting as a new member of DAMPs (danger associated molecular patterns), and discusses the future immunomodulatory application of Mn2+<\/sup>. <\/p>

【Keywords】 Mn2+<\/sup>; immune regulation; innate immunity; anti-virus; cGAS-STING pathway; DAMPs (danger-associated molecular patterns); adjuvant; tumor immunotherapy<\/p>


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       金属元素是生命体不可或缺的组成部分, 其重要性体现在许多方面: 金属元素在几乎所有的生命过程中发挥了重要作用, 如基因表达调控、细胞信号转导及个体发育等; 约三分之一的已知蛋白酶需要金属离子行使生理学功能, 后者作为辅因子发挥结构、催化或调节的功能[1]; 由于带电荷的金属离子不能自由地跨越磷脂双分子层流动, 金属离子的跨膜浓度梯度易于形成, 因而金属离子具有作为信号传递中间体的天然优势, 其中最广为人知的便是钙离子的第二信使功能。事实上, 如果将第二信使简单定义为通过浓度变化转导信号, 调节细胞内蛋白功能的非蛋白类化学小分子, 那么除了钙之外的很多金属离子都在一定程度上符合这个定义, 例如: 胞内锌离子浓度的上升有助于对磷酸酶SHP-1(SH2-containing protein tyrosine phosphatase-1)活性的抑制和激酶ZAP-70(zeta chain of T cell receptor associated protein kinase 70)活性的增强, 从而协助T细胞受体通路的激活和T细胞成熟[2]; 胞内钾离子浓度的降低有助于激活NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3)炎症小体, 并且该现象是在多种结构、性质截然不同的诱导物引起NLRP3激活时普遍存在的[3]; 胞浆中锰离子浓度的升高能够显著增强环GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)和干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon gene, STING)的活性, 从而助力于机体抵抗DNA病毒的感染[4]。金属元素在免疫系统中极为重要。近一百年前, 人们就已经发现了金属元素调节免疫系统的案例: 当今在人体唯一被广泛使用的佐剂是于1926年被发现并逐步应用的铝佐剂[5]; 镍接触性皮炎在1950年大规模出现, 直到2010年研究人员才发现镍离子通过结合并激活Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4), 促使巨噬细胞释放炎性细胞因子并激活T细胞, 引发超敏反应[6]; 顺铂作为化疗药物, 多年来在临床上被广泛应用于多种实体瘤的治疗[7]; 最近发现的钾离子在肿瘤免疫环境中对T细胞代谢的影响[8]及T细胞分泌IFN-γ(interferon gamma)促进肿瘤细胞铁死亡的研究[9], 使得人们对金属离子在肿瘤免疫中的作用有了新的认识, 并提示诱导铁死亡可能作为一种新的肿瘤免疫治疗手段。这些金属离子免疫调控功能的发现极大地促进了金属免疫学的发生与发展, 使得这个重要学科越来越引人注目[10]。锰元素(manganese, Mn)属于过渡金属元素, 是地球上含量第五多的金属元素, 广泛存在于地表和海底。锰的应用很多, 包括有色金属、化工、农业和医药等领域。锰元素大多以二价锰离子(Mn2+)的形式存在, 后者的离子半径处于钙离子和镁离子之间。体外实验显示, 锰离子几乎能与所有的钙离子和镁离子结合位点相结合, 而且在一些需要钙离子或镁离子参与的生物过程中, 锰离子通常能够替代上述两种离子的功能[11-13]。从生物化学的角度来看, 锰离子和镁离子在细胞中的催化作用存在着密切的联系。一方面, 二者具有相似性, 锰离子经常能够替代镁离子作为催化核心与酶结合, 催化类似的生化反应发生; 另一方面, 二者发挥的功能又是不尽相同的, 具体体现在对底物的偏好性和亲和力、反应的产物和酶促反应的效率等方面。在锰离子替代镁离子进行的体外催化反应中, 酶的活性通常会比以镁离子为催化核心时更高。2018年一个令人意外的发现, 不同离子的结合使核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的活性甚至功能发生显著变化: Rubisco与镁离子结合有利于底物RuBP的羧化; 而当Rubisco与锰离子结合时, 则促进底物的氧化。这样, 锰离子催化的光呼吸原初反应会产生乙醇酸和丙酮酸, 后者促进叶绿体中苹果酸的产生和硝酸盐的同化, 使得光呼吸不再是传统意义上的纯耗能过程[14]。而我们实验室[15]最近的研究则发现, 锰离子催化cGAS产生第二信使cGAMP(cyclic GMP-AMP)的过程与镁离子大不相同, 并且完全不依赖于DNA。作为金属免疫学的重要一员, 近年来锰离子在免疫系统中的功能研究进展迅速。本文总结了锰元素在免疫系统不同环节中发挥的功能, 并对锰离子免疫激活功能的应用潜力进行了评述, 最后对锰离子作为免疫调节剂的实际应用进行了展望。<\/p>


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1 锰的稳态<\/strong><\/p>

       锰元素是生命体所必需的微量元素之一。成年人体内的锰元素含量约为10~20 mg。锰元素普遍存在于人体中的所有细胞内, 而细胞中主要贮存锰的部位是细胞核、线粒体和高尔基体。锰元素的胞内稳态的维持机制尚不完全知晓。目前已知的参与锰转运的蛋白或系统包括二价金属离子转运蛋白-1(divalent metal transporter 1, DMT1)、锌转运蛋白ZIP8/14、钙池调控的钙离子通道及转铁蛋白系统等[16-20]。大多数已知的锰转运蛋白是非特异性的, 尚不能解释锰离子的胞内浓度是如何选择性地得以维持而不影响其他金属离子的稳态。细胞膜内外以及细胞中不同的亚细胞结构之间存在着不同的锰离子(Mn2+)浓度差。正如上文提到, 这种性质使得锰离子具有了“信使”的潜力。锰元素通过调控一系列的锰离子催化酶来发挥功能, 在许多生命过程中发挥重要的调控功能。这些锰依赖酶包括, 但不限于氧化还原酶、异构酶、连接酶、裂合酶和水解酶, 例如超氧化物歧化酶和谷氨酰胺合成酶等[21]。<\/p>

      通常来说, 食物来源的锰元素足以保障生物体对锰的需求。正常的成年人大约只能够吸收食物中摄入锰的3%~5%, 其进入循环后大部分被肝细胞摄取, 多余的锰则途经胆汁、肠道, 最后通过粪便排出, 反映出机体对锰的吸收有非常严格的调控及锰的稳态对于生物体正常的生理功能是必不可少的。由于食源性锰缺乏症的罕见性, 故通常在实验条件下研究锰稳态失调产生的影响。研究发现, 锰元素缺乏的生物体中出现多种病症, 包括生长障碍、骨骼异常、运动失调和糖脂代谢异常等[22-23]。此外, 只有少数的基因缺陷会导致锰元素的稳态失调。例如, SLC39A14<\/em>(solute carrier family 39 member 14, 又名ZIP14<\/em>)或SLC30A1<\/em>0<\/em>(solute carrier family 30 member 10, 又名ZnT10<\/em>)的缺陷会引起遗传性的高锰血症, 导致肌张力障碍和神经退行性病变等疾病的发生[19,24]; SLC39A8<\/em>(solute carrier family 39 member 8, 又名ZIP8<\/em>)的突变则会导致严重的锰缺乏综合征, 与发育迟缓和青少年特发性脊柱侧弯(adolescent idiopathic scoliosis, AIS)等病症存在关联[25]。锰元素的稳态对于免疫系统功能的影响还需要进行更多的研究。<\/p>


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2 锰元素是营养免疫中的重要环节<\/strong><\/p>

      铁、锌和锰等金属元素是病原微生物生长和繁殖必需的营养元素。为了抵抗入侵的病原微生物, 机体采取多种方法限制其获取这些营养元素, 这种防御机制被称作营养免疫。锰元素是许多细菌蛋白功能发挥所必需的, 例如, 锰依赖的超氧化物歧化酶(sodA)、ppGpp合酶、PEP羧化酶和PEP羧化激酶等[26]。病原微生物通过表达高亲和力的锰转运体来获得更多的锰元素。细菌中常见的锰转运系统包括MntABC和MntH蛋白家族等[27-28]。这些锰转运蛋白功能的缺陷会减弱许多细菌的毒力, 包括酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes<\/em>)、鼠疫耶尔森氏菌(Yesinia pestis<\/em>)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus<\/em>)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae<\/em>)等[28-30]。
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       锰元素是营养免疫中关键的一环, 因此机体采取不同的方式分别从胞外和胞内水平限制感染部位的锰元素含量。S100蛋白家族成员钙卫蛋白(calprotectin)负责调控胞外的锰浓度, 从而限制病原微生物的生长[31]。研究表明, 当葡萄球菌感染发生时, 机体中的脓肿部位几乎检测不到锰元素, 而在健康组织中锰的含量是正常的。钙卫蛋白缺陷的小鼠感染了葡萄球菌后, 其脓肿组织中则富含锰元素, 并且菌的繁殖能力变得更强[32]。Nramp1(natural resistance-associated macrophage protein-1, 又名DMT-2)被用于调节胞内的锰元素水平[33]。NRAMP1在中性粒细胞和巨噬细胞等多种细胞中表达, 能够将锰转运出吞噬体, 限制吞噬体中的病原微生物获取锰。NRAMP1的突变会造成机体对多种胞内病原体的易感性[34]。综上所述, 宿主和病原微生物分别采取策略对于锰元素展开了争夺, 其成败对于感染是否发生是至关重要的。<\/p>


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3 锰离子是天然免疫的传令兵<\/strong><\/p>

       天然免疫系统是机体抵抗病原体入侵和感染的第一道防线, 能够通过各种不同的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别不同病原体所共有的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs), 例如鞭毛蛋白、脂多糖和病毒核酸等。机体中的PRRs主要包括Toll样受体(Toll like receptor, TLR)、RIG-I样解旋酶受体(RIG-I-like helicase, RLH)、NOD样受体(NOD-like receptor, NLR)和cGAS-STING。早在几十年前, 锰离子对于天然免疫的作用就有一些零星报道, 例如人们发现, MnCl2的腹腔注射可能通过介导I型干扰素(type I interferons, I-IFNs)的产生, 从而增强了幼鼠体内自然杀伤细胞的活性[35], 但是其促进I型干扰素产生的机制完全不清楚。近年来更多的研究表明, 锰离子对于一些PRRs的激活也有着重要的影响。我们近期的研究表明, 锰离子能够发挥危险相关分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)或警报素(alarmin)的作用, 传递病毒入侵的信号并激活天然免疫系统中的不同环节, 从而协助机体抵抗病毒的入侵, 是一个天然免疫的“传令兵”。
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3.1 锰离子和cGAS-STING通路<\/p>

       锰离子作为警报素的第一重功能, 体现在其激活cGAS-STING通路的能力[4]。当病毒入侵机体时, 会破坏宿主细胞的线粒体膜电位并导致细胞器的酸化, 使得线粒体、高尔基体等贮锰细胞器中的锰离子释放到胞质及胞外。细胞质中升高的锰离子浓度对于cGAS-STING通路具有双重的激活作用, 促进大量的I型干扰素产生。一方面, 锰离子作用于cGAS, 能够上万倍地提升cGAS对于双链DNA(double stranded DNA, dsDNA)检测的灵敏性并促进其酶活(即提升合成第二信使cGAMP的能力); 另一方面, 锰离子作用于STING, 增强其与多种环化二核苷酸(cyclic dinucleotides, CDNs)的亲和能力。总的来说, 锰离子能够使得细胞中的cGAS-STING通路处于超活化的状态, 提升其对于细胞质中的dsDNA(细胞质DNA或DNA病毒)的响应灵敏度, 甚至使其在原本不具激活能力的dsDNA水平下也能够被激活[36]。此外, 体外实验表明, 不管被病毒感染的细胞是活着还是发生了焦亡, 其细胞外的锰离子浓度都会升高。同时, 当小鼠受到病毒感染时, 其气管肺泡灌洗液、白细胞及肺泡巨噬细胞中检测到升高的锰离子浓度。值得注意的是, 当小鼠缺乏锰元素时, 其抵抗DNA病毒的能力受到了显著的抑制。这些实验证据提示了锰离子的释放与抗病毒反应的生理学相关性。向细胞外释放的锰离子可能被远端的树突状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞摄取, 增强这些免疫细胞中的天然免疫反应, 进而加快适应性免疫的进程。<\/p>

       近期发表的工作及我们正在进行的研究为锰离子激活cGAS-STING通路提供了新的实验证据。研究表明, 锰离子激活cGAS可以独立发生而不依赖于dsDNA的存在[37]。我们最近的研究发现, cGAS催化合成cGAMP的过程在锰离子单独存在时或镁离子和dsDNA共同存在时显著不同。结构生物学的研究表明, 锰离子与cGAS结合的晶体结构中, 锰离子结合于cGAS蛋白, 导致其构象产生很大的变化。cGAS结合锰离子产生的构象变化与结合DNA时的构象变化大体相似, 但催化中心的结构却明显不同, 导致cGAMP在cGAS酶催化中心的合成过程也发生很大变化[15]。这些研究为锰离子作为免疫调节剂的功能研究提供了新的方向。综上, 我们认为锰离子具有的诱导、动员能力及免疫激活活性使其具有了作为危险相关分子模式或警报素的潜力。<\/p>

3.2 锰离子和NLRP3炎症小体通路<\/p>

       NLRP3炎症小体的激活机制还未达成共识, 原因在于其能够对于多种差异较大的刺激物产生响应, 包括颗粒物(石棉、二氧化硅和尿酸结晶等)、穿孔毒素、ATP和一些病原体等[38]。NLRP3炎症小体的激活能够导致炎性细胞因子IL-1β(interleukin-1 beta)和IL-18(interleukin-18)等的释放和细胞焦亡的发生, 是细胞中重要的模式识别受体通路之一。研究表明, 锰离子能够激活NLRP3炎症小体通路, 在神经细胞中引起自噬小体–溶酶体的损伤和神经炎症的加速[39]。此外, 细胞焦亡发生后炎症受体蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)会聚集到细胞外, 含ASC的外泌体随着体液运输, 从而形成了细胞间ASC的传递以及NLRP3炎症小体通路激活的传播[40]。锰离子的处理能够促进LPS预处理的小胶质细胞中ASC外泌体的分泌和在细胞间的传播[41]。当使用LPS和锰离子处理的小胶质细胞产生的ASC外泌体作用于受体细胞时, 相较于未使用锰离子处理的对照组, 细胞中NLRP3和pro-IL-1β的mRNA水平明显升高。处于慢性锰暴露环境的人群(例如电焊工)中, 其血清中ASC外泌体和炎性细胞因子的含量相较于对照组更多。长期处于富锰环境中可能导致这些人群的血浆外泌体中具有更多错误折叠的α-突触核蛋白(α-synuclein), 进而发展出一些神经疾病的症状[42]。锰离子介导的炎症激活和ASC外泌体释放预示着另外一种通过锰离子来警示危险信号的机制。<\/p>

       我们实验室[43]最近研究发现了锰离子激活NLRP3炎症小体通路的更多机制和应用。研究表明, 锰离子激活NLRP3炎症小体不依赖于固体颗粒形成或线粒体DNA泄漏, 而与ROS产生、钾离子外流和钙离子释放存在密切联系。单独的锰离子处理时不会诱导IL-1β和IL-18的切割和释放, 但会诱导GSDMD(Gasdermin D)的切割和细胞焦亡的发生。这些性质具有重要的意义: 锰离子作为DAMP传递危险信号的同时不会引发系统性的炎症反应。对于后文介绍的以锰离子为基础的新型锰佐剂来说, 这也是其毒副作用显著低于其他佐剂的可能原因。<\/p>

3.3 锰离子和保护性细胞凋亡<\/p>

       细胞凋亡与天然免疫, 特别是抗病毒免疫之间具有密切的联系。病原体的入侵能够激活宿主的天然免疫反应, 包括: (1)抗感染I型干扰素等细胞因子的产生; (2)炎性小体(inflammasome)的活化; (3)细胞凋亡(apoptosis)活化以杀死被感染的细胞。由于病毒的复制依赖于被感染细胞的完整性, 被感染细胞的凋亡能够阻断病毒的复制, 是机体中抑制病毒传播的重要方式。同时, 有研究表明转录因子IRF3介导的抗病毒免疫反应不仅包括诱导IFNs和抗病毒基因的表达, 也包括激活RIPA细胞凋亡通路(the RLR-induced IRF3-mediated pathway of apoptosis), 从而阻止病毒的复制[44]。虽然三者对于清除病原微生物都很重要, 但任何一条通路的过度活化均会引起自身免疫疾病的发生, 所以天然免疫系统的稳态维持非常重要。我们曾发现感染后活化的炎性蛋白酶(inflammatory caspases: CASP1/11/4/5)切割cGAS, 抑制胞质DNA诱导的I型干扰素产生[45]; 而感染导致的细胞凋亡被活化时, 激活的凋亡效应蛋白酶(apoptotic effector caspases: CASP3/6/7)会切割天然免疫通路中的关键蛋白: cGAS、MAVS和IRF3, 并使这些蛋白完全失活, 避免天然免疫过度活化及细胞因子过度产生。更为重要的是, 凋亡蛋白酶切割天然免疫蛋白是细胞凋亡维持“天然免疫沉默”的重要机制。这样的“免疫沉默”对于机体的正常生理活动是至关重要的。否则胚胎无法正常发育, 而成年个体则会始终处于发炎状态[46]。由此可见, 这种保护性的细胞凋亡是天然免疫中的重要环节。<\/p>

       由于锰离子对于细胞凋亡的作用是下文所述锰离子的警报素功能中重要的一环, 下面将对锰离子与细胞凋亡之间的联系进行阐述。在低浓度下, 锰离子具有类似过氧化氢酶的活性, 能够作为抗氧化剂促进氧化应激的消除[47]。但在高浓度下, 锰离子也能够促进细胞凋亡的发生[48], 其作用途径可能依赖于半胱天冬酶caspase-8或caspase-12的激活[49-50]。锰离子对于细胞凋亡的作用可能是与其浓度和作用的细胞类型有关的。值得注意的是, 锰离子能够在多个前列腺癌细胞株中增加G0/G1期滞留的细胞并诱导其凋亡, 具有在前列腺癌治疗中应用的潜力[51]。<\/p>

      锰离子还能从多个层面激活ATM-p53信号通路。首先, ATM(ataxia telangiectasia mutated)的激酶活性依赖于锰离子[52]。其次, 锰离子对于MRN复合物(Mre11/Rad50/Nbs1)十分重要。锰离子对于Mre11的核酸外切酶活性是必需的, 并且不能够被镁离子或钙离子所替代[53]。此外, 锰离子的处理也能够使细胞中的p53水平升高[54]。ATM-p53通路促进细胞凋亡的发生, 而快速有效地清除凋亡细胞是维持机体稳态的重要前提[55]。综上, 病毒感染的细胞中局部高浓度的锰离子也可能会诱发保护性的细胞凋亡, 从而以“建立隔离带”的方式阻止感染的传播。<\/p>

3.4 锰离子的警报素功能<\/p>

       锰离子是天然免疫活化的使动因素之一。综合前面提到的这些锰离子所具有的多样免疫激活能力, 我们总结并猜想锰离子作为细胞危险相关分子模式在天然免疫中充当传令兵的工作模式图(图1)。锰离子的化学梯度的维持及锰盐的固定是持续耗能的过程, 因而细胞的代谢系统对于锰的正常分布是必要的。当病毒入侵细胞后, 劫持细胞中的代谢系统并引起锰离子的释放, 建立了从感染中心向外逐渐降低的锰离子浓度梯度。感染中心的细胞中具有最高浓度的锰离子, 后者激活caspase并引起细胞凋亡的发生, 建立了阻止感染蔓延的第一道防火带; 邻近感染中心的细胞暴露在次强的锰离子信号中, 这些细胞中发生ATM-p53和NLRP3炎症小体通路的激活, 上调了对于DNA断裂等感染早期分子生物学事件的侦测灵敏度, 促进细胞凋亡和细胞焦亡的发生, 建立了防止感染扩散的又一道防火带; 与感染中心距离更远的细胞中, I-IFNs等多种抗感染细胞因子和趋化因子大量表达, 吸引招募大量的专职免疫细胞如淋巴细胞、巨噬细胞及树突状细胞, 并促进树突状细胞的成熟及抗原递呈, 进而激活获得性免疫; 更远端的细胞中, cGAS-STING通路被预先活化, 显著降低了对于胞内病原体的检测线, 从而使细胞处于一种机警的状态。鉴于病原体发展了多种逃避机体中模式识别受体等主动防御模式的机制, 这种细胞中稳态破坏所活化的被动防御机制就显得尤为重要了。<\/p>

       同时, 锰离子-DAMPs模式符合能量消耗最优化的原则。这种模式的精妙之处在于充分活化各类细胞的同时, 付出的却是细胞中最小的代谢负担。对于不同的细胞, 锰离子所传递的警报和引起的后果是不同的。对于处在危险之中的感染中心或邻近的细胞, 最强烈的锰离子信号直接引起细胞的死亡, 切断病毒的传播, 消耗最多的能量; 对于中等距离的细胞, 中等强度的锰离子信号启动抗感染蛋白的合成, 消耗中等的能量; 对于更远端的细胞, 锰离子信号只是启动了细胞中预先存在的最基本的抵御机制, 提升对于感染的检测灵敏度, 消耗最少的能量。综上, 锰离子能够根据不同的感染风险, 在机体中激活不同的生化过程, 从而在保证足够的防御能力的同时, 消耗最小的能量总和。<\/p>


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图1 锰离子是天然免疫的传令兵<\/p>

Fig.1 Mn2+<\/sup> is a messenger of the innate immunity<\/p>


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4 锰离子免疫激活性质的应用<\/strong><\/p>

       总的来说, 现阶段基于锰离子免疫激活性质的应用还处于较为初始的阶段。以往对于锰离子的应用很少是基于其免疫激活能力的, 而多是与锰离子本身所具有的一些物化性质相关, 例如基于锰离子具有的核磁共振T1信号而开发的含锰的MRI造影剂锰福地吡。此外, 基于锰离子所具有的核磁共振T1信号及锰化合物在不同pH下的稳定性差异, 研究者设计并合成了以MnO2为外壳, 内部装载了化疗药物和/或光动力学疗法药物的纳米颗粒用于癌症治疗[56-57]。由于肿瘤微环境是偏酸性的, 该纳米颗粒到达肿瘤微环境后, MnO2外壳发生崩解并导致锰离子和药物的释放, 从而实现对于肿瘤的核磁共振成像和药物的靶向释放。在逐渐的应用过程中, 也有研究者开始聚焦于锰离子激活免疫的能力。最近, 有研究者制备了基于锰纳米颗粒的肿瘤治疗药物, 通过在肿瘤处释放锰离子和经典抗癌药物DOX, 在小鼠肿瘤模型中展现出了较好的治疗效果[58]。另外, 也有研究者设计了装载光敏剂的MnO2纳米颗粒用于治疗皮肤脓肿。得益于锰离子免疫激活的性质, 当进行光动力学治疗后, 锰离子和释放的细菌抗原强烈地激活了免疫系统, 使得小鼠获得了病原特异性的免疫记忆, 从而能够更好地抵御病原体的再次入侵[59]。综上, 锰离子的应用前景是值得期待的。下面将对锰离子佐剂和锰离子与免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中的联合应用这两个方向进行详述。
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4.1 锰离子佐剂<\/p>

       免疫佐剂被广泛应用于肽段或重组蛋白等类型的疫苗中, 能够增强抗原的免疫原性、针对抗原的免疫应答、抗体的产生和免疫记忆的时程等。良好的佐剂在具备安全性的前提下能够很好地提升疫苗对于机体的免疫保护效果。抗原与佐剂的不同搭配可能产生不同的效果, 因而在选择疫苗的佐剂时, 需要考虑到抗原的物化性质、所诱导免疫反应的类型以及疫苗接种人群和方式等因素。铝佐剂是以氢氧化铝和磷酸铝为主的无机铝盐佐剂的统称。至今为止, 铝佐剂是唯一一种广泛应用于人用疫苗的佐剂[60]。尽管如此, 铝佐剂所具有的一些问题也引发了人们的关注。一方面, 从疫苗的效果方面来看, 铝佐剂的效率较低。铝佐剂只能激活体液免疫反应诱导抗体的产生, 不能激活细胞免疫反应活化细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)[61]。这个性质限制了铝佐剂的应用, 使其不能作为抗病毒及抗肿瘤疫苗的佐剂。另一方面, 从疫苗的使用成本和安全性来看, 在低温环境中铝佐剂的胶体性质会遭到破坏, 反复的冻融会显著降低铝佐剂疫苗的有效性, 其运输和储存的成本较高[62]。铝佐剂相对不稳定性也影响着疫苗的安全性, 可能降低疫苗的效价并损害有效的免疫保护的形成。正因如此, 一些其他佐剂的研发正在积极的临床试验之中。新型的佐剂被人们寄予了更多的期望, 例如: 减少抗原的使用量, 在传染病全球性爆发时让更多的人及时接种, 减缓疾病的进程; 诱导更迅速的免疫反应, 提升暴露于抗原后接种的效果; 对更多亚型的病毒具有免疫保护作用, 提升对于流感在内的高突变率病毒的交叉防护效果; 用于治疗型疫苗中, 例如肿瘤个性化疫苗等。<\/p>

       通常来说, 天然免疫的激动剂具有成为免疫佐剂的潜力。鉴于锰离子是天然免疫的激动剂, 能够诱导细胞产生大量I-IFNs等细胞因子, 我们研制了一种含有稳定胶体性状的纳米锰合物佐剂(MnJ)[43]。进一步的研究表明, MnJ能够在包括蛋白肽段、重组蛋白和灭活病毒在内的疫苗类型中充当佐剂。MnJ普适性的基础在于其多样的免疫激活能力: 最为核心的一点是, MnJ能够强效地激活体液免疫以及细胞免疫反应, 诱导高浓度抗体产生的同时激活T细胞(特别是CTLs), 弥补了铝佐剂不能作为抗病毒和抗肿瘤疫苗佐剂的缺陷; MnJ也能激活黏膜免疫反应并诱导大量分泌型IgA的产生, 因而也用作黏膜免疫的佐剂; 还能够强烈促进树突状细胞(dendritic cell, DC)的成熟, 使得机体对抗原性弱的抗原也能产生抗体。此外, MnJ无毒副作用, 不会诱导系统性的炎症反应, 具有生物安全性。综合考察上述MnJ的性质(图2), 我们认为, MnJ作为免疫佐剂的潜力是巨大的, 会在不久的将来从多个方面造福于人类。<\/p>

\"图片2.gif\"/<\/p>


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图2 纳米锰合物佐剂(MnJ)的特性<\/p>

Fig.2 Properties of MnJ adjuvant<\/p>


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4.2 锰离子与免疫检查点抑制剂联合用于肿瘤治疗(锰免治疗)<\/p>

       在肿瘤的发展过程中, 体内的免疫细胞通常处于被抑制的状态。肿瘤的免疫检查点抑制剂疗法相当于将免疫细胞的刹车(CTLA-4和PD-1等)松开, 使T细胞恢复应有的对癌细胞的杀灭作用。作为国际公认的最有潜力治愈癌症的方法, 肿瘤免疫检查点抑制剂疗法获得了2018年诺贝尔生理学或医学奖。随着近年来的推进, 研究发现这种疗法也存在很大的缺陷, 只能对少数特定类型的肿瘤起到较好的治疗效果(小于20%)。这可能与肿瘤微环境存在着关联。在免疫原性较高的“热肿瘤”中, 免疫检查点抑制剂将肿瘤细胞旁边聚集的大量免疫细胞重新激活, 因而能够显著地发挥疗效; 而对于免疫原性低的“冷肿瘤”, 因为肿瘤微环境中本身就没有或只有较少的免疫细胞, 免疫检查点抑制剂能够发挥的效果十分有限。针对这个缺陷, 许多研究者尝试了不同治疗方法的联用, 例如免疫检查点抑制剂与放疗或病毒联用等[63-64], 在一定程度上提升了对于癌症的治疗效果。同时, 研究表明, cGAS-STING通路参与了机体对于肿瘤细胞的免疫监视过程。肿瘤细胞的DNA激活其旁树突状细胞等抗原递呈细胞, 后者产生大量I-IFNs并将肿瘤抗原呈递给T细胞, 进一步激活了CTLs后实现对肿瘤细胞的杀伤作用。cGAS-STING通路激活剂与免疫检查点抑制剂的联用必将带来更好的治疗效果。因而, 近年来世界各大制药公司的重要目标之一便是寻找cGAS-STING通路的激活剂, 纷纷投入巨资研发[65]。<\/p>

      锰离子是cGAS-STING通路强效的激活剂, 可以被多种细胞通过主动运输进入细胞进行累积。因此, 我们研究了锰离子在抗肿瘤免疫中的潜力。研究发现, 缺锰小鼠对于肿瘤的抵抗能力显著减弱, 说明锰元素在对肿瘤的免疫监视中发挥了重要的作用。同时, 锰离子能够促进树突状细胞的成熟, 进而促进了肿瘤抗原的递呈和CTLs的分化和激活。将锰离子与免疫检查点抑制剂或化疗药物组合使用时, 在多种肿瘤模型中都展现出更好的治疗效果。与锰离子的协同使用还可以减少抗PD-1抗体等昂贵药物的使用量, 而锰离子本身的使用成本极低, 所以锰免治疗可以显著降低肿瘤的医治成本, 造福于个人和国家[66]。综上所述, 我们认为锰离子在肿瘤治疗的作用相当于“踩油门”(图3)。单纯的“松刹车”起到的作用是比较有限的, 若是同时通过“踩油门”, 促进天然免疫系统对肿瘤细胞进行免疫监视, 或者将冷肿瘤转变为热肿瘤, 则可以显著提升肿瘤患者对于治疗的响应率。<\/p>

\"图片3.gif\"/<\/p>


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图3 锰免治疗具有“松刹车”+“踩油门”的双重效果<\/p>

Fig.3 Mn2+<\/sup> + checkpoint inhibitor therapy has dual effects (brake release and accelerator press)<\/p>


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5 展望<\/strong><\/p>

       最近几年关于锰离子作为免疫调节剂的功能研究已经有了相当的积累, 有可能随着其天然免疫活化功能的发现而进入“井喷期”。尽管如此, 对于锰的研究还需要技术方法的进步来获得更长足的进展。由于锰离子和钙离子存在着相当程度的相似性, 现有的钙离子荧光探针和抑制剂很难区分开钙离子和锰离子, 这就使得针对锰离子的功能研究难以进行。利用化学与生物学的交叉, 发展锰离子特异性荧光探针或设计锰离子特异的抑制剂等方法必将助力于对锰离子的研究。同时, 现在已有的锰稳态失调动物模型在锰的功能研究中发挥了重要的作用。更多锰转运蛋白的发现及对应动物模型的构建能够从组织、器官和个体水平更全面地评价锰元素对于免疫的影响。另外, 就现有的关于锰离子在免疫系统中的应用来说, 大多数都还处于理论研究阶段, 要真正应用于临床还需要攻克很多难关。与此同时, 在与之相关的领域中我国还存在一些“卡脖子”的技术: 现阶段高效稳定的铝佐剂和白油佐剂等几乎完全依赖于进口; 治疗癌症的免疫检查点抑制剂单抗药物临床需求很大, 而且相当一部分还依赖于进口。锰离子佐剂和锰免治疗的发展将在一定程度上协助突破这些困境。因此, 我们认为基于锰离子的药物具有很大的临床应用潜力, 其重要价值一定会在未来展现出来。<\/p>

       综上所述, 我们相信锰金属免疫学具有重要的理论及实践价值。目前对于锰的认知是相当不全面的, 现在已知的锰元素的免疫调控功能可能只是冰山一角。锰元素还具有许多被远远低估的价值。相信在多学科交叉运用的帮助下, 锰元素作为免疫调节剂的功能将会逐渐变得清晰而丰富, 进而运用于临床惠及国计民生。<\/p>


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蒋争凡, 北京大学生命科学学院长聘教授、北京大学–清华大学生命科学联合中心高级研究员。1987至1994年在兰州大学生物系先后获得学士及硕士学位, 1997年在北京大学获博士学位, 之后分别赴美国克利夫兰医学中心及Scripps研究所从事博士后研究, 2006年回国进入北京大学任教。<\/p>","cshort2":"

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蒋争凡, 北京大学生命科学学院长聘教授、北京大学–清华大学生命科学联合中心高级研究员。1987至1994年在兰州大学生物系先后获得学士及硕士学位, 1997年在北京大学获博士学位, 之后分别赴美国克利夫兰医学中心及Scripps研究所从事博士后研究, 2006年回国进入北京大学任教。2013年获“谈家桢生命科学创新奖”。蒋争凡教授主要从事天然免疫相关研究,围绕天然免疫活化及调控的分子机制及天然免疫的失调与自身免疫病及肿瘤等方面取得了重要进展: 是世界上同期发现STING蛋白的三个实验室之一(命名为ERIS, 也称为MITA); 发现细胞通过STING-TBK1活化STAT6招募免疫细胞; 发现多种Caspase负调控天然免疫反应; 发现锰元素不仅在抗病毒及抗肿瘤的cGAS-STING通路中发挥“警报素”与“激动剂”的双重功能, 还发现锰离子是一个不依赖于dsDNA的cGAS激动剂, 为锰元素作为免疫调节剂的功能研究打开了一个窗口。<\/p>


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【摘要】 哺乳动物减数分裂后期的精子发生(spermatogenesis), 即精子形成(spermiogenesis), 是一个剧烈的细胞形态变化过程。伴随精子细胞中细胞核压缩和染色质重构, 基因转录活性将逐渐降低直至完全停止, 那些为精子细胞后期阶段发育所需的基因都需要提前转录为信使核糖核酸(mRNA), 然后以翻译抑制状态储存在精子细胞中, 直到特定发育阶段再被激活翻译, 以合成蛋白质发挥作用。这个现象被称为“转录–翻译解偶联”, 是精子发生中基因表达调控的一个典型特征。然而, 目前对于精子细胞中被抑制的mRNA是如何被翻译激活的还知之甚少。我们当前的这项研究发现, MIWI/piRNA通过与翻译起始因子eIF3f、RNA结合蛋白HuR等因子形成功能性翻译激活复合物, 特异性地激活小鼠精子细胞中包含AU序列富含元件(AU-rich element, ARE) mRNA的翻译。此项研究揭示了PIWI/piRNA在精子细胞翻译激活中的新功能, 并证明此功能为精子细胞发育和功能性精子生成所必需。<\/p>

【关键词】 PIWI; MIWI; piRNA; eIF3f; HuR; 翻译激活; 精子形成<\/p>


<\/p>

【Abstract】 Development of post-meiotic male germ cell cells in animals is known as a complex biochemical and morphological process, which is termed as spermiogenesis. Chromatin condensation results in a drastic inhibition of transcriptional activity in late stages of haploid spermatids, and genes that are required for spermiogenesis need to be transcribed in advance and stored as mRNAs in earlier stages of germ cells. However, it remains largely unclear how such repressed mRNAs become activated during spermiogenesis. Here, we unexpectedly discovered that MIWI/piRNA/eIF3f/HuR super-complex is responsible for activating translation of a subset of spermiogenic mRNAs containing cis-acting AU-rich elements. These findings reveal a critical role of the PIWI/piRNA in translation activation, which is functionally required for spermatid development. <\/p>

【Keywords】 PIWI; MIWI; piRNA; eIF3f; HuR; translational activation; spermiogenesis<\/p>


<\/p>

1 相关研究背景介绍<\/strong>
<\/p>

      哺乳动物的精子发生在减数分裂以后即进入剧烈的细胞形态变化期, 此过程被称为精子形成(spermiogenesis), 将伴随顶体和鞭毛形成、细胞核压缩和细胞质丢弃等事件。在小鼠中, 精子形成被划分为16个连续转化步骤, 包括球形精子细胞(round spermatid, 第1~8步)、延长型精子细胞(elongating spermatid, 第9~10步)、长形精子细胞(elongated spermatid, 第12~14步)和精子(spermatozoa, 第15~16步)[1-2]。这些连续转化的发育步骤受到精子细胞中一系列高度特化表达基因的协同调控。在单倍体精子细胞演变为精子的过程中, 伴随精子细胞形态变化和染色质压缩, 细胞核内的基因转录活动将逐渐减少直至完全停止, 那些为精子细胞后期阶段发育所需的基因都需要提前转录为信使核糖核酸(mRNA), 然后以翻译抑制状态储存在精子细胞中, 直到特定发育阶段再被激活翻译, 以合成蛋白质发挥作用[3-4]。这就是精子形成过程中经典的“转录–翻译解偶联”现象, 但如何激活这些被抑制的mRNA从而完成蛋白翻译？这一直是生殖生物学中的一个不解之谜。<\/p>

       piRNA是动物生殖细胞中特异性表达的一类小分子非编码RNA, 通过与生殖细胞特异性表达的PIWI蛋白结合, 可在表观遗传和转录后水平沉默基因组中的转座子等移动性遗传元件, 从而维持生殖细胞基因组的稳定性和完整性; 此外, PIWI/piRNA还可以在转录后水平负调控生殖细胞中蛋白编码基因的表达[5-6]。在研究组前期研究中, 我们发现, 小鼠PIWI(MIWI)/piRNA通过招募脱腺苷酸酶CAF1等因子, 以类似miRNA的机制, 介导小鼠后期精子细胞中大量mRNA的降解和清除[7]。在利用报告基因筛选鉴定piRNA靶基因过程中, 我们意外地发现, 一些靶基因的表达受到对应piRNA的激活, 并证明了piRNA具有激活mRNA翻译的新功能。这种激活功能具有什么生物学意义？MIWI/piRNA是否参与了精子细胞中“转录–翻译解偶联”和翻译激活调控？为回答这些问题, 我们开展了以下研究。<\/p>


<\/p>

2 piRNA通过不完全互补配对的方式并协同MIWI蛋白激活靶mRNA翻译<\/strong>
<\/p>

      <\/strong>我们发现, piRNA可以正调控靶mRNA表达, 却不影响其稳定性, 这表明, piRNA可能是在翻译水平上激活靶mRNA表达。我们首先探究piRNA是否通过碱基配对方式激活靶mRNA翻译。为此, 我们将靶mRNA 3′UTR报告基因中预测的7~8 nt长度piRNA结合位点进行缺失突变。双荧光素酶报告基因分析发现, 突变报告基因不再受到piRNA的激活, 证明piRNA:mRNA碱基配对对此激活作用是必需的。与piRNA具有激活翻译作用一致的是, 蔗糖密度梯度离心实验发现, piRNA可以促进靶mRNA从核糖核蛋白组分向多聚核糖体组分迁移。接着, 我们探索了作为piRNA结合蛋白的MIWI是否参与piRNA介导的翻译激活？MIWI CLIP数据表明, MIWI在靶mRNA的piRNA预测识别位点处存在结合; 当Miwi表达被敲低后, piRNA对靶mRNA表达的促进作用被明显削弱; 而当高表达Miwi时, piRNA对靶mRNA表达的促进作用被显著增强。这些实验结果表明, piRNA可通过不完美配对识别靶mRNA 3′UTR序列, 并协同MIWI蛋白在翻译水平激活靶基因的表达。 <\/p>


<\/p>

3 eIF3f蛋白参与MIWI/piRNA对靶mRNA的翻译激活<\/strong><\/p>

      为进一步探究MIWI/piRNA激活靶mRNA翻译的分子机制, 我们利用酵母双杂交技术及免疫共沉淀实验, 筛选并确认了真核翻译起始因子3f(eukaryotic initiation factor 3f, eIF3f)与MIWI直接相互作用。双荧光素酶报告基因分析发现, eIF3f敲低明显削弱了piRNA对靶mRNA表达的促进作用, 而高表达eIF3f则显著增强了piRNA激活作用。上述实验结果表明, eIF3f蛋白为MIWI/piRNA在翻译水平促进靶基因表达所必需。<\/p>


<\/p>

4 AU-rich元件(AU-rich element, ARE)和ARE结合蛋白HuR为MIWI/piRNA激活靶mRNA翻译所必需<\/strong><\/p>

      我们之前的研究发现, MIWI/piRNA通过招募脱腺苷酸酶CAF1等因子诱导靶mRNA的降解[7], 而当前的研究又发现, MIWI/piRNA通过与翻译起始因子eIF3f结合而激活靶mRNA的翻译。是何种因素决定了MIWI/piRNA对靶mRNA发挥截然相反的两种调控作用？通过对靶mRNA 3′UTR序列分析, 我们发现, 在被piRNA激活翻译的5个靶mRNA的3′UTR序列中都含有AU-rich元件(AU-rich element, ARE)。当去除ARE序列后, piRNA就不再对相应的靶mRNA发挥翻译激活作用了。Grk4是我们早期发现被piRNA负调控的靶基因[7]。非常有趣的是, 我们发现, 将ARE插入Grk4靶基因3′UTR的适当位置, 就能成功地把piRNA的抑制作用转换为激活作用, 再次证明ARE是piRNA激活所需的顺式元件。<\/p>

      接下来, 我们分析了ARE元件结合蛋白—HuR在piRNA激活翻译过程中的作用。作为ELAV/HuR蛋白家族的成员, HuR在各组织中普遍表达。已有研究发现, HuR通过特异性结合mRNA 3′UTR序列中的ARE序列, 在小鼠的精子形成过程中调控靶mRNA从拟染色体向多聚核糖体的迁移, 暗示HuR在精子细胞翻译激活中发挥作用[8-9]。为鉴定HuR在MIWI/piRNA激活靶mRNA翻译中的贡献, 我们首先通过RNA免疫沉淀分析, 发现HuR可以特异性地结合被piRNA激活翻译的5个靶mRNA。进一步, 我们发现, HuR以一种RNA依赖的方式与MIWI和eIF3f相互作用。更为重要的是, 我们发现敲低HuR可导致piRNA激活作用丧失。这些实验结果共同表明, ARE结合蛋白HuR参与了MIWI/piRNA介导的靶基因翻译激活。<\/p>


<\/p>

5 MIWI和HuR在睾丸组织中与多种翻译相关蛋白相互作用<\/strong><\/p>

      为了解MIWI/piRNA是否在体内调控翻译激活及如何激活翻译, 我们通过免疫沉淀结合质谱技术, 分析了睾丸组织裂解液及多聚核糖体组分中的MIWI、HuR复合物。我们发现, MIWI和HuR均可以结合大量翻译起始相关因子。特别是, HuR不仅结合翻译起始因子eIF4G3, 还促进MIWI与poly(A)结合蛋白-PABPC1相互作用。基于这些发现, 我们推测, MIWI/piRNA和eIF3f、HuR等形成功能复合物, 可能通过促进翻译起始阶段mRNA“环(loop)”结构的形成, 激活了靶mRNA翻译。<\/p>


<\/p>

6 piRNA激活功能为精子细胞中的靶mRNA翻译所必需<\/strong><\/p>

      我们接下来鉴定这种新发现的piRNA激活功能是否调控内源靶基因的翻译？我们通过qPCR及Western blot实验, 发现以上验证的piRNA激活靶基因均已在小鼠精母细胞中被转录了, 但仅在单倍体精子细胞才被有效翻译, 提示这些靶基因受控于“转录–翻译解偶联”调控。随后, 我们分别鉴定了MIWI和HuR在这些靶基因表达中的作用。通过shRNA慢病毒睾丸转导技术, 我们敲低了精子细胞的Miwi或HuR表达, 发现受piRNA靶基因调控的mRNA水平没有明显变化, 但蛋白水平明显降低, 表明MIWI和HuR为这些靶基因在精子细胞中的翻译激活所必需。<\/p>

       我们进一步探索了MIWI-eIF3f相互作用在piRNA靶基因翻译中的作用。我们发现, 位于MIWI蛋白N-端的10个氨基酸(111~120 aa)是其与eIF3f相互作用的关键区域, 含有这10个氨基酸的MIWI蛋白N-端短肽MIWI-N2可以有效竞争全长MIWI与eIF3f的相互作用。基于此, 我们通过慢病毒转导技术在小鼠球形精子细胞中外源表达了MIWI-N2短肽, 发现该短肽可显著抑制piRNA靶基因的翻译, 表明MIWI-eIF3f相互作用为piRNA靶基因翻译所必需。这些研究结果共同证明, 我们新发现的piRNA激活功能对piRNA靶基因在精子细胞中的翻译至关重要。<\/p>


<\/p>

7 MIWI/piRNA激活基因为顶体发育所必需<\/strong><\/p>

      为探索该MIWI/piRNA新调控作用在精子形成中的生物学功能, 围绕对顶体组装至关重要的两个靶基因Agfg1和Tbpl1[10-11], 我们鉴定了该调控作用对小鼠精子顶体发育的贡献。我们发现, 从Miwi敲低精子细胞衍生而来的精子, 其顶体发生了严重缺陷; 而在Miwi敲低精子细胞中恢复Agfg1和Tbpl1的表达, 可有效拯救精子的顶体缺陷, 证明MIWI/piRNA介导的翻译激活作用为精子细胞发育过程中的顶体组装所必需。<\/p>

      我们还进一步分析了精子细胞中有多少基因的翻译受到MIWI/piRNA的调控？通过对野生型和Miwi敲除小鼠睾丸组织的核糖体印迹测序和定量蛋白组分析, 我们发现, Miwi敲除后有大量mRNA的翻译效率出现下调。结合MIWI CLIP及含有HuR结合位点的mRNA数据的分析, 发现MIWI/piRNA复合体可能至少直接参与了601靶基因的表达调控。此外, 通过半定量微量细胞质谱技术, 我们发现, 精子细胞中有大量蛋白的表达依赖于MIWI或/和HuR。<\/p>


<\/p>

8 总结及科学意义<\/strong><\/p>

      在本研究中, 我们首先从之前工作意外发现的piRNA激活靶基因表达这一现象入手, 研究并发现piRNA以不完全互补配对的方式识别靶mRNA 3′UTR序列, 并协同MIWI、eIF3f、HuR等蛋白, 在翻译水平激活靶基因的表达。随后, 通过一系列体内体外实验, 我们发现, MIWI/piRNA/eIF3f/HuR可调控精子细胞中大量mRNA的翻译, 并证明该机制为小鼠精子形成中的顶体组装所必需。该研究工作发现, MIWI/piRNA介导精子细胞中翻译激活, 不仅为解析精子形成过程中“转录–翻译解偶联”这个重要生物学问题提供了新线索, 还将有助于揭示精子形成障碍的致病机理, 并可为相关男性不育症的临床诊断治疗提供理论依据和方法技术。<\/p>


<\/p>

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刘默芳, 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所研究组长(PI)、研究员、国家杰出青年科学基金获得者(2013年)、上海市优秀学术带头人(2016年)、科技部国家重点研发计划项目首席科学家(2017年)、入选“国家百千万人才工程”(2017年)和国家“万人计划”科技创新领军人才(2018年)等。刘默芳研究员主要从事非编码RNA功能机制研究, 围绕piRNA与精子发生、miRNA与癌症等开展系统性探索, 获得了前沿性进展, 已发表论文50多篇, 包括以通讯/共通讯作者在国际顶级学术期刊Cell及子刊等发表论文20多篇。这些原创性研究成果揭示了小分子非编码RNA的生理和病理功能机制, 可为男性不育症及肿瘤等疾病的诊治研究提供理论依据和相关基础。<\/p>","cshort2":"

哺乳动物减数分裂后期的精子发生(spermatogenesis), 即精子形成(spermiogenesis), 是一\r\n个剧烈的细胞形态变化过程。伴随精子细胞中细胞核压缩和染色质重构, 基因转录活性将逐渐降低\r\n直至完全停止, 那些为精子细胞后期阶段发育所需的基因都需要提前转录为信使核糖核酸(mRNA), 然后\r\n以翻译抑制状态储存在精子细胞中, 直到特定发育阶段再被激活翻译, 以合成蛋白质发挥作用。这个\r\n现象被称为“转录–翻译解偶联”, 是精子发生中基因表达调控的一个典型特征。然而, 目前对于精子\r\n细胞中被抑制的mRNA是如何被翻译激活的还知之甚少。我们当前的这项研究发现, MIWI/piRNA通\r\n过与翻译起始因子eIF3f、RNA结合蛋白HuR等因子形成功能性翻译激活复合物, 特异性地激活小鼠精\r\n子细胞中包含AU序列富含元件(AU-rich element, ARE) mRNA的翻译。此项研究揭示了PIWI/piRNA在\r\n精子细胞翻译激活中的新功能, 并证明此功能为精子细胞发育和功能性精子生成所必需。<\/p>","ctitle":"MIWI/piRNA激活小鼠精子细胞mRNA翻译的新功能机制研究","listseq":63,"seqno":"63","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-11-24-14-01-27-776"},{"caddress1":"(1<\/sup>中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学国家重点实验室, 上海 200031; 2<\/sup>中国科学院广州生物医药与健康研究院/广州再生医学与健康广东省实验室, 广州 510530; 3<\/sup>中国科学院广州生物医药与健康研究院细胞谱系和图谱中心, 广州 510530)","cauthor":"崔桂忠1<\/sup> 彭广敦2，3<\/sup> 景乃禾1<\/sup>*","cintpic":"","clicktime":1703,"clong1":"

【摘要】  从受精卵发育成具有不同细胞类型个体的过程中, 细胞命运受到多个层次的调控。\r\n在哺乳动物的早期胚胎发育过程中, 原肠运动是外、中、内三个胚层的建立过程, 为后续的器官发\r\n生和形态建成提供了发育蓝图。然而目前对于三胚层命运建立的分子机制认识并不清晰。该文通\r\n过对小鼠早期胚胎的时空转录组分析, 从分子层面揭示了外、中、内三胚层谱系发生的整个过程。 <\/p>

【关键词】  细胞谱系; 原肠运动; 时空转录组<\/p>


<\/p>

【Abstract】  Cell fate specification in the development of zygote into embryo proper is regulated at multiple\r\nlevels. During the early embryonic development of mammals, formation of the three primary germ layers, ectoderm, mesoderm, and endoderm, as the results of gastrulation, provides a blueprint for morphogenesis and organogenesis. However, a comprehensive genome-wide molecular annotation of the mechanisms that determine the tissue\r\narchitecture and lineage specification of the three germ layers has not been clarified. We show that the entire process\r\nof the specification of the ectoderm, mesoderm and endoderm lineages is revealed by analyzing the spatiotemporal\r\ntranscriptomes of mouse early embryos. <\/p>

【Keywords】  cell lineage; gastrulation; spatiotemporal transcriptome
<\/p>


<\/p>

      生命起始于单个细胞的受精卵, 经过胚胎发\r\n育形成包含多种细胞类型、多个组织器官的个体。\r\n人们利用秀丽隐杆线虫(Nematode Caenorhabditis\r\nelegans)研究了细胞谱系和细胞命运决定[1]; 利用\r\n果蝇(Drosophila)第一次鉴定了基因组上的编码区\r\n(coding sequence), 并进一步发现了基因簇[2]。哺乳\r\n动物的胚胎发育更为复杂, 小鼠是人们常用的模式\r\n生物, 其早期胚层分化与细胞谱系建立的过程对认\r\n识高等动物细胞命运的决定具有重要意义。<\/p>

1 小鼠早期胚胎发育过程<\/strong><\/p>

      小鼠早期胚胎发育和模式建成是一个复杂而\r\n有序的生物学过程。在小鼠早期胚胎发生过程中,\r\n基因表达的时空调控影响细胞谱系分化、胚胎极\r\n性、细胞和组织的形态运动、组织发育蓝图的建立\r\n等多个过程[3]。受精后, 经合子卵裂形成桑椹胚。随\r\n后, 在胚胎时期3.5天(E3.5), 胚胎经历第一次命运决\r\n定, 形成外部的滋养层细胞(trophectoderm, TE)和内\r\n细胞团(inner cell mass, ICM)[4-5]、囊胚(blastocyst)形\r\n成。当胚胎发育到E4.5时, 囊胚由输卵管进入子宫\r\n发生着床, 细胞发生第二次命运决定, 内细胞团分别\r\n分化为原始内胚层(primitive endoderm, PrE)和上胚\r\n层(epiblast, Epi)。原始内胚层将发育成内脏内胚层\r\n(visceral endoderm, VE)和脏壁内胚层(parietal endoderm, PE)[3](图1)[6]。<\/p>

       在胚胎发育到E5.5时, 没有极性的上胚层细胞\r\n排列为整齐的单层柱状上皮, 即晚期上胚层(late epiblast), 并形成卵筒状的结构(egg cylinder)。在胚胎底\r\n端(distal tip), 内脏内胚层细胞发生命运特化, 其细胞\r\n形态结构与其他位置的内脏内胚层细胞不同, 被称\r\n为远端内脏内胚层(distal visceral endoderm, DVE)。\r\n随后DVE向胚胎一侧移动, 该侧将来发育成为胚胎\r\n的前端(anterior), 这群内脏内胚层细胞被称为前端\r\n内脏内胚层(anterior visceral endoderm, AVE)[7](图1)。AVE是胚胎模式建成的重要信号来源, 可以拮抗后\r\n端Wnt和Nodal信号, 对胚胎前后轴(anterior-posterior\r\naxis, A-P)的形成至关重要[3]。<\/p>

\"image.png\"/<\/p>

受精卵经过卵裂, 进行第一次命运决定, 形成滋养外胚层(trophectoderm, TE, 灰色)和内细胞团(inner cell mass, ICM, 米色)。在E4.5时, 胚胎着床,内细胞团分化成原始内胚层(primitive endoderm, PrE, 紫色)和上胚层(epiblast, Epi,红色)。在E5.5时, 胚胎成卵桶状, PrE细胞进一步分化成脏壁内胚层(parietal endoderm, PE, 深蓝色)和内脏内胚层(visceral endoderm, VE, 蓝色)。在E5.5~E6.0时, 底端的内脏内胚层向胚胎一侧移动, 移动到胚胎和胚外交界的位置, 形成AVE, 进而建立前后轴。在E6.5时, 原肠运动起始于胚胎后端的原条(primitive streak, PS, 黄色), 发生上皮‒间充质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。新生中胚层从后端向胚胎前端迁移, 形成位于外胚层和内胚层中间的新生的中胚层。有一些从原条迁移出来的细胞经过间充质‒上皮转换(epithelial-mesenchymal transition, MET)变成定型内胚层(definitive endoderm, DE, 淡紫色)。DE细胞和部分VE细胞共同构成肠内胚层(Gut endoderm)。<\/span><\/p>

The blastula-stage embryo is formed of two cell populations: trophectoderm (TE, in grey) and inner cell mass (ICM, in beige). Once the embryo implants(E4.5), the ICM differentiates and segregates into primitive endoderm (PrE, in purple) and epiblast (Epi, in red). At E5.5, the embryo shape iscylindrical, and the PrE gives rise to the parietal endoderm (PE, in dark blue) and the visceral endoderm (VE, in blue). VE cells in the distal part of theembryo form the anterior visceral endoderm (AVE), which migrates between E5.5 and E6.0 to one side of the embryonic-extraembryonic border, thereby defining the anterior–posterior axis. At E6.5, gastrulation occurs at the posterior side of the embryo in the primitive streak (PS, in yellow), through an epithelial-mesenchymal transition (EMT). Nascent mesoderm cells move from posterior to anterior, creating a new cell layer between ectoderm and endoderm.Some of the cells that have delaminated through the primitive streak become definitive endoderm (DE, light purple) by mesenchymal-epithelialtransition (MET). Definitive endoderm and some of derivatives of visceral endoderm will contribute to gut endoderm.<\/span><\/p>

图1 小鼠早期胚胎发育(受精卵到原肠胚的形成)示意图(根据参考文献[6]修改)<\/p>

Fig.1 Mouse early embryo development from zygote to gastrulation (modified from reference [6])<\/p>


<\/p>

        随后, 胚胎经历原肠运动过程。著名发育生物学家Lewis Wolpert曾说: “人生最重要的阶段不是出生和结婚, 甚至不是死亡, 而是原肠运动。”小鼠原肠运动过程是外、中、内三个胚层的形成过程[8], 伴随着剧烈的细胞增殖和细胞迁移, 由此形成的不同胚层成为形态功能各异组织器官的发育基础[3,9-10]。因此, 原肠运动是决定各个胚层形成以及细胞命运图谱最为关键的一个生物学过程[8]。小鼠原肠运动起始的标志, 是在E6.5时期胚胎后部出现原条(primitivestreak, PS)[11]。在原条位置, 上胚层细胞发生上皮‒间充质转换过程(epithelial-mesenchymal transition,EMT)成为间充质细胞, 突破基底膜, 迁移嵌入内脏内胚层和上胚层之间的空隙。这群间充质细胞从胚胎后端向前端迁移, 进而包裹整个胚胎, 形成新生的中胚层(mesoderm, M)和内胚层(endoderm, En)[3], 而留在原来上胚层位置的细胞将发育成外胚层(ectoderm,Ect)(图1)。经过原肠运动, 小鼠胚胎从E6.5时期上胚层的大约660个细胞, 发育到E7.5时期三胚层的16 000多个细胞。细胞通过缩短G1和G2期, 将细胞周期缩短至5小时左右[12] 。E7.5天原肠运动完成,胚胎由单一未分化的上胚层转变成具有复杂细胞组成、形态各异的外、中、内三个胚层。随后胚胎经历器官发生阶段, 外胚层将发育成机体的神经、皮肤等器官, 中胚层将发育成心脏、肌肉和骨骼等器官, 而内胚层将发育成肠、肝、肺和胰腺等器官。因此, 外、中、内三胚层的形成过程对于胚胎模式的建成十分重要。    <\/p>

        然而关于小鼠早期胚胎发育, 特别是原肠运动时期的胚层谱系分化及细胞命运决定的分子机制尚不清晰。例如, 关于内胚层的谱系发生过程还存在诸多争议。内脏内胚层包裹胚外外胚层部分被称为胚外内脏内胚层(extraembryonic visceral endoderm,exVE), 包裹上胚层部分被称为胚胎内脏内胚层(embryonic visceral endoderm, emVE), 这两个细胞群体共同组成卵黄囊内胚层。ZORN和WELLS总结大量研究认为, 内胚层和中胚层来自中内胚层的共同前体细胞—中内胚层(mesendoderm)[13]。在原肠运动过程中, 中内胚层前体细胞最早从原条迁移出来, 并伴随中胚层迁移到胚胎前端和两侧,之后发生间充质–上皮转化(mesenchymal-epithelial transition, MET)替换掉内脏内胚层细胞, 发育成定型内胚层(definitive endoderm, DE), 定型内胚层再进一步发育为甲状腺、胸腺、肺、肝、胆、胰腺和肠胃等内脏器官。这些传统观点认为, 原始内胚层衍生的内脏内胚层和脏壁内胚层将发育为胚外组织, 不参与胚胎组织的构成。但近年来通过谱系示踪技术发现, 上胚层来源的细胞并不是完全替换掉原来的内脏内胚层细胞, 而是嵌入到内脏内胚层中[14-15]。这个嵌入过程发生在单个细胞的水平, 最终在内胚层里形成定型内胚层和内脏内胚层组成的马赛克模式, 并且这些内脏内胚层细胞可以参与肠道内胚层的构成。进一步研究发现, 伴随原肠运动的发生, emVE 中Hnf4a 、ApoC2 、Transthyretin和Alphafetoprotein等的表达逐渐下调[16-17], 逐渐失去内脏内胚层细胞的经典形态学特征, 如立方形的细胞形态等。这启示, 胚胎部分的emVE在DE大规模嵌入前就已经失去了exVE的特征。在DE完成嵌入后, emVE和DE细胞都可以参与肠道内胚层(gutendoderm)的产生[18]。<\/p>

        随着单细胞转录组测序技术(single cell RNAseq,scRNA-seq)的发展, 在过去的几年里, scRNAseq被应用鉴定新的细胞类型、研究发育变化的动态过程、探索基因调控机制以及揭示等位基因随机表达情况等[19]。例如, 以爪蟾为模式生物[20], 研究者在不同聚类得到的细胞群体中, 根据时间信息来设置“ancestor voting”, 进而绘制细胞随时间变化的命运图谱, 发现许多细胞命运比之前认为的决定更早, 内胚层与中胚层、外胚层共同从囊胚阶段之后就发生了命运特化。PIJUAN-SALA等[21]使用10×genomics对E6.5至E8.5天的小鼠胚胎进行测序分析,获得了大量胚胎单细胞转录组, 他们分析发现, 内脏内胚层细胞主要参与后肠的形成。CHAN等[22]结合基因编辑技术进行谱系示踪, 揭示了原肠运动期间的谱系转换, 证实内胚层具有两重起源, 分别来自胚外部分和胚胎部分。SONJA等[23]对小鼠E3.5到E8.75时期的所有内胚层细胞经过单细胞转录分析后发现, 在新生肠道内胚层中胚胎来源的和胚外来源的内胚层在空间分布上具有特定的模式, 但整体上相似, 只是保留了其发育来源的一些特征; 并且他们认为, 只有少部分内脏内胚层细胞参与胚胎内胚层的构成[24]。使用索引多重组合策略, CAO等[25]分析了2 000 000个E9.5至E13.5小鼠胚胎单细胞转录组, 结合Monocle 3鉴定了数百种细胞类型和56条细胞谱系发生轨迹。虽然单细胞转录组分析可以重建胚胎细胞的发育轨迹, 但缺乏真实的空间信息,无法将胚胎发育过程中的时间和空间信息联合分析, 而细胞在早期胚胎中的空间位置对其发育分化命运又是至关重要的。<\/p>

2 时空转录组揭示三胚层谱系发生过程<\/strong>  <\/p>

        通过细胞标记移植和谱系追踪等经典方法, 已经建立了粗略的小鼠原肠运动期间胚胎发育的细胞命运图谱[5,26-29]。这些研究发现, 各胚层的前体细胞在原肠胚形成之前的上胚层中具有空间区域化的特征[10,30-31]。此外, 各种组织类型的前体细胞有序分布在特定命运的胚胎区域。沿原条近端‒远端(proximal-distal, P-D)分布的不同位置上胚层细胞随着时间的迁移, 获得不同的细胞命运。根据在原条的不同位置, 中胚层细胞迁移分为两种不同方式: 向近端迁移, 形成胚外中胚层[32]; 向侧面和前端迁移,介于外胚层和内脏内胚层之间, 形成胚胎中胚层[27]。在前端的外胚层细胞也严格按照头尾(craniocaudal)次序, 为神经外胚层及前脑、中脑、后脑的模式建成奠定基础。值得注意的是, 在所有相同发育阶段的脊椎动物胚胎中, 谱系前体细胞具有非常一致的、特定的分布顺序[10-11,33]。因此, 细胞的位置信息对细胞命运调控机制和细胞谱系发生过程的研究十分重要。<\/p>

        早期人们通过全胚胎原位杂交的方式获得特定基因的空间表达信息, 但这种方法通量低, 实验难度大, 难以得到广泛应用。SATIJA等[34]基于已知的原位杂交结果, 并结合单细胞转录组, 开发了Seurat方法, 该算法通过比较每个转录组中表达的基因与从RNA原位杂交获得的几个标志性基因的空间表达模式来推断单细胞转录组的空间位置。但由于具有位置信息的参考坐标基因数量有限, 并且单细胞中表达这些位置参考基因时出现一部分基因表达缺失, 则使得空间定位的成功率大大下降。<\/p>

        我们这些年一直关注空间位置特征对多能干细胞的命运决定关系, 建立了Geo-seq技术, 可以获取到具有空间位置信息的少量细胞转录组[35]。利用这一技术, 我们首先对原肠运动中期—E7.0时期小鼠胚胎的上胚层细胞进行空间转录组构建[36]。我们发现, 此时的小鼠胚胎可以划分为四个空间表达结构域: 胚胎的前、后区域是最显著的两个独立结构域, 也是细胞增殖最为剧烈的结构域, 分别代表了外胚层以及中内胚层的分化命运; 在胚胎的侧面, 根据增殖、代谢等细胞活动差别, 分为近端和远端两个结构域, 反映了胚胎在这个时期能量代谢状态上的独特特征。同时, 我们获得了一套完善的空间位置参考坐标系, 能够将相应发育时期的单细胞回归到胚胎体内的不同位置, 我们称之为Zipcode mapping[36]。运用这个算法, 可以准确将单细胞回归到胚胎的大致区域, 这对单细胞空间分析技术是一个重要的发展。<\/p>

        我们进一步将单个时间点的空间转录组扩展到了小鼠早期胚胎发育的多个时期(E5.5、E6.0、E6.5、E7.0和E7.5), 涵盖胚胎着床后早期到原肠运动晚期, 并包含外、中、内三个胚层所有的细胞谱系, 建立起百科全书式全基因组的时空表达谱数据库(http://egastrulation.sibcb.ac.cn/)[37]。该数据库具有超过20 000个基因的三维分子表达图谱, 一次性揭示了该时期内所有基因的空间动态表达特征。同时,许多新的胚层特异性基因和新的长链非编码RNA被发现和鉴定, 使得小鼠早期胚胎发育中细胞谱系建立的分子调控得到了深入的解析。总之, 此数据库实现了小鼠早期胚胎所有表达基因高分辨率的数字化原位杂交图谱, 具有查询和分析基因的三维表达模式、共表达关系以及根据特征表达模式检索基因等功能, 是目前国际上关于着床后小鼠胚胎最全面、最完整的交互性时空转录组数据库, 为研究细胞微环境对其命运决定提供了翔实的数据, 进而更精细地揭示细胞谱系发生的时空调控机制。<\/p>

        单细胞转录组分析方法SCENIC[38]不是基于单个基因的表达情况, 而是基于多个基因的共表达模块和顺式调节基序推断得到的基因调节网络活性。与基于差异基因表达的分析方法相比, 可以有效避免潜在的批次效应(batch effect), 其得到的结果更加稳健, 并更具有生物学意义。在多时空的胚层发育谱系研究中, 我们利用SCENIC方法, 结合小鼠着床前胚胎的转录组数据, 将发育过程中最重要的时间和空间信息联合分析, 从分子层面构建了小鼠早期胚胎发育过程的系统发生树[37]。我们发现,E2.5~E7.5的Geo-seq样本可分为五组, 分别代表早期胚胎发育过程中的主要细胞谱系, 包括着床前胚胎细胞、上胚层、外胚层、中胚层和内胚层。分析结果显示, 内胚层与上胚层、外胚层和中胚层分离,形成独立的聚类。这表明, 内胚层谱系的发生过程与传统观点认为的内胚层主要来源于中内胚层前体细胞不同, 其谱系分化过程相对独立。同时系统发生树显示, 内胚层类群与着床前胚胎细胞具有更紧密的联系, 暗示内胚层谱系的命运决定过程比之前认为的要早, 而这一发现与一些生物进化研究的结果吻合[39-41]。多细胞生物的胚胎发育过程, 与单细胞生物到多细胞生物的进化历程十分类似。在三个胚层中, 中胚层只在两侧对称的生物中出现, 因此也被认为是在进化中最后形成的胚层[40]。同时有人通过研究线虫在发育过程中时间和空间的基因表达构成, 推断内胚层是最早形成的胚层[39]。他们认为, 在多细胞生物形成过程中, 单细胞生物通过聚集, 形成管状结构来增强对食物的消化能力。这与目前外、中、内三个胚层衍生来的器官功能相符, 即内胚层衍生成消化道及其腺体。我们的研究从“发育‒进化”紧密相连的理论角度, 为内胚层谱系命运提前特化提供了证据。<\/p>

        通过寻找每个时期不同位置的差异表达基因,我们鉴定了不同发育阶段胚胎的空间表达结构域(图2)。我们发现E5.5主要分为两个空间表达结构域, 分别为上胚层和内脏内胚层, 表明此时主要的表达差异是由不同组织类型造成, 而在上胚层或内脏内胚层中不同细胞的基因表达基本一致。内脏内胚层在E6.0时期出现P-D的差异, 此时整个胚胎分为三个空间表达结构域, 分别为上胚层、近端内脏内胚层和远端内脏内胚层。有趣的是, 内胚层在P-D的空间表达差异一直伴随整个原肠运动过程, 在E7.5时期内胚层沿P-D分为三个空间表达结构域(E1、E2和E3)。原肠运动从E6.5起始, 此时原条在形态结构上并不清晰, 但在基因表达上已经形成区别于上胚层的独立表达结构域。中胚层从E7.0时期开始出现,并形成独立的空间表达结构域; 而中胚层在E7.5时期出现A-P差异, 形成前端中胚层(anterior mesoderm,MA)和后端中胚层(posterior mesoderm, MP)两个空间表达结构域。<\/p>

\"image.png\"/<\/p>

MOR: 桑椹胚; ICM: 内细胞团; Epi: 上胚层; PrE: 原始内胚层; En: 内胚层; E1~3: 内胚层基因表达结构域1~3; Ect1~3: 外胚层; PS: 原条; M: 中胚层; MA: 前端中胚层; MP: 后端中胚层。<\/span><\/p>

MOR: morula; ICM: inner cell mass; Epi: epiblast; PrE: primitive endoderm; En: endoderm; E1-3: endoderm gene expression domain 1-3; Ect1-3: ectoderm1-3; PS: primitive streak; M: mesoderm; MA: anterior mesoderm; MP: posterior mesoderm.<\/span><\/p>

图2 早期胚胎发育时期的空间结构域及其相关性(根据参考文献[37]修改)<\/p>

Fig.2 The spatial domain of cell populations and the connection of spatial domains based on the correlation of<\/p>

averaged regulon activities across early developmental stages (modified from reference [37])<\/p>

        通过分析相邻发育阶段胚胎空间结构域的相关性以及调控关系, 我们发现, 中胚层和外胚层的谱系发生过程紧密相关。在转录调控层面, 中胚层的调控网络与原条的调控网络相近, 并与外胚层共同来源于早期的上胚层。而内胚层谱系的发生与中胚层和外胚层谱系的发生有较大差异, 形成鲜明的相对独立的发生过程。E7.5时期的多数内胚层细胞(E2和E3区域的细胞)与原始内胚层具有紧密关系, 表明内胚层谱系的细胞命运较早特化。这一发现首次从分子层面提示, 除了之前研究认为的内胚层来源于中内胚层前体细胞外, 内胚层的另一个更重要的可能来源是早期的内脏内胚层细胞。我们的研究还发现, 只有少部分E1区域的内胚层细胞与E7.0的中胚层具有发育上的相关性, 共享很多相同的调控网络,这提示, E7.0时期部分中胚层细胞发生向内胚层命运转变或可能存在中内胚层前体细胞[37]。进一步,结合我们E7.0时期的内胚层单细胞分析发现, E7.0时期的内胚层也分为三个类群, 其中一个类群表达原条特异基因T和Mixl1等, 因此, 这些研究结果提示, 在哺乳动物胚胎发育中充满争议的“中内胚层前体”可能是存在的。此外, 我们还发现, 部分外胚层和中胚层具有共同的前体细胞。在系统发生树和降维分析中都可以发现, 部分外胚层和中胚层具有紧密联系; 在转录因子调控网络中也发现, E7.5中的侧面后端Ect3与MP共同来源于E7.0时期的PS。这暗示,外胚层中胚层前体细胞存在的可能, 也为后续鉴定中内胚层前体细胞和多能干细胞向中胚层、内胚层器官分化提供了新的思路。<\/p>

        进一步, 我们通过信号通路富集分析发现, 在早期内胚层表达的转录调控网络G3存在Hippp/Yap信号的特异性激活。功能实验也证实, 在内脏内胚层中加入Yap抑制剂后, 对于内胚层早期发生过程重要的G3调控网络出现显著下调, 提示Hippp/Yap信号在早期内胚层发育过程中具有重要作用。同时, 我们也找到了许多在胚层谱系发生过程中关键的转录因子, 并系统全面地绘制了早期胚胎发育过程中, 谱系 建立的关键信号调控网络图谱。这为理解体内细胞命运调控机制和体外建立应用模型等提供了新的思路。<\/p>

        总而言之, 我们的研究首次构建了小鼠三个胚层谱系发生过程中的高分辨率时空转录组图谱, 揭示了多能干细胞的分子谱系和多能性在时间和空间上的动态变化及其调控网络。首次从分子层面揭示了内胚层谱系发生的新来源, 提出外胚层和中胚层具有共同前体的新观点, 建立了小鼠早期胚胎三胚层细胞谱系分化的新理论; 并阐释了Hippo/Yap信号通路在早期胚胎发育期间参与内胚层发育的新功能。这项工作为理解胚层谱系建立及多能干细胞的命运调控机制, 提供了翔实的数据和崭新的思路, 是对经典发育生物学层级谱系理论的重大修正和补充, 有望大大推动早期胚胎发育和干细胞再生医学相关领域的发展。<\/p>

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景乃禾, 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所研究员, 研究组长。1982年毕业于南京大学化学系, 1988年在中科院上海生物化学研究所获博士学位, 1989年赴日本理化学研究所从事博士后研究。1991年回国任中科院上海生化所研究组长、副研究员, 1995年晋升为研究员、博士生导师。曾任生物化学与细胞生物学研究所常务副所长、细胞生物学国家重点实验室副主任、中国生物化学与分子生物学学会副理事长兼秘书长。还担任Journal of Biological Chemistry<\/em>(2009—2014年)、Cell Research<\/em>、IUBMB Life<\/em> (2010—2013年)、Mechanism of Development<\/em>、Acta Biochimica Biophysica Sinica<\/em>、Neuroscience Bulletin<\/em>编委, BMC Developmental Biology<\/em>和J Mol Cell Biol<\/em>副主编等。<\/p>","cshort2":"
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景乃禾, 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所研究员, 研究组长。1982年毕业于南京大学化学系, 1988年在中科院上海生物化学研究所获博士学位, 1989年赴日本理化学研究所从事博士后研究。1991年回国任中科院上海生化所研究组长、副研究员, 1995年晋升为研究员、博士生导师。曾任生物化学与细胞生物学研究所常务副所长、细胞生物学国家重点实验室副主任、中国生物化学与分子生物学学会副理事长兼秘书长。还担任Journal of Biological Chemistry <\/em>(2009—2014年)、Cell Research<\/em>、IUBMB Life<\/em> (2010—2013年)、Mechanism of Development<\/em>、Acta Biochimica Biophysica Sinica<\/em>、Neuroscience Bulletin<\/em>编委, BMC Developmental Biology<\/em>和J Mol Cell Biol<\/em>副主编等。<\/p>


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<\/p>","ctitle":"高精度时空转录组揭示小鼠早期胚胎三胚层细胞谱系发生过程","listseq":60,"seqno":"60","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-11-02-22-932"},{"caddress1":"中科院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室/国家蛋白质科学中心（上海）","cauthor":"施小山，许琛琦","cintpic":"","clicktime":133,"clong1":"

众所周知，脂质同蛋白质及核酸一样是生命体必须的组分之一，由其组成的细胞质膜不仅保证着细胞的完整性，同时也调控着许多生理过程1。伴随着生命科学研究技术的发展，关于脂质调控蛋白质功能的工作越来越多地被报道出来2, 3。总体来说，脂质同蛋白质的相互作用可分成特异性及非特异性相互作用两种形式，二者分别对各类信号事件进行精细的调控。作为脂质-蛋白质非特异性相互作用的主要体现形式，二者的静电相互作用（富含碱性残基的蛋白质与酸性磷脂之间的静电相互作用）被发现广泛存在于膜蛋白受体、离子通道、粘附分子及许多其他蛋白同脂质的相互作用中，它们控制着受体的活化、离子通道的开关、细胞的粘附及其他生命过程4-7。然而，关于这种静电相互作用的解除机制迄今却仍未被揭示。最近，我们针对T细胞抗原受体（TCR）的研究发现：TCR胞内区的酪氨酸磷酸化受细胞质膜中的酸性磷脂调控。在TCR未识别抗原前，其酪氨酸信号模体（ITAM）与酸性磷脂结合从而插入到膜脂双层中，处于被“屏蔽”的状态4。而在T细胞被抗原活化后，我们发现TCR周围的钙离子浓度迅速上升，这些二价阳离子可以通过静电相互作用与酸性磷脂结合，从而打破ITAM与脂质之间的静电相互作用，帮助ITAM磷酸化，并最终扩大T细胞受体的激活信号，提高T细胞对抗原的敏感性8。

　　T细胞抗原受体是T淋巴细胞（简称T细胞）识别抗原并最终发挥其适应性免疫功能的基础，它是由配体识别亚基TCRαβ及信号亚基CD3εγ、εδ与ζζ共同组成的一个四亚基复合物9。TCRαβ通过基因重排的方式，利用有限的DNA序列转录并翻译成庞大的TCR受体库，从而识别机体和环境中各式各样的抗原10。而另一方面，保守的信号亚基（包括一条CD3γ链、一条CD3δ链、两条CD3ε链及两条CD3ζ链）则通过特定的免疫受体酪氨酸激活模体（ITAM）来行使其传递信号的功能9。更为有趣的是，不同CD3链带有的ITAM个数并不是完全一致。CD3γ、CD3δ及CD3ε链的胞内段各带有一个ITAM，而CD3ζ链的胞内段则带有三个ITAM。一个TCR中共有十个ITAM，可以组成多种多样的磷酸化组合，进而适应不同程度的刺激信号，传导不同程度的活化信号11。

　　迄今关于TCR的胞内信号通路已经得到了比较广泛的研究9。当TCRαβ识别抗原递呈细胞表面的主要组织相容性抗原分子MHC所递呈的多肽抗原（peptide-MHC复合物，简称pMHC）后，信号亚基CD3上的ITAM将被激酶Lck或Fyn磷酸化，而这种ITAM磷酸化将启动一系列的信号级联放大反应，最终调控T细胞的增殖、分化及杀伤等功能。这样一系列传统的信号级联放大反应可能有助于解释T细胞可以识别甚至单个抗原而发挥功能的超敏感性12, 13。值得一提的是，在这一系列的信号级联放大反应中，第二信使浓度的上升（比如IP3、DAG及Ca2+）起着至关重要的作用9。

　　同胞内信号转导过程的详尽研究不同，TCR的跨膜信号转导过程由于研究难度更大一直是困扰科学家们的大问题。换言之，TCRαβ在接受pMHC的刺激后，如何引起CD3胞内段ITAM的磷酸化一直是不甚清楚的过程。同所有的磷酸化过程一样，CD3胞内段ITAM磷酸化水平会被激酶（如Lck及Fyn）及磷酸水解酶（如CD45、SHP1及SHP2）调控14, 15。目前TCR的活化机制主要有三种假说：受体聚集、结构形变以及磷酸酶排挤模型16, 17。而所有的模型最终都通过改变TCR磷酸化平衡来启动TCR活化过程。在受体聚集假说中，pMHC的刺激会诱导TCR和共受体（CD4与CD8）产生聚集现象。共受体的胞外段可以同pMHC结合，而胞内段可以与Lck相互作用。这就使得pMHC结合TCR时，它还通过共受体把Lck招募到了TCR周围，从而增加ITAM磷酸化的可能性。另一方面，pMHC与TCR的结合会诱导TCR分子形成聚集体，这种聚集体有利于Lck分子克服空间位阻效应将TCR彻底磷酸化。在结构形变假说中，pMHC的刺激会引起TCR分子产生结构形变。初步的结构生物学研究表明，这些结构形变存在于胞外区和胞内区，可能帮助TCR分子形成聚集体及下游信号分子的招募从而促进TCR的活化。在磷酸酶排挤假说中，pMHC的刺激在引起受体聚集的同时会排挤磷酸水解酶CD45。CD45是广泛存在于淋巴系细胞中的去磷酸化水解酶，它有着体积庞大的胞外段。当pMHC与TCR结合时，抗原递呈细胞及T细胞之间的间隙将无法容纳庞大的CD45，从而把它排挤出去进而降低ITAM去磷酸化的可能性。这三种基于蛋白质-蛋白质相互作用模型揭示了TCR活化是被一个多层面的复杂机制所调控的，然而仍然留下一些难以解释的问题。比如，最新研究表明在静息T淋巴细胞中活化型的Lck就已经大量存在18，那么T细胞是否需要浪费能量来维系低水平的TCR磷酸化？另外，在生理条件下抗原递呈细胞表面递呈激动性多肽的MHC密度是很低的，那么被如此少量的pMHC激活的TCR是否足够激活整个T细胞的免疫反应呢？

　　带着这样的问题，我们尝试从另外一个角度来研究TCR活化的过程，并提出如下科学问题：作为一个庞大的细胞质膜表面受体，TCR的活化是如何受细胞质膜环境调控的呢？2008年，我们利用生物化学及生物物理学技术手段发现，富含碱性残基的信号亚基CD3ε胞内段，在静息T淋巴细胞内可以同细胞质膜内层的酸性磷脂相互作用，进而使得ITAM中的关键酪氨酸残基侧链插入并被屏蔽在细胞膜的疏水核心，从而防止其被Lck自动磷酸化4。这一结果很好地呼应了前人关于CD3ζ胞内段同质膜相互作用的生化分析研究19，并共同为TCR的活化机制研究提供了新的思路。正是通过质膜的保护，静息T淋巴细胞不需要浪费额外的能量来维持低水平的ITAM磷酸化。

　　那么在TCR同pMHC结合之后，是什么导致被细胞质膜内层酸性磷脂保护的酪氨酸从质膜疏水核心暴露出来呢？这个问题就成为解决TCR活化机制的关键问题，因为少量pMHC激活的TCR可能通过解除质膜的保护来激活其余的TCR进而扩大TCR活化信号。如前所述，细胞质膜内层酸性磷脂是通过静电相互作用进而保护CD3中的关键酪氨酸残基的，那么以静电相互作用的方式来调控这一过程将会是一个简单而有效的方式。通过分析T细胞信号转导通路，我们发现第二信使钙离子的内流也许可以成为打破这种蛋白脂质相互作用的关键事件。有趣的是，在T细胞激活时，钙离子通道CRAC将会同T细胞受体有很好的共定位20。这将大大提高TCR周围的钙离子浓度，并使其同CD3竞争酸性磷脂成为可能。

　　为了验证钙离子同CD3ε/ζ竞争酸性磷脂的能力，我们在以前蛋白质-磷脂反应体系的基础上引入了钙离子，并进行了微平衡透析、荧光偏振、活细胞荧光共振能量转移及多维溶液核磁共振等实验4。结果确实证明钙离子在体外及T细胞内均可以打破带正电的CD3ε/ζ胞内段同酸性磷脂的相互作用，帮助ITAM从膜上解离同时暴露其关键的酪氨酸残基。进一步，我们又利用核磁共振一维磷谱方法从原子水平上证明了钙离子能与酸性磷脂头部区的磷酸根直接结合，中和其负电荷，由此可以打破CD3ε胞内段与酸性磷脂之间的静电作用。为了验证这种机制的生理相关性，我们分别进行了体外磷酸化实验及T细胞（包括细胞系及小鼠原代细胞）刺激实验。首先，我们模拟生理条件在体外重构了受体信号模体（CD3ε胞内段）、磷脂双分子层、钙离子及Lck激酶这一多元反应体系。实验结果表明，钙离子可以有效地促使CD3ε胞内段被Lck激酶磷酸化。接下来，我们利用低浓度CD3抗体交联刺激来模拟T细胞在生理上被微量抗原活化的过程。我们发现在刺激体系中加入钙离子能大大提高CD3ε与ζ被抗体刺激后的磷酸化程度。这一现象是由活化的T细胞中胞内钙离子浓度上升所介导的，因为钙离子螯合剂预处理或T细胞上钙离子通道缺失均会减弱钙的作用。由于钙离子是很重要的细胞内第二信使，调控许多信号通路。所以我们必须要用实验证明钙离子促进CD3磷酸化这一效应不是由钙离子信号通路介导的，而是钙离子作为二价离子中和了酸性磷脂的电荷后产生的效应。因为CD3在T细胞中是被Lck激酶所磷酸化，而被CD45等磷酸酶去磷酸化，我们首先要验证钙离子不会直接影响Lck和CD45等磷酸酶的活性。我们先在T细胞中过表达了活化型的Lck，让Lck的活性在T细胞中达到饱和。在这种情况下，钙离子还是能促进CD3磷酸化。另外，我们用各类小分子抑制剂在T细胞中抑制了CD45等主要磷酸酶的活性，发现钙离子还是能促进CD3磷酸化。这两个实验表明钙离子对CD3的帮助作用与Lck和CD45等磷酸酶的活性改变无关。为了彻底排除钙离子信号通路在钙离子对CD3帮助作用中的贡献，我们使用非生理的碱土金属锶离子代替钙离子来重复T细胞活化实验。锶离子能够像钙离子一样通过钙离子通道CRAC流入T细胞，但是它却不能激活钙离子介导的信号通路，因此锶离子是一个理想的对照物。我们的实验发现锶离子跟钙离子一样能够引起CD3胞内段从膜上解离并促进CD3磷酸化。综合以上的实验，我们认为钙离子能中和酸性磷脂的负电荷，由此打破CD3与磷脂的静电相互作用，引起CD3从膜上解离以及酪氨酸位点的暴露，从而促进CD3的磷酸化。

　　在这个工作中，我们发现了一种新颖的钙离子对蛋白质-磷脂静电相互作用调控机制。这一新机制揭示了TCR活化过程中存在着一个正反馈的过程：在静息状态下，TCR的活化位点通过CD3-酸性磷脂静电作用被屏蔽在细胞膜中；微量pMHC可以激活几个TCR引起初始活化信号，导致钙离子从胞外流入T细胞内；TCR周围局部钙离子浓度的提高可以打破CD3与酸性磷脂的静电作用，帮助未接触抗原刺激的TCR分子的磷脂化，从而将初始的TCR活化信号放大（图一）。这种钙离子介导的TCR信号放大机制有助于解释为什么T淋巴细胞对外来抗原有如此高的敏感性12, 13。同时，这一机制将为研究其它磷脂调控的蛋白质信号通路提供新的思路。当然，这一新机制也引发了一系列新的问题。除了钙离子以外，其余的二价金属离子是否也具有如此功能？这些二价金属离子的效果是否有很大差异？在功能上，这一膜调控机制是否影响着各种T细胞亚型对外界抗原的敏感性？随着越来越多研究的进行，我们相信这些问题将会得到完满的解答。<\/p>

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a, 在静息状态下，TCR中的CD3ε链及ζ链胞内段同细胞质膜内层酸性磷脂相互作用，其酪氨酸磷酸化位点被保护在膜脂双层中，从而免受激酶Lck或Fyn的磷酸化。b, 当少量的pMHC同TCR结合时，这些TCR中的CD3ε链及ζ链胞内段从细胞质膜内层解离并被激酶Lck或Fyn磷酸化，引发初始TCR活化信号，激活细胞质膜上的钙离子通道CRAC。c, 钙离子通道的打开使得钙离子大量内流，内流的钙离子可以同CD3ε链及ζ链胞内段竞争细胞质膜内侧酸性磷脂，并促进CD3ε链及ζ链胞内段从细胞质膜内层解离。解离的CD3ε链及ζ链胞内段将被激酶Lck或Fyn磷酸化，从而放大TCR活化信号。<\/p>

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2004年中科院上海生科院生化与细胞所分子生物学与生物化学专业研究生毕业，获理学博士学位。博士期间主要研究K+离子通道的抑制机制，科研成果作为主要部分申请获得2005年上海市科学技术进步一等奖。2004-2009年在美国哈佛大学医学院Dana-Farber肿瘤研究所从事免疫学研究，先后为博士后，Instructor。主要研究领域为T淋巴细胞的信号转导，特别是T细胞中关键免疫受体T细胞抗原受体（TCR）的活化机制，发现酸性磷脂调控TCR活化的新机制（Xu et al, 2008, Cell）。<\/span><\/p>","cshort2":"

2004年中科院上海生科院生化与细胞所分子生物学与生物化学专业研究生毕业，获理学博士学位。博士期间主要研究K+离子通道的抑制机制，科研成果作为主要部分申请获得2005年上海市科学技术进步一等奖。2004-2009年在美国哈佛大学医学院Dana-Farber肿瘤研究所从事免疫学研究，先后为博士后，Instructor。主要研究领域为T淋巴细胞的信号转导，特别是T细胞中关键免疫受体T细胞抗原受体（TCR）的活化机制，发现酸性磷脂调控TCR活化的新机制（Xu et al, 2008, Cell）。2009年11月起至今担任中科院上海生科院生化与细胞所研究员和课题组长，继续研究TCR和其它关键免疫受体的活化机制（Shi et al, 2013, Nature）。<\/span><\/p>","ctitle":"“小离子的大功能” - 钙离子调控T细胞抗原受体活化的机制研究","listseq":1,"seqno":"59","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-14-08-45-250"},{"caddress1":"中国科学院上海生命科学院神经科学研究所, 上海 200031","cauthor":"张淑贞 邵 炜 周嘉伟*","cintpic":"","clicktime":10,"clong1":"

据全国老龄委办公室新近发布的人口统计资料显示, 我国已快速进入老龄化社会。到2012年底, 全国60岁及以上的人口数量将达到2个亿, 逼近全国人口总量的15%, 老龄人口还将以每年1 000万人的速度递增。因此, 与人口老龄化密切相关的神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏病、帕金森病)的患病人数也将随之不断上升, 对这些疾病目前只有对症治疗的方法。如何通过发病机理的研究寻找延缓这些疾病进展的有效方法是近年来神经科学研究领域关心的一个重要课题。
在人的大脑中, 神经元只占10%, 而胶质细胞占绝大多数(90%左右), 其中一半为星形胶质细胞。星形胶质细胞有着独特的细胞结构, 可以迅速感知周围环境变化并做出反应, 发挥支撑、营养、抗氧化、调节大脑毛细血管血流量、清除氧自由基、损伤修复等重要作用。除此之外, 通过与神经元形成的联系, 它们可以参与脑的高级信息传导过程[1], 而小胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞, 在生理 状态下, 它们密切监视所在脑区的微环境, 并同周围的神经元和星形胶质细胞密切联系, 当病原体、抗原和毒素等侵入或导致大脑损伤时, 小胶质细胞会迅速激活, 释放大量的促炎症因子, 激活脑内的免疫系统并吞噬外来“侵入者”和受损细胞[2-3]。因此, 大脑正常生理功能和状态的稳定维持离不开脑内胶质细胞(包括小胶质细胞和星形胶质细胞)的精细调节和保护。
已知上述这两种胶质细胞的异常活化和多种促炎症因子的释放所构成的神经炎症反应常常对大脑健康不利, 但无论在自然衰老[4-5]还是中枢神经系统退行性疾病(如阿尔茨海默氏病[6-10]、帕金森病[7,11-14]、肌萎缩侧索硬化[11,15-16]、亨廷顿舞蹈症[11]等)的大脑中, 神经炎症反应均普遍存在, 并异常活跃, 促进免疫功能的失调和疾病的发生发展。大脑的免疫应答功能为什么会在中老年逐渐失调？其中的原因迄今不为人所知。因此, 了解大脑免疫应答的原理对回答这一问题, 以及寻找调节神经炎症的方法和途径, 对延缓脑衰老和控制中枢神经系统退行性疾病的发生和发展都具有重要的理论意义。
多巴胺受体是脑内主要神经递质多巴胺信号系统的重要一员, 在包括情感、成瘾、自主运动等众多高级的神经活动功能中发挥关键的作用[17]。有研究提示, 多巴胺D2受体(Drd2)能影响CD4+阳性的 T淋巴细胞的活化[18]。老年人大脑神经递质多巴胺及Drd2水平均明显下降[19-21], 并且Drd2也表达在小胶质细胞[22]和星形胶质细胞[23-26]中, 提示Drd2可能参与了中枢神经系统固有免疫的调节。
我们最近的研究发现, 在Drd2缺失的情况下, 小鼠脑内多个区域呈现显著的炎症反应, 这一反应随着年龄的增加逐渐增强。而在神经毒素MPTP所致的帕金森病小鼠动物模型中, Drd2的缺失加剧了胶质细胞的激活, 使炎症反应更趋严重, 中脑多巴胺能神经元对神经毒素更加敏感, 死亡率上升, 说明Drd2正常情况下可以抑制中枢神经系统的炎症反应, 维持脑的免疫稳态。我们的研究进一步提示, Drd2的这一抑制中枢神经系统炎症反应的作用主要归功于表达在星形胶质细胞上的Drd2。前人的研究揭示了星形胶质细胞在神经退行性疾病发生发展过程中所起的重要作用[11], 但是具体是什么样的信号被用来调节星形胶质细胞的功能并不清楚。我们的实验结果表明, 星形胶质细胞的功能角色可以受到Drd2的调控, 这为老年人的免疫功能失调提供了合理的解释。
??? 在哺乳动物的中枢神经系统中, 小胶质细胞和星形胶质细胞发挥免疫调节作用[5]。学术界一般认为, 小胶质细胞在大脑炎症反应中发挥主导作用, 而星形胶质细胞则起着辅助作用。2009年, 美国Glass 博士实验室在Cell<\/em>杂志上发表的文章代表了之前科学家对脑内固有免疫的经典观点, 即在细菌内毒素LPS刺激诱导的炎症反应过程中, 小胶质细胞首先激活, 星形胶质细胞接受了小胶质细胞的免疫信号后被动激活, 两者相互配合最终促进神经元损伤和退化[27]。我们利用原代培养Drd2<\/em>敲除的小胶质细胞和星形胶质细胞, 以及在星形胶质细胞内特异敲除Drd2<\/em>的条件性敲除小鼠发现, 缺失Drd2<\/em>的星形胶质细胞在基础状态下产生的促炎症分子水平就已经上升, 在给予免疫刺激时, 它们的反应更强烈, 而小胶质细胞对免疫刺激的反应性却并没有明显的改变, 提示Drd2<\/em>主要是通过星形胶质细胞起到抑制炎症的作用的。
星形胶质细胞上的Drd2<\/em>是如何发挥上述作用的？为回答这一问题, 我们利用基因芯片筛选了可能介导Drd2<\/em>作用的下游信号分子。结果显示, αB- 晶状体蛋白(αB-crystallin, Cryab)在Drd2<\/em>敲除的小鼠脑内明显降低。利用在星形胶质细胞中敲除Drd2 <\/em>的小鼠, 我们证实, 星形胶质细胞表达的Drd2为维持Cryab的表达所必需。Cryab是一种小分子热休克蛋白, 它主要表达在星形胶质细胞和少突胶质细胞中, 发挥抑制炎症和神经保护的作用[28]。将在星形胶质细胞中过表达Cryab的转基因小鼠与Drd2<\/em>敲除的小鼠杂交, 可以显著地抑制由于Drd2<\/em>缺失所导致的促炎症因子的产生。这说明生理情况下, 星形胶质细胞的Drd2<\/em>能够通过控制其下游的Cryab的水平来抑制免疫反应(图1A)。
??? 我们推测, 在生理情况下, 多巴胺/Drd2信号通路可以维持Cryab于正常的水平, 抑制促炎症因子的过度产生。在外界有害刺激作用时, 由于Cryab 的抑制促炎症因子基因表达的作用, 炎症反应可以控制在一定的范围内。而在星形胶质细胞的Drd2 信号通路减弱(如神经递质多巴胺或其受体Drd2水平下降)的情况下, Cryab的表达水平降低, 在外界有害刺激到来时, 不能有效应对, 使得对炎症反应失去有效制约, 参与了神经元的退变和老化的过程(图1B)。
本研究成果的科学意义在于: (1) Drd2除了表达在多巴胺能神经元突触前和突触后神经元上传导神经信号外, 还表达在星形胶质细胞中起到抑制神经炎症的作用。一直以来, Drd2被公认为主要参与多巴胺能神经传导, 此项研究则揭示了Drd2<\/em>的一个与传统认识迥然不同的新功能, 即在星形胶质细胞中发挥抑制其异常活化和神经炎症反应的作用。(2) Drd2<\/em>对神经炎症的调控是通过作用于星形胶质细胞而不是小胶质细胞实现的。Drd2决定了星形胶质细胞作用的两面性—Drd2<\/em>缺失可使星形胶质细胞从生理状态下神经元的支持细胞转化为对神经元不利的促炎症细胞。(3)在星形胶质细胞中, Drd2是通过Drd2/Cryab信号转导通路来抑制炎症因子的产生的, 这与传统的Drd2细胞内信号转导通路截然不同。该研究对进一步理解多巴胺受体的生理功能, 拓展人们对星形胶质细胞在脑衰老中作用的认识, 并为今后选择合适靶点, 有效地延缓脑衰老乃至干预神经退行性疾病提供了有价值的信息。

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A: 星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元三种细胞之间相互通讯的模式图; B: 生理和病理条件下, 星形胶质细胞内Drd2/Cryab抑制促炎症因子产生的模式图。在衰老和与衰老相关的脑疾病中, 星形胶质细胞Drd2的信号降低, 引起Cryab的功能性的降低, 从而导致炎症介导因子的过度产生。DA: 多巴胺。<\/span>
图<\/span>1 <\/strong>在星形胶质细胞内<\/span>Drd2/Cryab<\/strong>信号通路发挥抑制炎症反应的作用<\/span><\/p>


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参考文献 (References)
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周嘉伟, 研究员, 现任神经科学国家重点实验室副主任。1985年毕业于南通医学院医疗系, 获学士学位; 1988年毕业于南通医学院神经解剖学专业, 获硕士学位; 1996年在英国帝国理工医学院生化系获博士学位。1996~1998年在美国Hahnemann大学从事博士后研究。 先后在中国科学院上海生理研究所、生物化学与细胞生物学研究所和神经科学研究所工作。现任中国生理学会常务理事、中国神经科学学会理事。主要从事神经退行性疾病帕金森病和神经发育的分子细胞基础的研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

周嘉伟, 研究员, 现任神经科学国家重点实验室副主任。1985年毕业于南通医学院医疗系, 获学士学位; 1988年毕业于南通医学院神经解剖学专业, 获硕士学位; 1996年在英国帝国理工医学院生化系获博士学位。1996~1998年在美国Hahnemann大学从事博士后研究。先后在中国科学院上海生理研究所、生物化学与细胞生物学研究所和神经科学研究所工作。现任中国生理学会常务理事、中国神经科学学会理事。主要从事神经退行性疾病帕金森病和神经发育的分子细胞基础的研究。阐述了多巴胺受体在星形胶质细胞中的生理作用和在神经炎性反应中的病理学意义。最新研究成果在线发表于2012年12月16日的Nature杂志(Shao W#, Zhang SZ#, et al. Nature. Highlighted by Y Bordon. Nat Rev Immunol 2013; 13: 69)。研究受到科技部973等的支持。2005年获得国家自然科学基金委员会杰出青年基金资助。获中国发明专利授权3项。<\/span><\/p>","ctitle":"星形胶质细胞表达的多巴胺D2受体在抑制 神经炎症反应中的作用","listseq":2,"seqno":"58","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-18-34-259"},{"caddress1":"中国科学院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学国家重点实验室, 上海 200031","cauthor":"钟翠青 李劲松*","cintpic":"","clicktime":13,"clong1":"

在有性生殖中, 单倍体配子(卵子和精子)通过 受精结合成二倍体的受精卵, 开始了一个新生命, 并 且将自身的遗传物质延续给后代。在这样一个生命 周期中, 由减数分裂获得的单倍体配子需要进一步 高度特化, 形成特定的结构和功能以完成受精过程。 就目前的研究技术和手段, 我们仍无法实现卵子和 精子在体外进行长期的扩增和培养, 这大大阻碍了 科学家对单倍体配子的基础研究以及体外的遗传操 作。那么, 能否利用其中的任一种配子获得单倍体 细胞系呢？早在三十多年前, 科学家对此进行了大 胆的尝试[1-4]。虽然他们利用不同的手段获得了孤雌 和孤雄的单倍体胚胎, 并能在胚胎的卵圆柱期观察 到单倍体细胞的存在, 但是这些单倍体胚胎建立的 胚胎干细胞系最终都变成二倍体[3]。因此, 在高等 的哺乳动物个体中, 除了发生减数分裂的生殖细胞 以单倍体形式存在之外, 绝大部分细胞均为二倍体。 即使在人肿瘤细胞和白血病细胞株中偶尔会出现 接近于单倍体的细胞[5-7], 并能在体外长期稳定培养,但是这种细胞株来源于癌细胞, 不能广泛运用于基 因研究和治疗。而胚胎干细胞具有体外培养无限增 殖, 并能嵌合到生殖嵴实现遗传物质的传递的特性, 于是人们把更多注意力集中于单倍体胚胎干细胞系 的建立上。因此如何在单倍体细胞变成二倍体之前 将其维持住将是关键所在。<\/span>

最近, Anton Wutz和Josef M. Penniger两个实验 室先后报道了小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞的成功建 立[8-9]。针对单倍体胚胎干细胞容易二倍体化的问题, 他们利用流式细胞术(FACS)实现了单倍体细胞的 富集和维持。这些细胞除了具有正常胚胎干细胞的 特性之外, 利用其单倍体性, 还能够运用于遗传的正 反向筛选。相比于二倍体胚胎干细胞, 利用单倍体 胚胎干细胞进行遗传筛选具有其独特的优点, 因为 这将克服对于隐性基因只有在二倍体基因组为纯合 子时才能显现表型这一困难, 由于单倍体只有一份 染色体, 只要其发生了遗传改变, 就能出现相应的表 型。而相对于癌细胞来源的类似单倍体细胞系来说, 单倍体胚胎干细胞能够通过生殖系嵌合的方式将遗 传修饰传递到下一代, 实现基因的功能研究从细胞 水平向动物模型的提升。<\/span>

但是, Anton Wutz和Josef M. Penniger的研究并 未表明其获得的小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞能否嵌 合到生殖系。另外, 来自于卵母细胞的孤雌单倍体 胚胎干细胞是否携带雌性的表观遗传特性也不得而 知。同时, 这种孤雌胚胎干细胞能否像青鳉鱼(Oryzias latipes)单倍体多能干细胞系一样, 通过将单倍体干细 胞注入卵细胞中获得半克隆后代呢[10] ？考虑到鱼不 存在基因印记的情况, 小鼠的孤雌单倍体胚胎干细 胞注入卵细胞中得到的孤雌囊胚可能会因为印记的 不平衡而导致胚胎无法发育到期[11-14]。即使可以用 单倍体细胞的染色体纺锤丝复合物(chromosomespindle- complex, CSC)代替MII卵的纺锤丝复合物, 然后进行单精注射这种稍繁琐的方法[15], 但是也没 有被成功证实。基于此, 我们设想, 能否在体外建立 孤雄单倍体胚胎干细胞系？并且这种胚胎干细胞能 否维持与精子类似的雄性印记？如果可以, 利用这 种孤雄单倍体干细胞代替精子注入卵母细胞能否得 到正常的个体？再者, 如果能够代替精子得到正常 的个体, 这种孤雄单倍体胚胎干细胞能否在体外进 行基因改造后通过注射到卵细胞而省略常规基于二 倍体胚胎干细胞的打靶技术需获得生殖系嵌入的小 鼠这一步来获到遗传修饰的后代呢？<\/span>

一系列的设想被提出之后, 本研究组首先采用 2种策略来获得小鼠的孤雄单倍体胚胎: (1)向去核 的卵母细胞中注射成熟精子的头部; (2)将受精后获 得的合子胚胎的雌原核去除。利用上述方案获得的 重构胚胎只含有一套来自父系的遗传物质, 即孤雄 单倍体胚胎。它们能像正常胚胎一样发育到囊胚, 从这些囊胚中能够分离建立胚胎干细胞系。然后, 我们通过流式分选的方法检测建立的孤雄胚胎干细 胞系是否存在单倍体细胞。令人惊喜的是, 虽然大 部分孤雄胚胎干细胞系是二倍体的, 但是仍有部分 细胞系存在单倍体细胞。通过流式富集的方法, 最 终我们得到了5株孤雄单倍体胚胎干细胞系(androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs)。 这些细胞系能够在体外培养超过30代, 通过定期流 式分选富集的方法可以在体外维持单倍体细胞的存 在。同时, 我们证明这些AG-haESCs具有胚胎干细 胞的基本特性, 不仅能表达小鼠胚胎干细胞特异的 多能性标志基因, 而且能在体内外分化发育成各个 胚层的细胞。<\/span>

从理论上说, 每个AG-haESC系来源于一个精子, 那么我们所建立的AG-haESCs是否仍保留着 与精子相似的表观遗传特性？通过芯片表达谱分 析、Real-time PCR以及bisulfite sequencing等手段, 我们分析了AG-haESCs的印记基因的表达情况, 发 现AG-haESCs很大程度上仍维持着典型的父本印 记。印记基因对于哺乳动物的胚胎发育起着重要的 作用, 在有性繁殖中只有父本和母本的印记都能正 常表达, 胚胎才能发育成正常的个体[13]。既然AGhaESCs 能够保留这种典型的父本印记, 那么这种 AG-haESCs能否当成是一种可长期培养的“人造精 子”通过类似于胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)的方法注射到卵细胞中, 在父 本和母本印记都正确表达的情况下, 获得正常的小 鼠呢？为此, 研究组采用了改进的ICSI的方法— 胞浆内孤雄单倍体胚胎干细胞注射(intracytoplasmic AG-haESCs injection, ICAHCI), 将AG-haESCs注入 到卵细胞获得重构的胚胎, 这些胚胎能够在体外正 常发育到囊胚, 移到假孕母鼠的子宫内, 也能够发育 成健康的小鼠, 称半克隆小鼠(semicloned mice, SC mice)。由此可见, AG-haESCs能够代替精子, 使卵细 胞成功“受精”, 支撑小鼠胚胎的全程发育。有意思 的是, 这些半克隆小鼠均为雌性, 这是因为在构建孤 雄单倍体胚胎时, 携带Y染色体的小鼠胚胎不能正 常发育到囊胚[2,16], 因此不可能获得携带Y染色体的 AG-haESCs。<\/span>

相对于正常的ICSI技术获得健康小鼠的效率 而言, 孤雄单倍体胚胎干细胞这种“人造精子”进行 ICAHCI获得半克隆小鼠的效率较低。可能存在的 原因有: (1)AG-haESCs在结构和功能特性上与精 子有很大的差别; (2)AG-haESCs与精子之间表观 遗传特性也存在一定的差异。我们发现, 虽然AGhaESCs 维持着典型的父本印记, 但是仍有部分印记 发生了改变, 例如雄性印记基因H19出现启动子区 域低甲基化, 从而导致该基因的过表达。另外, 随着 培养环境的变化与传代次数的增加, AG-haESCs的 雄性印记也会出现不同程度的擦除[17-18]。而印记基 因的表达异常最终会导致胚胎的畸形发育[19]。这些 问题的出现不仅能帮我们理解自然受精之后遗传 物质发生的早期表观修饰事件, 同时也为我们如何 提高AG-haESCs的精子特性以更高效率地获得半克 隆小鼠提供了新的线索。利用ICAHCI获得半克隆 小鼠, 从观念上改变了人们所认为的只有精子才能与卵细胞完成“受精”的传统思维, 我们的研究表明 AG-haESCs同样具有“受精”能力。<\/span>


AG-haESCs的成功建立, 不仅为大规模进行基 因筛选提供了新材料, 而且为获得遗传修饰的动物 模型开辟了新思路。传统的基因打靶都必须经历在 胚胎干细胞中进行基因打靶、将打靶的胚胎干细胞 注入囊胚获到嵌合体小鼠、嵌合小鼠通过生殖系遗 传将打靶基因传递到下一代等步骤。其中, 获得生 殖系遗传的嵌合小鼠是一个限速步骤, 使得整个基 因打靶的周期变得漫长。如果在体外将AG-haESCs 进行基因打靶操作, 然后利用ICAHCI的方法将其注 入到卵细胞得到正常后代的话, 那么这种方法得到 的后代均将带有遗传修饰的基因, 这将大大缩短了 整个基因打靶的周期。因此, 我们和徐国良研究组 将此设想付诸实践, 尝试着利用AG-haESCs进行基 因敲除, 成功得到基因敲除的后代。不久以后, 周琪 和赵晓阳团队也发表了他们利用孤雄单倍体胚胎干细胞获得转基因小鼠的研究成果[20]。<\/span>
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AG-haESCs在基因打靶过程中缩短实验周期上 具有一定的优势, 而另外一个更加诱人的运用将会 在那些不能进行有效的嵌合体形成和生殖系传递的 动物上得到体现, 例如灵长类大型动物。虽然灵长 类的胚胎干细胞早已建立, 但是最新的研究显示这 些胚胎干细胞不能有效形成嵌合体动物[21]。因此, AG-haESCs作为可以替代精子的“人造精子”, 能够 在体外进行培养以及遗传操作, 并通过ICAHCI技术 完成与卵细胞进行结合的使命(图1), 从而获得健康 后代, 同时也实现遗传信息的有效传递, 为遗传修饰 的更高效完成开辟了新的道路。<\/span><\/p>

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20 Li W, Shuai L, Wan H, Dong M, Wang M, Sang L, et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice. Nature 2012; 490(7420): 407-11. 21 Tachibana M, Sparman M, Ramsey C, Ma H, Lee HS, Penedo MC, et al. Generation of chimeric rhesus monkeys. Cell 2012; 148(1/2): 285-95.<\/span>

21 Tachibana M, Sparman M, Ramsey C, Ma H, Lee HS, Penedo MC, et al. Generation of chimeric rhesus monkeys. Cell 2012; 148(1/2): 285-95.<\/span><\/p>


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李劲松, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员。2002年7月毕业于中国科学院动物研究所, 获得博士学位; 主要从事克隆牛研究,获得国内第一批体细胞克隆牛, 并获国家自然科学二等奖(排名第四)。2002年8月—2007年7月在美国洛克菲勒大学从事博士后研究; 主要探讨不同供体细胞对核移植诱导体细胞重编程的影响, 获得嗅觉神经、皮肤干细胞的克隆小鼠(Nature, 2004; PNAS, 2007), 获第40届美国生殖年会的USDA-CSREES-National Research Initiative Merit Awards。<\/span><\/p>","cshort2":"

李劲松, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员。2002年7月毕业于中国科学院动物研究所, 获得博士学位; 主要从事克隆牛研究,获得国内第一批体细胞克隆牛, 并获国家自然科学二等奖(排名第四)。2002年8月—2007年7月在美国洛克菲勒大学从事博士后研究; 主要探讨不同供体细胞对核移植诱导体细胞重编程的影响, 获得嗅觉神经、皮肤干细胞的克隆小鼠(Nature, 2004; PNAS, 2007), 获第40届美国生殖年会的USDA-CSREES-National Research Initiative Merit Awards。2007年8月回国建立实验室, 继续从事体细胞重编程的研究。发现滋养外胚层缺陷是克隆动物出生率低的关键原因(Lin et al. Cell Stem Cell, 2011); 与徐国良研究员合作揭示母源因子TET3蛋白参与了卵母细胞介导的细胞重编程(Gu et al. Nature, 2011), 建立能替代精子使用的孤雄单倍体胚胎干细胞(Yang et al. Cell, 2012)。研究成果于2011年和2012年两次入选科技部评选的“中国科学十大进展”。 <\/span><\/p>","ctitle":"代替精子使用的孤雄单倍体胚胎干细胞的建立","listseq":3,"seqno":"57","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-18-03-087"},{"caddress1":"清华大学医学院动态免疫生物学实验室，北京 100084","cauthor":"徐和平 祁海","cintpic":"","clicktime":6,"clong1":"

高亲和力、同种型转换过的抗体是机体长效抵抗微生物感染、维持自身健康的重要机制之一。抗体成熟过程发生在次级淋巴器官中一个主要由活化B细胞组成的特殊区域, 称之为生发中心(germinal center, GC)[1-2]。生发中心反应是B细胞向记忆性细胞和骨髓中长期存活的浆细胞分化的重要选择阶段, 而这两群B细胞对于迅速的体液免疫反应都是不可或缺的[3-4]。因此, 生发中心反应是获得性免疫应答过程中最为关键的步骤。但是生发中心反应不仅仅只有B细胞的参与, 还需要一部分CD4+ T细胞从T细胞区域迁移到B细胞区(又称之为滤泡区), 去辅助GC B细胞的存活与克隆增殖[1,5-6]。由于这群具有很强辅助能力的CD4+ T细胞特异的在滤泡区发挥功能, 因此被命名为滤泡性辅助T细胞(follicular helper T cells, Tfh cells)[7-8]。<\/span>

Tfh细胞有其独特的基因表达谱, 如高表达Bcl-6、CXCR5、ICOS、PD-1、IL-21、SLAM-associated protein(SAP), 以及SLAM家族成员CD84[9-10]。然而, 相对于其他诸如Th1、Th2、Th17等CD4+辅助T细胞亚型而言, 定位于滤泡区域是Tfh细胞最重要的特征[11-12]。这种特异的定位不仅仅是Tfh细胞的分化特征, 更为重要的是Tfh细胞与抗原特异B细胞在滤泡区域的共定位接触是其辅助B细胞的主要途径[13-14]。例如Tfh细胞需要通过CD40L与GC B细胞上的CD40结合来给GC B细胞提供存活信号, CD40L-CD40信号传递就依赖于Tfh细胞与GC B细胞的直接物理性接触[6,15-17]。而T细胞与B细胞的共定位接触一旦出现问题, 就会导致严重的免疫缺陷症状。如SAP分子的缺陷会导致T细胞与抗原特异B细胞之间的稳定结合能力下降, 进而影响生发中心形成和高亲和力抗体的产生, 最终导致XLP(X-linked lymphoproliferative disease)等疾病的发生[18-20]。同时, 已有很多的研究表明, Tfh细胞与自身免疫疾病、艾滋病、淋巴瘤等重大疾病防治都有密切关系[21-25]。然而, T细胞具体是如何迁移到滤泡区域分化形成Tfh细胞还不明确。<\/span>

目前, 根据已有的研究结果建立的T细胞迁移模型完全以趋化因子受体CXCR5为主体[26]。在T细胞处于未活化状态时, T细胞会高表达趋化因子受体CCR7, 而不表达CXCR5。CCR7能够响应T细胞区域基质细胞分泌的趋化因子CCL21/19, 从而使T细胞定位于T细胞区。当T细胞被抗原活化后会下调CCR7, 同时上调Tfh细胞的转录调控因子Bcl6, 进而促进CXCR5表达。由于CXCR5是滤泡区域趋化因子BLC的受体, 所以T细胞会在BLC的诱导下向滤泡区迁移, 进而最终分化成为Tfh细胞[27-29]。同时有研究发现, 协调刺激信号分子ICOS(inducible co-stimulatory molecule)能够从树突状细胞上通过ICOSL(ICOS的配体)获取上调Bcl6和CXCR5的信号[30]。所以, 树突状细胞通过ICOSL作用于T细胞上的ICOS, 进而上调转录因子Bcl6, 最后再促进CXCR5的表达是目前已知的Tfh细胞分化的主要通路。然而, 依然存在着与该分化通路不一致的研究结果, 比如最近发现CXCR5最开始的上调并不依赖转录因子Bcl6的表达[31]; 并且CXCR5缺陷的T细胞依然能够迁移到滤泡区支持生发中心反应[32]。因此, T细胞具体是如何迁移到滤泡区域分化形成Tfh细胞的目前并不明确。<\/span>

在分析以上研究背景的基础上, 协同刺激信号分子ICOS成为了我们主要的关注对象。因为ICOS缺陷会导致T细胞完全丧失向滤泡区域迁移的能力, 同时ICOS缺陷T细胞也不能上调CXCR5的表达, 不能支持生发中心的形成(图1)。因此, 在ICOS缺陷T细胞上过表达CXCR5能否提高T细胞向滤泡区内迁移的能力是首先要验证的问题。利用逆转录病毒系统在ICOS–/– T细胞上过表达CXCR5分子后, 再通过尾静脉注射的方式将T细胞回输到小鼠体内, 最后利用特异性抗原在体内诱导免疫反应。通过组织切片检测T细胞的定位发现, ICOS–/– T细胞中过表达CXCR5只是促进T细胞迁移到T-B交界区(T细胞区和滤泡区域的交界重叠区域), 但是并不能使ICOS–/– T细胞完全进入到滤泡区内。<\/span>

由于ICOS是经典的协调共刺激信号分子, T细胞在与树突状细胞或者抗原特异B细胞进行抗原特异相互作用时, 可以通过ICOS-ICOSL的相互作用获取共刺激信号。并且已有研究证明, 抗原呈递细胞上的ICOSL对于Tfh细胞分化和维持都有重要作用[30-33]。同时, Bcl6被认为是Tfh细胞分化转录调控因子, 它的缺失或者高表达会直接影响体内Tfh细胞的分化[27-28,34]。然而, 在建立不同组合的细胞共回输动物实验的基础上, 我们发现Bcl6和来源于抗原呈递细胞上的ICOSL对于ICOS依赖型的T细胞向滤泡区迁移的过程都不是必须的。因此, ICOS调节滤泡区招募辅助T细胞的过程并不完全需要特异性的抗原信号存在。进一步通过检测T细胞在无关抗原免疫或者完全没有免疫的宿主小鼠体内的归巢能力, 我们发现过表达CXCR5的野生型T细胞就能够运动到滤泡区域, 而ICOS–/– T细胞不能向滤泡区域归巢。这一实验结果直接说明了ICOS可以在抗原信号之外调节T细胞向滤泡区内运动。<\/span>


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接下来的问题是, 滤泡区内什么细胞可以通过ICOS为活化T细胞提供信号来促进T细胞向滤泡区内迁移, 并且这群细胞还不参与抗原信号的呈递？我们关注到, 滤泡区内大量未活化B细胞能够持续表达ICOSL。那么, 当活化T细胞运动到T-B交界区域时, T细胞就会“浸没”在未活化B细胞中, 这些未活化B细胞就有可能通过ICOSL来持续性刺激ICOS, 进而促进T细胞向滤泡内迁移。为了验证这个假设, 我们首先利用μMT小鼠来源的干细胞不能分化形成成熟B细胞这一特性, 建立了μMT:ICOSL–/–骨髓重建小鼠模型。在该小鼠嵌合体模型内, 所有B细胞都来源于ICOSL–/–干细胞, 因此B细胞上都特异地缺失了ICOSL表达。当将抗原特异T细胞回输到这种嵌合体小鼠体内, 发现免疫后的T细胞都不能迁移到滤泡区域。因此, 未活化B细胞上的ICOSL是ICOS调节T细胞向滤泡区域运动的必要条件。<\/span>

然而, ICOSL-ICOS相互作用具体是如何在独立于抗原信号之外调节T细胞定向运动的还不明确。目前, 已知T细胞向滤泡区域的定向运动主要是靠CXCR5和CCR7感知不同的趋化因子来控制的[26,29]。CXCR5过表达实验说明, 趋化因子受体的表达量并不影响ICOS这种直接调节T细胞运动的能力。同时, 利用体外细胞穿孔迁移实验发现, 刺激ICOS也不能改变T细胞对不同趋化因子的响应敏感度。因此, 仅仅依靠趋化运动并不能解释ICOS调节T细胞定向迁移的能力。细胞定向迁移的效率取决于两个因素: 一是细胞感知趋化因子受体的浓度梯度; 二是细胞的持续随机运动能力[35-36]。细胞的形态极化和伪足形成是细胞持续性随机运动的特征, 持续性随机运动能够使细胞在短时间内维持一定方向上的运动持续性, 进而提高细胞感知趋化因子浓度的效率, 最终促进细胞定向运动的能力[37-38]。因此, 我们首先利用TIRF显微镜在磷脂双分子层膜上检测T细胞的形态和运动能力, 发现ICOS刺激可以使T细胞发生极化, 并不停地形成伪足, 进而维持一定的运动迁移能力。因此, ICOS促进滤泡区域招募辅助T细胞的机制可能是ICOS可以提高T细胞的持续性随机运动。根据体外的实验数据, 我们采用活体内双光子显微镜观测了ICOS野生或者缺陷型T细胞在体内T-B交界区域的运动能力。与野生型T细胞相比, ICOS–/– T以更高的频率出现在无伪足的未极化状态, 进而导致T细胞在运动速度、运动持续性上都有非常显著的下降。当利用滤泡区域没有ICOSL表达的μMT:ICOSL–/–骨髓嵌合体小鼠作为抗原特异T细胞回输受体时, 研究发现野生型的T细胞在伪足形成、运动速度和持续性上都表现出与ICOS–/– T细胞相同的缺陷。该实验结果进一步说明了ICOSL的确直接通过ICOS来调节T细胞的随机运动能力。<\/span>

我们的研究工作发现, ICOS可以在独立于协同刺激信号之外, 通过促进T细胞的随机运动能力来直接控制T细胞向淋巴器官滤泡区迁移, 进而决定T细胞的分化方向。ICOS的这种作用依赖于非抗原呈递B细胞上表达的ICOSL。因此, 非抗原呈递B细胞不仅可以作为个体来提供识别抗原的受体库, 同时还可以通过相互合作的方式来为抗原特异的B细胞招募辅助性T细胞。这些结果为理解滤泡辅助T细胞分化通路提供了新线索。同时, ICOS分子在共刺激信号之外对T细胞运动的直接调节作用, 是其发现以来首次在体内得到证明的新功能。这对于理解ICOS以至其它共刺激分子在病理及生理炎症过程中所起的作用会有新的启发。<\/span>

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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-49-03-506.jpg","cshort":"

祁海, 清华大学医学院教授、博士生导师。2003年毕业于德克萨斯州加尔维斯顿医学院, 获病理学博士学位; 主要从事免疫寄生虫学研究。2003年6月至2009年4月在美国国立卫生研究院从事博士后研究; 参与完善了基于双光子显微镜的在体免疫组织动态成像技术, 主要关注体液免疫调节、多细胞在体交互作用机制、细胞与组织动态对免疫反应及记忆的影响。对其领域的主要贡献包括：2006年, 在《科学》证明B细胞在体内受树突状细胞活化的过程; 2008年, 在《自然》揭示SAP分子调控T-B细胞相互作用; 2013年, 在《自然》鉴定ICOS分子调控滤泡辅助T细胞运动能力的新机制。<\/span><\/p>","cshort2":"

祁海, 清华大学医学院教授、博士生导师。2003年毕业于德克萨斯州加尔维斯顿医学院, 获病理学博士学位; 主要从事免疫寄生虫学研究。2003年6月至2009年4月在美国国立卫生研究院从事博士后研究; 参与完善了基于双光子显微镜的在体免疫组织动态成像技术, 主要关注体液免疫调节、多细胞在体交互作用机制、细胞与组织动态对免疫反应及记忆的影响。对其领域的主要贡献包括：2006年, 在《科学》证明B细胞在体内受树突状细胞活化的过程; 2008年, 在《自然》揭示SAP分子调控T-B细胞相互作用; 2013年, 在《自然》鉴定ICOS分子调控滤泡辅助T细胞运动能力的新机制。祁海教授是 Science、Journal of Experimental Medicine的审稿人, 是Immunity、Inflammation and Disease杂志和Nature.com在线杂志Scientific Reports编委。<\/span><\/p>","ctitle":"协同刺激信号分子ICOS在滤泡性辅助T细胞分化中的作用","listseq":4,"seqno":"56","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-17-44-377"},{"caddress1":"中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海 200032","cauthor":"许 可 赵 琴 张 鹏*","cintpic":"","clicktime":8,"clong1":"

ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白是存在于所有生物体中的最大的一类转运蛋白家族, 主要功能是利用水解ATP的能量来驱动物质跨膜运输。根据物质转运的方向将ABC转运蛋白分为内向转运蛋白(importer)和外向转运蛋白(exporter)。ABC转运蛋白家族在组成上非常保守: 两个跨膜蛋白(transmembrane domains, TMDs)组成物质跨膜转运的通道, 两个ATP结合蛋白(nucleotide-binding domains, NBDs)位于细胞膜内侧行使ATP水解酶的功能, 为物质的转运提供能量。除此以外, 内向转运蛋白在膜外还存在一个底物结合蛋白(solute-binding protein, SBP), 负责底物的识别与向跨膜蛋白的递呈[1-2]。根据目前已经解析的ABC转运蛋白的结构, 科学家提出了一个“两种状态”的模型来描述内向转运蛋白的转运机制: 膜结合蛋白二聚体在接受膜外底物时采取“∨”型构象, 而释放底物到细胞内时采取“∧”型构象, ATP的水解驱动两种构象的转化[3-11]。<\/span>

能量耦合因子型(energy-coupling factor, ECF)转运蛋白属于一类新的ABC内向转运蛋白, 由负责底物识别与结合的跨膜S蛋白(EcfS)与负责ATP水解与能量传递的能量耦合模块(energy-coupling module)组成, 其中能量耦合模块是由一个跨膜的T蛋白(EcfT)以及两个ATP结合蛋白(EcfA与EcfA′)构成[12-14]。尽管与经典的ABC转运蛋白存在一些相似性, ECF转运蛋白明显拥有自己独特的结构与功能特征。底物结合蛋白SBP的缺失让我们可以轻易地将ECF转运蛋白从经典的ABC内向转运蛋白中区分出来[15]。从之前已经报道的S蛋白RibU与ThiT的结构中, 可以清楚地看到底物核黄素与硫胺素的结合位点[16-17]。然而, 在发挥生物功能的转运蛋白复合体中, 四个蛋白组分具体是如何装配以及通过怎样的机制实现物质的跨膜转运依然不清楚。最近, 我们解析了一个分辨率为3的来自乳酸菌的叶酸ECF转运蛋白复合体的结构[18]。以此结构为基础我们提出了ECF转运蛋白实现跨膜转运独特的分子模型: 即底物的转运可通过S蛋白在膜内的构象扭转来实现。<\/span>

叶酸ECF转运蛋白复合体由叶酸结合蛋白FolT(EcfS)、EcfT、EcfA与EcfA′四种蛋白组成, 我们重组表达并纯化了该复合体, 通过体内和体外转运实验证实了其叶酸转运活性, 通过蛋白质晶体学的方法解析了分辨率为3的晶体结构。结构确证了ECF复合体中各组分的化学计量学(Stoichiometry)比例为1:1:1:1, 即ECF转运蛋白功能复合体是由各一分子的EcfS蛋白、EcfT蛋白、EcfA蛋白与EcfA′蛋白组成, 解决了这一长期以来困扰着人们的问题。在该复合体中, EcfA与EcfA′蛋白形成异二聚体, 没有ATP结合, 其结构与经典的ABC转运蛋白中的NBDs结构十分相似; 叶酸结合蛋白FolT与EcfT蛋白形成跨膜的异二聚体, 与经典ABC转运蛋白复合体的跨膜蛋白有着显著的差异。<\/span>

与ECF转运蛋白中其他三个组分不同, EcfT蛋白是一个全新的结构。EcfT蛋白结构由8个α螺旋组成, 其中3个膜内的α螺旋CH1-3处于N端4个α螺旋TM1-4与C端的α螺旋TM5之间, R1与R2 loop连接CH2/CH3和CH3/TM5。整个EcfT蛋白呈“L”型构象, 5个跨膜α螺旋与膜内3个α螺旋近似垂直, 分别形成L型的长臂和短臂。<\/span>

FolT的结构由6个α螺旋组成, 通过与之前解析的S蛋白单体RibU和ThiT的结构比较[16-17], 在FolT上与EcfT蛋白相互作用的区域附近发现了一个口袋, 口袋周围的氨基酸在很多物种中都是高度保守的, 推测其可能就是底物叶酸结合的位点。但是在这个口袋中我们没有看到叶酸的电子云密度, 这点也在液相串联质谱检验底物时得到了确认, 这提示我们这个结构代表了不结合底物的状态。在经典的ABC转运蛋白中, 跨膜蛋白与细胞膜呈垂直状态; 而在叶酸ECF转运蛋白复合体结构中, 跨膜蛋白FolT与膜平面近似呈20度夹角并斜插入细胞膜中, 叶酸的结合口袋面向膜内。在两个异二聚体FolT/EcfT与EcfA/EcfA′之间存在一个大的凹槽, 与预测的叶酸结合口袋相连, 推测为底物叶酸进入膜内的通道。<\/span>

EcfA蛋白与EcfA′蛋白与经典的ABC转运蛋白的NBDs相似, 由α螺旋结构域、RecA结构域和C端结构域组成, 与ATP结合/水解相关的Walker A/B motifs、Q/D loops、LSGGQ motif和His switch都比较保守。将我们获得的结构与麦芽糖ABC转运蛋白NBD二聚体的结构进行比较, 发现叶酸ECF转运蛋白结构中EcfA与EcfA′蛋白更接近开放构象。因此, 我们推断我们获得的结构处于将底物释放到膜内后的内向型构象(inward-facing state)(图1)。<\/span>

叶酸ECF转运蛋白复合体结构的解析, 揭示了四个不同组分间相互作用的方式。在组成叶酸ECF转运蛋白的四个组分中, FolT与EcfT蛋白有着非常紧密的相互作用, FolT蛋白躺在呈L型的EcfT蛋白的短臂上, 二者通过氢键以及大量的疏水作用力形成异二聚体。EcfA蛋白与EcfA′蛋白则通过RecA结构域和C端结构域相互作用形成另一异二聚体。来自EcfT蛋白的两个α螺旋CH2-3与EcfA/EcfA′蛋白表面凹槽形成的相互作用的界面是稳定这两个异二聚体的主要作用力, 也是负责将EcfA/EcfA′蛋白分解ATP产生的构象变化传递到EcfS/EcfT蛋白的结构基础, 这一点与经典的ABC转运蛋白有着显著不同。虽然EcfT蛋白在不同物种中的同源性非常低, 但是CH2-3却呈现出高度的保守性, 这提示我们, ECF转运蛋白可能采用了一套相同的能量耦合与传递模式。<\/span>

EcfT蛋白位于膜内侧的两个α螺旋CH2-3呈X型, 二者之间存在疏水作用力和氢键相互作用, 稳定了X型构象。CH2-3主要依靠疏水作用力嵌入到EcfA蛋白与EcfA′蛋白α螺旋结构域与RecA结构域形成的表面凹陷中。连接CH2和CH3的R1 loop上存在一个保守的Arg185, 与EcfA蛋白上保守的Asp106形成氢键与盐桥, 而连接CH3与TM5的R2 loop上同样存在一个保守的Arg226, 与EcfA′蛋白上同样保守的Asp102以氢键与盐桥的形式相互作用。这两个Arg在不同物种的EcfT蛋白中严格保守, 前后紧随两个短侧链的氨基酸, 根据之前的报道这两个Arg对于维持ECF转运蛋白的稳定性以及转运活性都非常重要[19]。从结构分析中, 我们推测这两个Arg可以像“锚”一样锚定CH2与CH3, 从而将EcfA与EcfA′蛋白的构象改变通过EcfT蛋白传递到FolT, 对于叶酸ECF转运蛋白的能量耦合与传递起非常重要的作用, 因此, 我们将其命名为XRX motifs。<\/span>

以往ECF转运复合体S蛋白的生化与结构的报道都显示S蛋白对底物有很高的亲和力[16-17,20-22]。在我们获得的FolT蛋白单体中, 同样检测到了叶酸的结合; 然而在对叶酸ECF转运复合体结构与功能的分析过程中, 我们发现复合体中检测不到叶酸的结合。体外的脂质体实验证实我们所获得的复合体具有转运叶酸的生物活力, 所有这些现象提示叶酸ECF转运蛋白在溶液中至少存在另外一种可以结合叶酸的构象——outward-facing构象。由此, 我们提出了叶酸ECF转运蛋白的转运模型: 在outward-facing构象时,FolT的6个α螺旋与膜垂直, 底物结合口袋面向膜外实现底物的识别与结合; ATP水解后, EcfA与EcfA′蛋白的构象的改变通过EcfT蛋白的CH2-3传递到FolT, 从而引起FolT的翻转, 底物结合口袋朝向膜内, 从而将叶酸释放到胞内, 进入inward-facing构象, 也就是我们结构所呈现的构象。在ATP重新结合或者水解后, 转运蛋白又重新回到outward-facing构象。<\/span>

这是迄今第一个ECF型ABC转运蛋白复合体的结构, 也是叶酸跨膜转运蛋白的首个结构。这一研究进展使人们对ABC转运蛋白跨膜转运的机理有了全新的认识: 物质的转运不但可以通过跨膜蛋白“∨”型构象到“∧”型构象的变化来进行, 还可以通过跨膜蛋白的翻转来实现; 同时该模型的提出也为人们理解维生素(特别是叶酸)如何实现跨细胞膜转运的过程迈出了一大步。因为ECF转运蛋白主要存在于厚壁菌门, 包括很多致病菌与益生菌, 因此该结构的解析为新型抗生素与益生菌的设计开辟了一条新路。<\/span><\/p>

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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-48-11-881.jpg","cshort":"

张鹏, 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所研究员。2007年中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所毕业, 获理学博士学位, 荣获中科院院长奖学金。2008年2月–2010年9月在美国普林斯顿大学分子生物学系从事博士后研究工作。期间解析了核黄素ECF转运蛋白S组分RibU的晶体结构(Zhang <\/span>et al<\/em>. Nature, 2010), 首次报道了ECF转运蛋白结合底物的独特方式。2010年10月至今担任中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所研究员, 继续从事ECF转运蛋白跨膜转运机制的研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

张鹏, 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所研究员。2007年中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所毕业, 获理学博士学位, 荣获中科院院长奖学金。2008年2月–2010年9月在美国普林斯顿大学分子生物学系从事博士后研究工作。期间解析了核黄素ECF转运蛋白S组分RibU的晶体结构(Zhang <\/span>et al<\/em>. Nature, 2010), 首次报道了ECF转运蛋白结合底物的独特方式。2010年10月至今担任中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所研究员, 继续从事ECF转运蛋白跨膜转运机制的研究。最新研究工作解析了第一个叶酸ECF转运蛋白复合体的晶体结构, 提出了ECF转运蛋白跨膜转运机制的工作模型(Xu <\/span>et al<\/em>. Nature, 2013)。<\/span><\/p>","ctitle":"叶酸ECF转运蛋白的结构和转运机制","listseq":5,"seqno":"55","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-16-59-063"},{"caddress1":"中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室, 北京 100101","cauthor":"帅 领 李 伟 赵小阳 周 琪*","cintpic":"","clicktime":61,"clong1":"

1 单倍体细胞研究背景<\/span>

单倍体细胞只具有一套染 色体, 没有等位基因的存在, 因而它们在遗传分析、基因功能与性状研究中具有重要的应用价值。单倍体细胞在低等生物如细菌、真菌中普遍存在, 结合这些物种特有的快速增殖能力, 而成为遗传学和基因组学研究的重要工具, 极大地推动了生命科学研究的进展[1-2]。对于哺乳动物, 单倍体细胞仅局限于雌雄配子, 而配子细胞在体外只能存活很短的时间, 极大地限制了哺乳类的单倍体细胞在遗传学筛选研究中的应用。为了获得哺乳类的单倍体细胞, 从上世纪70年代开始, 科学家便利用胚胎分割[3]或孤雌激活卵母细胞[4]等方法构建单倍体胚胎, 并成功地获得小鼠的单倍体胚胎。在小鼠胚胎干细胞成功建系[5]之后, 科学家曾尝试建立小鼠的单倍体胚胎干细胞, 但没有成功。研究证据表明, 由于小鼠单倍体胚胎干细胞在体外培养过程中存在着自发二倍化的现象, 因而导致无法获得稳定的小鼠单倍体胚胎干细胞系[6]。这个问题也成为三十多年来获得哺乳类单倍体细胞的主要障碍。尽管在最新的一些研究中报道, 在人类的癌细胞中存在“近单倍体”的细胞系, 但并不是一类真正意义的哺乳类单倍体细胞系[7-8]。

由于体外诱导单倍体很难发生, 因此从配子获得单倍体细胞是一个可行性较高的策略。由于干细胞和再生医学的兴起, 从配子获得干细胞成为干细胞研究中的一个热点, 有望回避胚胎损害带来的伦理风险, 提供新的获得病人自体干细胞系的途径。我们在2007年利用孤雌激活人类卵母细胞获得的人类孤雌囊胚, 较早地建立了遗传信息完全来自于母本的孤雌胚胎干细胞系[9]。遗传分析检测时发现, 由于卵母细胞发育时染色体重组的影响, 这些孤雌胚胎干细胞系的远端着丝粒杂合性较高。基因组高度纯合的细胞和动物在遗传学研究中具有重要的应用价值。因而我们考虑, 能否建立一个基因组遗传位点纯合的胚胎干细胞系？这样的细胞系, 最可行的来源是单倍体胚胎获得的单倍体胚胎干细胞系, 或者单倍体细胞二倍化后得到的细胞系。那是否能够建立哺乳类的单倍体胚胎干细胞系当时并不清楚。

2 单倍体胚胎干细胞的获得<\/span>

由于可用于基础研究的人类的卵母细胞极为稀缺, 影响了实验进程。因此, 我们回到小鼠中来开展实验, 尝试建立小鼠的单倍体胚胎干细胞系, 以用于遗传学筛选的研究。我们尝试用两种方法去获得小鼠的单倍体胚胎: (1)孤雌激活小鼠的卵母细胞获得孤雌单倍体胚胎; (2)借助体细胞核移植技术[10], 将小鼠的精子头部注射入卵母细胞中并同时去除卵母细胞的遗传物质, 进而获得孤雄单倍体胚胎, 结果表明, 这两种方法都可以获得小鼠的单倍体胚胎(图1)。随后, 我们采用小鼠胚胎干细胞建系的方法将这些胚胎用于小鼠单倍体胚胎干细胞的建系研究[11], 并于2009年分别获得了孤雌和孤雄两种单倍体胚胎干细胞系。由于小鼠单倍体胚胎干细胞存在自发二倍化的现象, 以及当时的单倍体细胞的富集方法尚不完善, 导致我们的单倍体胚胎干细胞随着传代次数的增加而最终全部二倍化。

为了进一步证实单倍体胚胎干细胞的存在, 我们进行了一系列实验进行检测。首先, 将单倍体胚胎干细胞进行DNA含量分析, 结果表明在建系之后5代以内可以检测到单倍体的细胞亚群存在, 但是当传代至10代左右便彻底消失了。核型分析实验同样也印证了这一结果。此外, 我们还设计了一个更加严格的显微注射实验去证明单倍体胚胎干细胞的存在。2009年新加坡国立大学的科学家发现, 将鱼类单倍体胚胎干细胞注射入鱼卵中可以使卵子“受精”, 并且发育成一个完整的个体[12-13]。考虑到哺乳动物中基因印记的影响, 我们选择了孤雄单倍体胚胎干细胞来开展这一实验。我们选取低代次的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞(5代以内)进行卵母细胞胞浆内注射, 然后将得到的胚胎经氯化锶化学激活再移植回假孕母鼠的体内。由于只有二倍体的动物才能够发育到期, 单倍体、三倍体和四倍体胚胎的发育能力受限, 因此如果能够获得到期动物, 则证明注射的细胞为单倍体干细胞, 反之也能证明孤雄单倍体胚胎干细胞可以替代精子与卵母细胞融合完成发育。我们分别选取处于G0/G1期和处于M期的孤雄单倍体胚胎干细胞进行注射; 对于G0/G1期的孤雄单倍体胚胎干细胞, 我们凭借观察挑取直径在8-10微米的光滑核质均匀的细胞得到; 而M期的孤雄单倍体胚胎干细胞, 我们则通过秋水仙素对其进行同步化处理后, 挑选直径在10-12微米的能明显可见纺锤体的细胞得到。通过上述办法我们于2011年8月获得了首只孤雄单倍体胚胎干细胞注射得到的到期胎儿, 从而最终严格地确认了单倍体胚胎干细胞的存在, 并具有可替代精子的特性。2011年, 国际上单倍体干细胞的研究取得了重大的突破, 英国剑桥大学的科学家首次报道了小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞系的建立[14], 随后奥地利科学家也报道了类似的工作[15]。他们通过流式分选技术建立了稳定的孤雌单倍体干细胞系, 并进行了初步的遗传学筛选研究, 表明这一类哺乳类的单倍体胚胎干细胞也是进行遗传学筛选研究的优良工具。但他们的研究存在一定的局限性, 例如, 孤雌单倍体胚胎干细胞是否真的具有多能性; 单倍体胚胎干细胞的转基因研究能否直接从细胞水平传递到动物水平, 这些问题并不清楚。由于孤雌单倍体胚胎干细胞注射到卵母细胞中得到的是孤雌胚胎, 可能不能够发育得到一个到期的个体, 而具有父源印记的孤雄单倍体胚胎干细胞则有可能能够实现这一过程, 我们之前的实验也初步证实了这一假设。因此, 我们针对这些问题开展了更加深入的研究。

根据我们之前的实验结果, 我们改进了流式分选技术, 从而更容易获得稳定的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系。为了使荧光染料Hoechst33342与孤雄单倍体胚胎干细胞的DNA更牢固地结合, 我们在染色的过程中加入了钙泵抑制剂-Verapamil, 使染色更加充分, 单倍体的富集更加的精准。利用这一技术, 我们迅速地建立了27株孤雄单倍体胚胎干细胞系。

3 单倍体胚胎干细胞分化潜能和表观遗传特性<\/span>

这些孤雄单倍体胚胎干细胞具有典型的小鼠胚胎干细胞(ES)的集落, 不仅表达Oct4、Nanog和SSEA-1等多能性标记物, 同时还具有很强的碱性磷酸酶活性。孤雄单倍体胚胎干细胞能够在体外形成拟胚体, 进而可以分化成神经细胞; 在严重联合免疫缺陷鼠体内可以分化形成含三胚层细胞的畸胎瘤, 但流式分析结果表明, 所有的分化细胞都已经变成二倍体细胞, 因此, 单倍体胚胎干细胞是否必须先二倍化以后才具有分化能力, 当时并不清楚。于是, 我们利用携带绿色荧光蛋白(GFP)和多能性报告基因(Oct4-GFP)的孤雄单倍体胚胎干细胞分别进行了嵌合体制作实验, 根据对单倍体来源的荧光细胞进行DNA含量分析来解答这一重要问题。结果表明, 只有在胚胎发生的第6.5天(E6.5)的嵌合体胚胎中能够检测到单倍体细胞的存在, 而在E8.5以后便没有检测到单倍体细胞的存在。后来分析成年嵌合体动物的心、肝、脾和肾四个器官, 发现单倍体细胞在终末分化的成体器官中已全部二倍体化。但是, 在Oct4-GFP背景的孤雄单倍体胚胎干细胞所形成的E12.5的嵌合体胚胎的生殖嵴中, 仍然能检测到表达Oct4-GFP阳性的细胞, 证明孤雄单倍体胚胎干细胞也具有生殖系嵌合的能力。综上所述, 我们得到的孤雄单倍体胚胎干细胞是一类具有多能性的胚胎干细胞, 尽管可能需要经历二倍体化过程才能具有分化能力。


鉴于我们早期实验中发现的孤雄单倍体胚胎干细胞的表观遗传特性, 我们开始研究孤雄单倍体胚胎干细胞获得转基因动物的可行性。我们对早期的注射实验进行了优化, 借助低浓度的Hoechst33342对孤雄单倍体胚胎干细胞进行染色, 然后借助FACS分选的方法得到处于G0/G1期的细胞, 这样不仅使荧光染料对细胞的毒害降低, 同时得到高纯度的G0/G1期的单倍体细胞, 大大提高了我们注射实验获得动物的效率。我们对随机挑选的6个孤雄单倍体胚胎干细胞系进行卵母细胞胞浆内注射实验, 总共获得了24只发育到期的小鼠, 其中有10只健康发育至今。

通过亚硫酸氢盐测序检测发现, 这些孤雄单倍体胚胎干细胞带有精子特有的父源印记, 但与传统的孤雄胚胎干细胞类似, 其印记并不稳定, 在体外培养过程中逐渐向正常受精来源的胚胎干细胞转变, 即母源印记基因也开始表达。随着细胞传代, 孤雄单倍体胚胎干细胞中的某些印记基因(如Snrpn、H19)会部分丢失父源印记, 这种印记的丢失对动物的存活存在重要影响, 在我们获得的24只动物中, 有14只存在发育滞缓等异常而夭折。

4 单倍体胚胎干细胞在转基因研究中的应用<\/span>

实验结果表明, 孤雄单倍体胚胎干细胞既具有无限增殖和多能性等胚胎干细胞的特点, 又具有能够使卵母细胞“受精”而得到健康动物的能力。所以我们尝试利用孤雄单倍体胚胎干细胞进行转基因研究, 并借助卵母细胞胞浆内注射的方法, 直接获得转基因动物。我们挑取了一个携带GFP, 并且能够使卵母细胞受精而获得健康动物的细胞系AHGFP-4进行转基因研究。我们将携带新霉素抗性基因(Neor)的质粒电转到该细胞系中, 通过G418药物筛选后, 我们随机挑取了12个具有新霉素抗性的亚克隆细胞系, 然后将这12个亚系经过扩增后, 利用FACS将其分选, 最终得到了6个仍然维持单倍性并且整合了目的基因的细胞系, 具体方法如图1所示。我们随机选取其中的两个转基因细胞系进行卵母细胞胞浆内注射实验, 得到了23个到期的转基因动物, 这些动物全部携带新霉素抗性基因, 其中有6只存活至今。由此证明, 孤雄单倍体胚胎干细胞是一类可以进行遗传学筛选的优良的工具细胞, 并且可以将引入的转基因突变传递到动物水平, 从而形成了一种新型的构建转基因动物的体系。中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所的李劲松和徐国良的团队也独立完成了相似的工作, 他们在单倍体胚胎干细胞里实现了应用更广泛的基因打靶技术, 但是利用单倍体胚胎干细胞注射获得的打靶动物在围产期死亡[16]。

科学家已经利用孤雌单倍体胚胎干细胞开展了基因筛选的工作, 证实单倍体胚胎干细胞可以成为基因功能研究的重要工具[14-15]。同时, 孤雄单倍体胚胎干细胞具有使卵母细胞受精并获得转基因动物的, 结合功能基因筛选和替代精子的能力, 单倍体干细胞将大大加速功能基因在细胞和个体水平的研究。单倍体干细胞还为不具备生殖系嵌合能力的胚胎干细胞的物种提供了一种新的获得转基因动物的研究线索, 也为辅助生殖研究提供了一个新的研究平台。另外, 单倍体胚胎干细胞还存在诸多问题值得研究, 例如单倍体胚胎干细胞的倍性维持机制目前并不清楚; 单倍体胚胎干细胞的印记的维持机制也不明确, 这些问题的解决均将推动单倍体细胞在遗传学筛选中的应用。<\/p>


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周琪, 中国科学院动物研究所研究员。1996年毕业于东北农业大学, 获理学博士学位; 1997年进入中国科学院发育生物学研究所博士后流动站; 1999年在中国科学院发育生物学研究所获副研究员任职资格; 1999-2002年, 法国国家农业研究中心(INRA)分子发育生物学部博士后; 2002年12月加入中国科学院动物研究所, 任研究员。周琪研究员主要从事细胞重编程机制和命运调控、干细胞多能性获得与维持等研究工作, 并致力于推动再生医学和应用。<\/span><\/p>","cshort2":"

周琪, 中国科学院动物研究所研究员。1996年毕业于东北农业大学, 获理学博士学位; 1997年进入中国科学院发育生物学研究所博士后流动站; 1999年在中国科学院发育生物学研究所获副研究员任职资格; 1999-2002年, 法国国家农业研究中心(INRA)分子发育生物学部博士后; 2002年12月加入中国科学院动物研究所, 任研究员。周琪研究员主要从事细胞重编程机制和命运调控、干细胞多能性获得与维持等研究工作, 并致力于推动再生医学和应用。周琪研究组现已建立多种克隆及转基因动物模型; 国际首次利用体细胞成功克隆大鼠; 利用iPS细胞通过四倍体囊胚注射证明iPS细胞具有与胚胎干细胞相似的多能性; 发现并明确证实决定小鼠(哺乳动物)干细胞多能性的关键基因决定簇; 通过外源因子诱导实现了跨胚层转分化;利用基因修饰的单倍体胚胎干细胞成功获得健康成活的转基因小鼠。现已在Nature、Science、PNAS、JBC、Stem Cells、Cell Research等刊物发表研究论文70余篇, 申请、获得重编程技术发明专利6项: 其研究成果多次受到国际著名科学家的高度评价与国际科技媒体的广泛报导, 其中三项研究成果分别于2003年、2009年及2012年入选我国年度十大科技进展新闻、两院院士评选的十大科技进展或十大科技新闻人物, 尤其是证明iPS细胞多能性的工作还入选了美国《时代周刊》评选的2009年年度十大医学突破。<\/span><\/p>","ctitle":"单倍体胚胎干细胞—哺乳动物基因功能研究的新工具","listseq":6,"seqno":"54","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-16-30-104"},{"caddress1":"中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032","cauthor":"周川苗 王佳伟*","cintpic":"","clicktime":6,"clong1":"

万千的自然环境造就了万千的植物种类, 而各 种植物的开花又具有多样性。不同的植物可以在一 年中不同的季节开花, 还可以在一天中不同的时间 开花。植物按照开花次数来分类, 可以分为单次开 花和多次开花植物。单次开花植物例如竹子, 一生 只开一次花, 然后全株死亡; 多次开花植物可以在每 年的固定时间开花。植物按照生活周期来分类, 可 以分为一年生(annual)、二年生(biennial)及多年生 植物(perennial)。一年生植物在一年内完成生命过程, 然后全株死亡。多年生植物生活周期比较长, 一般 为两年以上[1-3]。

植物由营养生长到生殖生长的转换, 称为开花 诱导, 它直接影响着植物能否正常地繁衍后代, 并直 接关系到农作物的产量。在进化过程中, 植物产生 出一套适应机制, 在外界环境最适宜的条件下开花 结果。通过对一年生植物拟南芥的研究, 目前鉴定 了5条开花途径。春化和光周期途径对外源的环境信号作出反应, 从而调节开花; 而自主、赤霉素和年 龄途径感知内源信号, 影响开花。在不断变化的外 部环境条件和内部生理条件下, 这些途径通过一些 主要的整合基因如SOC1、FT和LFY等实现了对拟 南芥开花时间的精确调控[4-10]。

温度和光照是影响植物开花的最重要的外界 环境因素。大多数冬性一年生或者二年生植物在 种子萌动期或营养生长初期必须经过一定时期的 低温处理(通常为4 °C, 2~8周)才能开花。这一低 温处理一定时期而促进植物开花的作用称为春化 作用(vernalization)。近年来, 通过对拟南芥的研 究, 人们发现FLOWERING LOCUS C(FLC)基因是 受春化途径调控的主要基因。FLC编码MADS-box 转录因子, 是开花时间调控中的抑制因子[11]。FLC 在顶端分生组织和维管组织中分别结合到FLOWERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)启动子的CArG 盒抑制它们的表达, 从而抑制花分生组织决定基因 延迟植物成花[12-13]。作为开花途径中的一个关键因 子, FLC的表达不但受来自环境和生长发育的信号调控, 而且非编码RNA同样参与到FLC在春化中的 表观遗传学修饰, 其中就包括FLC的反向转录本、 内含子上的非编码RNA以及反向转录本启动子区域 的短RNA[14-16]。

光周期是指一天之中, 白天和黑夜的相对长 度。作为兼性长日照植物拟南芥, 长日照条件可以 促进其开花。在长日照条件下, 植物的叶片在接收 到光周期信号后, 转录因子CONSTANS(CO)会快速 积累, 从而激活成花素基因FT的表达促进开花。而 在短日照条件下, CO蛋白不能快速积累激活FT, 从 而抑制开花[17-23]。

年龄和植物激素途径是调控拟南芥开花的重 要内源信号。其中, 植物年龄途径是由一个小分子 RNA(microRNA, miRNA)—miR156调控的。mi- RNA是一类长度约为21 nt、具有基因表达调控能力 的非编码的RNA。miR156是目前已知的植物年龄 途径中最上游的调控分子, 它是介导年龄与植物生 长发育的重要中介分子[10]。miR156的表达受到年 龄调节, 其含量随着植物的生长而逐渐降低, 它的靶 基因SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEINLIKE( SPL)类转录因子的积累则呈现逐渐上升的趋 势。SPL可以直接激活SOC1、FUL和AP1等MADSbox 基因的表达诱导植物开花[10]。miR156的靶基因 SPL9还可以结合到miR172的启动子上促进其表达, 而miR172通过下调AP2类开花抑制因子的表达促进 开花[24]。

赤霉素(gibberellin, GA)是调控植物生长发育 的重要激素之一。在拟南芥中, GA是短日照条件 下开花诱导的关键因子。GA通过与受体蛋白GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1(GID1)结合, 促进转录调节蛋白DELLA的泛素化降解, DELLA 蛋白包括REPRESSOR OF GA1-3 1(RGA), GA INSENSITIVE(GAI), RGA-LIKE1(RGL1)、RGL2和 RGL3[25-27]。GA可以通过激活MADS-box基因和LFY的 表达调控开花。最近的研究发现, DELLA可以和SPL 相互作用, DELLA与SPL异源二聚体的形成降低了 SPL的转录激活活性, 导致下游基因miR172、FUL和 SOC1的激活受到阻遏, 进而延迟了植物的开花[28]。

拟南芥开花的途径并不是孤立的, 而是根据外 部环境条件和拟南芥内在生理条件的变化, 通过控 制一些开花途径的关键整合因子, 激活或抑制下游 花序分生组织基因和花器官基因的表达, 从而使植物适应环境条件和自身生理条件的变化, 最大程度 上优化其生长及发育的需要。目前, 对一年生植物 拟南芥开花途径已经有了比较清楚的了解, 最近对 多年生植物开花调控的分子机理有了新的认识。

高山南芥(Arabis alpina)是一种多年生的草本, 拟南芥FLC的同源基因PERPETUAL FLOWERING 1 (PEP1)调控了高山南芥开花和春化反应。与拟南芥 FLC不同, PEP1仅短暂地被低温抑制, 当植株开花 后会被重新激活[29]。但是对于高山南芥的研究并没 有揭示内源信号途径(如: 年龄途径)对多年生植物 开花调控的贡献。由于多年生植物大多具有生长周 期长, 遗传转化困难等缺点, 我们试图寻找一种新的 适合研究多年生的模式植物。最终, 我们找到一种 称为弯曲碎米芥的多年生草本, 研究内源途径中年 龄途径对开花的贡献及其与其他开花途径的整合。

弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa), 属于十字花 科碎米荠属, 广泛分布于欧洲和亚洲各地, 是多年 生草本。弯曲碎米荠具有以下优点: (1)生长周期快: 从种子萌发到种子成熟约5个月; (2)植物体型小, 易 于实验室操作; (3)稳定的遗传: 弯曲碎米荠是自花 授粉植物; (4)简单高效的遗传转化方式: 弯曲碎米 荠和拟南芥一样, 可以通过浸花法进行遗传转化[30]; (5)与拟南芥基因组的类似性: 弯曲碎米荠同拟南芥 同属于十字花科, 但是却有着明显不同的生活习性, 是比较基因组研究的良好材料。因此, 我们选取弯 曲碎米芥为研究对象。

在实验室温室种植时我们发现, 弯曲碎米芥的 成花诱导需要春化。不经历春化, 弯曲碎米芥则一 直处于营养生长期, 不会抽薹开花。在拟南芥中, FLC是春化途径的关键负调控因子。于是我们首先 利用同源基因克隆的方法, 克隆了弯曲碎米芥中的 FLC(CfFLC)。与野生型相比, CfFLC敲除的转基因 植株不经历春化即可开花。这个结果表明, CfFLC 也是调控春化反应的关键基因。基因表达分析显 示, CfFLC的表达量在春化之前处于一个较高的水 平, 春化之后, CfFLC的表达量明显降低, 但是随着 时间的推移, CfFLC的表达量逐渐上升到春化之前 的水平。这一点在一年生拟南芥和多年生弯曲碎米 芥中是不一样的。在拟南芥中, FLC的表达在春化 之后降到较低的水平, 并且会维持在较低的水平。 CfFLC的这种表达模式与弯曲碎米芥多年生的习性 是相吻合的。

实验中另一个有趣的现象是: 弯曲碎米芥对低 温的感受是依赖于年龄的。幼年的弯曲碎米芥(1~2 周)即使经历春化, 仍不会开花; 只有成年(大于4周) 的植株才能感受低温, 出现正常的春化反应。这一 现象使我们猜想, 年龄途径很可能参与弯曲碎米芥 的春化反应, 于是我们开始探索年龄途径和春化 途径的关系。已有的研究表明, miR156是目前已 知的年龄途径最上游的调控因子。在弯曲碎米芥 中, miR156的含量随着年龄的增加逐渐降低, 它的 靶基因CfSPL9的表达量逐渐上升。这个结果表明, miR156是一类进化上非常保守的小分子RNA。为 了进一步的功能分析, 我们首先构建了miR156上 调和下调的转基因植株。研究发现, 不经历春化, miR156上调和下调的转基因植株都不会开花。但是, miR156下调的转基因植株呈现出明显的成年态化, 幼年(生长1周)的植株即可出现正常的春化反应, 抽 薹开花; 与之相反, miR156上调的转基因植株则呈 现出幼态化, 即便是生长10周的植株仍然对春化反 应不敏感。因此, 年龄途径的miR156设定了春化反 应的敏感性阈值。

在拟南芥中, SOC1是开花整合基因之一。过 量表达弯曲碎米芥的SOC1(CfSOC1)可以不经历 春化即可开花, 表明CfSOC1位于春化途径的下游。 CfSOC1的表达与CfFLC的表达在春化前后呈现出 相反的趋势。幼年和成年的弯曲碎米芥春化前后, CfFLC的表达量都会明显降低, 但是CfSOC1的表达 却明显不同。成年的弯曲碎米芥春化之后, CfSOC1 的表达量明显升高, 而幼年的植株经历春化后, Cf- SOC1的表达量没有变化。我们推测, 幼年的弯曲碎 米芥对春化作用不敏感是因为无法激活下游整合 基因CfSOC1的表达, 而不是对春化途径的负调控因 子CfFLC的抑制。春化前后, CfFLC的表达水平变 化趋势不因miR156的上调或下调而发生变化, 但是 CfSOC1的表达水平变化却随着miR156含量的高低 发生改变。生长1周的miR156下调的转基因植株与 野生型相比, CfSOC1的表达水平在春化之后明显升 高; 而生长5周的miR156上调的转基因植株与野生 型相比, CfSOC1的表达水平在春化之后没有明显变 化。

在拟南芥中, miR156通过miR172促进幼年期到 成年期的转换[24,31]。在弯曲碎米芥中, miR172的含 量随着年龄的增长而逐渐增加。过量表达miR172的转基因植株对春化呈现出不同程度的反应。高表 达miR172的转基因碎米芥可以不经过春化即可开 花。遗传分析表明, miR172与CfFLC处于不同的开 花途径平行调控开花。

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FLC的表达(红色)感受温度变化, 呈现四季振荡状态。其含量在每年的冬天来临之间最高，过冬之后，其含量降至最低。miR156(绿色)感受植物的年龄, 其含量逐渐下降。黄色圆圈代表首次开花时间。弯曲碎米荠的首次开花需要FLC和miR156的含量同时降低到开花阈值线(紫色)以下。在此之前, 弯曲碎米荠处于营养生长期, 而此之后则在每年的春天开花。
The expression of FLC (red line) is oscillating, with the highest level before winter and lowest level in spring. miR156 (green line) is regulated by age. The level of this miRNA is gradually decreased. The first flowering (yellow circle) of C. flexuosa occurs when the levels of FLC and miR156 are below the flowering threshold (violet dot line). C. flexuosa stays in vegetative phase before the first flowering, whereas it shows typical polycarpic growth habit afterwards.
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图1 年龄和春化作用共同调控弯曲碎米荠开花时间
Fig.1 Integration of age and vernalization pathways in C. flexuosa
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以上的研究结果表明, 春化途径和年龄途径共 同调控了弯曲碎米芥的初次开花(图1)。当年龄途径 的miR156含量降低到开花阈值之下, 并且同时经历 春化, 弯曲碎米芥就会初次开花。在此之后, miR156 的含量一直处于开花阈值之下, 是否开花主要取决 于CfFLC的含量, CfFLC的含量在每年的春天降到最 低, 因此弯曲碎米芥在每年的春天开花。年龄途径 和春化途径的偶联与多年生植物的生长习性密切相 关, 它可以确保植物在获得足够的生物量(即进入成 年期)后才能感受外界环境的变化, 开花结果, 繁衍 后代。尽管拟南芥中同样存在年龄途径和春化途径, 但是拟南芥并未出现年龄依赖的春化反应。这表明, 开花的多样性可能是由于不同的物种间, 不同开花 途径贡献率不同决定的。这些结果第一次阐明植物 利用年龄信号对外界环境信号作出反应并且可能影 响植物进化。
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王佳伟, 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所研究员, 博士生导师。2005年毕业于上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 获植物分子遗传学博士学位。2005年至2011年在德国马普发育生物学研究所从事博士后研究。王佳伟研究员主要从事植物小分子RNA的功能研究, 鉴定了调控植物生长发育的年龄途径。从事科研工作以来共发表研究论文16篇, 代表性研究成果发表在Cell、Science、eLife、PNAS、Plant Cell和Plos Genetics等国际核心期刊上。<\/span><\/p>","cshort2":"

王佳伟, 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所研究员, 博士 生导师。2005年毕业于上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 获植物分 子遗传学博士学位。2005年至2011年在德国马普发育生物学研究所从事博 士后研究。王佳伟研究员主要从事植物小分子RNA的功能研究, 鉴定了调控 植物生长发育的年龄途径。从事科研工作以来共发表研究论文16篇, 代表性 研究成果发表在Cell、Science、eLife、PNAS、Plant Cell和Plos Genetics等国 际核心期刊上。2012年在Plant Cell上发表论文, 解析了赤霉素诱导植物开花 的分子机理。2013年在eLife杂志上报道, 糖是植物的体内年龄途径的上游调 控因子。最近, 在Science杂志上发表了关于多年生草本植物开花机理的最新 研究成果(Zhou CM, et al. Science, 2013)。<\/span><\/p>","ctitle":"多年生草本植物开花的分子机理","listseq":7,"seqno":"53","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-15-07-707"},{"caddress1":"中国科学院上海巴斯德研究所, 中科院分子病毒与免疫重点实验室, 上海 200031","cauthor":"景庆庆 程 秀 江陆斌*","cintpic":"","clicktime":6,"clong1":"

疟疾作为当前人类三大传染病之一, 是人类疾病防治领域的一大难题和挑战, 特别是疟原虫复杂的生活史和多变的病原相关基因表达调控方式使得对其的防治任务更加艰巨。这其中一个重要的制约因素是目前对调控疟原虫基因表达的表观遗传机制缺乏透彻的了解[1]。在可以感染人类的五类疟原虫当中, 最严重的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)每年在全世界范围内感染3亿以上人口, 并造成超过100万的死亡病例(其中, 儿童占95%以上)[2]。在我国, 疟疾虽然在建国初期得到了有效控制, 但随着我国与非洲、亚洲和南美洲等发展中国家逐步建立起广泛的国际间合作, 近年来我国的劳务输入、输出人口激增, 输入性疟疾在华中、华南地区, 尤其是一些热带省份呈显著上升趋势[2]。目前, 在我国已有上千个行政县报道有疟疾感染病例, 既给人民生活带来了沉重的经济负担, 亦导致我国政府在预防和治疗疟疾中的政府财政压力不断增加。而当前并无有效的疟疾疫苗, 治疗疟疾最有效的手段是以我国科学家发现的青蒿素为主的复合抗疟药治疗。但近年来在我国云南以及柬埔寨、泰国等地已出现了具有青蒿素潜在抗性的恶性疟原虫[3]。因此研制开发疟疾疫苗和新型抗疟药刻不容缓, 并具有重大的社会和经济意义。显然, 疟疾疫苗和抗疟药的研发成功将得益于对恶性疟原虫关键性致病基因表达调控机制的了解。<\/span>

大量致病病原体包括细菌、真菌以及寄生虫都可利用抗原蛋白相互排斥性表达策略, 在人体内成功地实现免疫逃逸并建立长期稳定的感染[1]。由于目前对这类表达调控的分子机制尚不清楚, 因而严重阻碍了对病原体在人体内关键性免疫逃逸机制的研究。越来越多的证据表明, 表观遗传机制在这类基因的表达调控过程当中起到了关键性作用[4]。恶性疟原虫感染人体过程中最重要的时期是其寄生在人体红细胞中的无性繁殖时期(红内期), 疟疾患者在该时期出现临床症状甚至死亡。红内期恶性疟原虫表达的一类最主要的抗原蛋白PfEMP1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1)可结合人体内皮受体, 并介导两大严重的疟疾并发症(脑型疟疾和黑热尿), 并导致死亡[5]。研究表明, 针对PfEMP1的抗体可导致恶性疟原虫无法结合血管内皮, 从而在随血液流经脾脏时被巨噬细胞清除[6]。恶性疟原虫基因组含有约60个编码PfEMP1的基因(var基因家族), 但每个单独的疟原虫在红内期只能转录一个var基因[4]。这种由表观遗传机制调控的抗原蛋白相互排斥性表达策略可以帮助恶性疟原虫轻易地逃避人体针对单一PfEMP1产生的免疫反应[1]。虽然恶性疟原虫属于单细胞真核生物, 但由于不具有DNA甲基化和RNAi机制[7], 组蛋白修饰和lncRNA是其主要的表观遗传调控因子。在恶性疟原虫红内期总共48 h的三个生长阶段中(环状体、滋养体和裂殖体), var基因只在环状体阶段表达。生物信息学分析发现, 恶性疟原虫共编码9个组蛋白赖氨酸甲基化酶(PfHKMT)和3个去甲基化酶(PfHKDM)[8]。然而, 这些组蛋白修饰酶中对var基因转录起关键作用的调控因子及其具作用的分子机制之前尚不清楚。我们的最新研究发现, var基因的转录沉默与一个约280 kDa大小的组蛋白赖氨酸甲基化酶(PfSET2vs)及其修饰的组蛋白H3K36me3有关; 而var基因的转录激活则与var基因内含子区启动子转录的一个负链长片段非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)有关[9]。<\/span>

在探寻控制var基因家族表达沉默关键因子的过程中, 我们首先尝试了利用双同源重组技术在恶性疟原虫地理株系3D7中敲除所有12个组蛋白赖氨酸甲基化修饰酶基因。最终我们成功地在恶性疟原虫体内分别敲除了4个含有SET功能域的PfHKMT基因以及3个PfHKDM基因, 并获得了相应的单克隆虫株。通过对这些基因敲除疟原虫的全基因组表达谱进行表达芯片并结合定量PCR分析, 我们发现在敲除了PfSETvs基因(PfSETvsΔ)的恶性疟原虫(3D7SETvsΔ)群体中, 几乎全部的var基因在环状体阶段都得到了表达。而敲除其他任意一个PfSET基因以及PfHKDM基因都不会改变var基因的表达情况。而且, 与var基因家族类似的其他多变基因家族(rifin和stevor)中的部分成员在3D7SETvsΔ中表达水平同样得到了上调。同时, 我们在不同于3D7的另一个恶性疟原虫地理株系Dd2中敲除PfSETvs基因后, 也发现了同样的表型, 这一结果提示PfSETvs可能广泛参与了var基因家族的转录沉默[9]。<\/span>

PfSETvsΔ是否能导致在单个恶性疟原虫中同时转录多个var基因并表达不同的PfEMP1在被侵染红细胞的表面呢？为了证实此猜想, 我们首先采用RNA荧光原位杂交技术(RNA-FISH)来检测不同类型的var基因是否在单个3D7SETvsΔ中都得到了转录。结果发现, 不同类型的var基因家族在3D7SETvsΔ细胞核内能够共同表达。有意思的是, 我们还发现所有var基因的转录都发生在疟原虫核外周的某一特定位置, 说明所有var基因共同拥有一个特定的转录激活位点。在进一步的活细胞免疫荧光分析中, 我们也证实了多个不同的PfEMP1蛋白能够在同一个被3D7SETvsΔ感染的红细胞膜表面表达[9]。<\/span>

生物信息学分析发现, PfSETvs与果蝇中控制组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化修饰(H3K36me3)的ASH1蛋白同源[10]。但组蛋白修饰H3K36me3一直被研究者相信只存在于活性转录基因的3′末端, 并通过与RNA多聚酶II相互作用, 调节基因的转录延伸[11]。对于PfSETvs控制的H3K36me3是否真正具有抑制var基因家族转录的功能？恶性疟原虫中是否存在两类功能截然相反的H3K36me3？带着这些问题, 我们首先利用染色质免疫共沉淀结合二代测序(ChIP-seq)技术研究了H3K36me3在野生型和3D7SETvsΔ疟原虫中的染色体分布情况。我们的结果显示, PfSETvsΔ导致所有60个var基因编码区内的H3K36me3分布显著减少。更重要的是, ChIP-qPCR分析发现, 该组蛋白修饰在每类var基因的转录起始位点区域也显著减少。通过将一个分子标记肽HA与PfSETvs融合表达, 我们进一步揭示PfSETvs也在沉默的var基因中的这些区域内分布。我们的结果表明, PfSETvs通过催化var基因转录起始位点区域中H3K36me3的形成, 抑制了var基因的表达。H3K36me3已被证实在其他真核生物基因中可以通过结合组蛋白去乙酰化酶, 从而在活性转录的基因内部抑制内源错配转录的产生[11]。在恶性疟原虫体内, PfSETvs控制的H3K36me3可能采用相同的机制, 在var基因的转录起始位点区域抑制该基因mRMA的转录。同时, 我们也证实在其他恶性疟原虫基因中, 不受PfSETvs催化的H3K36me3也同样存在于活性转录基因的3′末端, 并和其他真核生物中的H3K36me3行使相同的功能。值得注意的是, var基因的内含子启动子能转录产生一段负链lncRNA[12]。我们发现, PfSETvsΔ不但激活了所有var基因的转录, 也同时激活了由var基因内含子介导的这类负链lncRNA的转录。当PfSETvs及其催化的H3K36me3在var基因的转录起始位点和内含子启动子区域大量分布的时候, var基因和相对应的负链lncRNA同时都被抑制[9]。<\/span>

最近的研究表明, PfEMP1是体液免疫的关键靶点[13], 但由于编码PfEMP1的var基因家族相互排斥性表达机制的存在, 因此只有通过常年反复被恶性疟原虫感染, 人体的免疫系统才能够识别足够多的PfEMP1, 从而缓慢地获得针对恶性疟原虫的免疫保护[13]。我们研究中构建的转基因恶性疟原虫克隆因为能够同时表达大多数PfEMP1, 其对于多价疟疾疫苗的开发将具有显著的应用潜力[14]。同时, 对于关键性组蛋白赖氨酸甲基化修饰酶的进一步研究也将为研发新型抗疟药提供全新的靶位点[14]。<\/span>

我们的工作证明了在恶性疟原虫中, H3K36me3对基因的表观遗传学调控功能至少可以分为两类不同机制: 一类是依赖于PfSETvs的对基因转录的抑制作用; 另一类则是与RNA多聚酶II相互作用, 调节基因的转录延伸, 并且能够抑制活性转录基因内部对乙酰化组蛋白的结合[15], 从而抑制内源错配转录起始[11]。根据已有报道, 在与PfSETvs同源的其它真核生物SET蛋白中, 线虫的MES-4[16]及果蝇的ASH1[17]可能具有与PfSETvs类似的作用机制。这个机制也有可能解释为什么在斑马鱼精子中发现的部分基因沉默现象[18]以及小鼠胚胎干细胞和纤维原细胞着丝粒的异染色质化[19]都与H3K36me3有关。而且, 在这一研究中新发现的var基因负链lncRNA也可能通过与PfSETvs相互作用[20], 共同参与对var基因的相互排斥性表达机制的调控。我们的工作首次在真核生物中发现, H3K36me3对基因转录的抑制作用并系统阐明其在var基因家族转录沉默中的分子作用机制, 对于完整理解表观遗传机制在疟原虫乃至其他真核生物基因转录调控中的功能具有重大意义。但同时, 关于抗原蛋白相互排斥性表达的另一大核心问题: 为什么只有单一的抗原基因能够获得表达？目前, 仍然所知甚少。在前期研究中, 我们发现每200个恶性疟原虫克隆Dd2中只有1个能够表达一个介导了疟原虫侵染红细胞的关键性受体蛋白RH4, 而表观遗传机制也参与了对该蛋白表达的调控[21]。与var基因相关的PfSETvs也许可能采取了类似的调控机制(图1)。相信后续围绕PfSETvs及var基因负链lncRNA展开的进一步研究将能够对解答上述问题提供重要的理论依据。<\/span>


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恶性疟原虫组蛋白赖氨酸甲基化酶(PfHKMTs)和去甲基化酶(PfHKDMs)通过催化组蛋白不同位点的赖氨酸甲基化, 可调控致病基因如var、DBL、RH基因家族的转录活性, 进而控制恶性疟原虫侵染人体过程中的免疫逃逸反应及其对红细胞的不同侵染路径。
Lysine methylation/demethylation of histones is catalyzed by a group of proteins called histone lysine methyltransferases (HKMTs)/histone lysine demethylases (HKDMs) in many eukaryotes including P. falciparum. It has been shown that these histone modifications are epigenetic factors in controlling expression of some parasite virulence genes including var, DBL, RH gene families used during immune evasion to avoid human antibody responses and various invasion pathways of the human erythrocyte by parasites.
图1 组蛋白赖氨酸甲基化修饰对恶性疟原虫致病基因转录的调控模型
Fig.1 Schematic of histone methylation/demethylation signaling in regulating P. falciparum virulence genes
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参考文献 (References)<\/span>
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江陆斌, 中国科学院上海巴斯德研究所研究员。2003年7月毕业于中国科学院上海植物生理生态研究所, 获得博士学位; 博士期间主要从事口蹄疫疫苗的研究开发工作。2003年11月至2011年11月在美国国立卫生研究院从事博士后研究; 研究集中于恶性疟原虫致病及抗药机制、寄生虫表观遗传学、疟疾疫苗开发等领域。发现了表观遗传机制对恶性疟原虫侵染红细胞初期阶段的调控作用及一类可应用于疟疾多价疫苗开发的抗原蛋白(PNAS, 2010; PNAS, 2011), 获2010年度美国国立卫生研究院年度成就奖。<\/span><\/p>","cshort2":"

江陆斌, 中国科学院上海巴斯德研究所研究员。2003年7月毕业于中国科学院上海植物生理生态研究所, 获得博士学位; 博士期间主要从事口蹄疫疫苗的研究开发工作。2003年11月至2011年11月在美国国立卫生研究院从事博士后研究; 研究集中于恶性疟原虫致病及抗药机制、寄生虫表观遗传学、疟疾疫苗开发等领域。发现了表观遗传机制对恶性疟原虫侵染红细胞初期阶段的调控作用及一类可应用于疟疾多价疫苗开发的抗原蛋白(PNAS, 2010; PNAS, 2011), 获2010年度美国国立卫生研究院年度成就奖。2012年2月起担任中国科学院上海巴斯德研究所研究员和课题组长, 继续从事恶性疟原虫致病基因表观遗传调控机制的研究。发现组蛋白修饰H3K36me3是导致恶性疟原虫var基因家族转录沉默的关键因子(Jiang L, et al. Nature, 2013)。<\/span><\/p>","ctitle":"探秘恶性疟原虫免疫逃逸的表观遗传调控机制","listseq":8,"seqno":"52","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-05-20-10-41-57-554"},{"caddress1":"(同济大学医学院干细胞研究中心, 上海 200092)","cauthor":"薛志刚* 刘振山 冯 云","cintpic":"","clicktime":5,"clong1":"

哺乳动物早期胚胎发育是一个复杂的过程, 包 括一系列重要的发育阶段: 卵母细胞的成熟、受精 和着床前胚胎发育。在形态变化上, 可分为三个主 要阶段: 卵裂(细胞数量增加)、紧密化(极化和扁平 化)和囊胚形成(形成囊胚腔)。在基因表达、蛋白水 平及表观遗传等方面也发生了一系列的变化: 母源 RNA和蛋白质的降解以及胚胎自身的基因组激活 (zygotic genome activation, ZGA)[1-2]; 父源基因组的 主动去甲基化[3-4], 母源基因组的被动去甲基化[5]; 组 蛋白的修饰变化[6-8]等特征。

基因表达网络决定细胞的功能及特性, 因此, 破译基因在人类胚胎发育过程中时间和空间的表达 特性, 是了解早期发育过程至关重要的一步。已有 研究通过定量PCR(quantitative PCR, qPCR)和基因 芯片技术阐述了人类多个胚胎、单胚胎或单个卵裂 球的转录谱, 确认了不同胚胎植入前阶段参与胚胎 发育的重要基因。利用基因芯片技术, Dobson等[9] 检测了人类早期胚胎第二和第三天基因表达模式, 发现卵母细胞成熟和胚胎发育最初几天的转录水平 显着下降, 表明与配子特性相关RNA的降解是胚胎 发育所必需的, 确定了卵子–合子转变基因; Li等[10] 检测卵母细胞、4-细胞和8-细胞期基因表达模式, 发 现一些合子的基因表达在4-细胞胚胎阶段就已经发 生; Assou等[11]利用数据库已有的数据和本实验室的 数据, 分析发现WNT和转化生长因子-β(transforming growth factor beta, TGF-β)两种信号通路参与卵母细 胞及早期胚胎发育过程, 还分析了人类5天胚囊期滋 养外胚层与3天胚胎的基因表达, 发现了各自特异表 达基因, 并确定胚胎–滋养层转变(embryo-trophectoderm transition)基因[12]; Vassena等[13]检测了人类早期 胚胎基因表达, 发现胚胎基因组激活发生在2-细胞 期。Wells等[14]采用反转录和实时荧光定量PCR检测 了人类早期胚胎发育过程中DNA损伤和细胞分裂相 关基因的表达模式, 结果表明不同的基因表达模式 能够表征胚胎的不同发育阶段。然而, 这些研究只 局限于少量已知编码蛋白的相关基因。长期以来, 由于受到样本细胞数少或测序技术平台不足而无法 定量分析的制约, 对哺乳动物特别是人类的早期胚 胎发育基因调控知之甚少。

单细胞RNA测序(single-cell RNA-sequencing, SCRS)是分析单个细胞或微量RNA中基因组表达的 一个强有力的技术。与微阵列技术相比, SCRS能检 测出更多的转录组, 灵敏度更高; 既能分析同一基 因的多个转录本及其对应的蛋白类型, 也能检测已 知基因中新的剪接点; 还具有准确度高、噪音低等 优点。因此, SCRS为以高分辨率研究早期胚胎中的 基因调控提供了前所未有的机遇。Tang等[15]利用 SCRS方法, 发现小鼠囊胚细胞1 753个未知剪接点, 同时发现有8%~19%的基因在同样的卵母细胞中有 两种或两种以上不同的表达, 证明了单细胞转录组 的多样性和复杂性。Yan等[16]利用SCRS方法, 发现 人早期胚胎发育过程中22 687个母源表达的基因, 其中包括8 701个长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA); 还新发现了253个蛋白编码基因和 2 733个lncRNA, 并且观察到不同时期表达基因的 转录本以及lncRNA存在动态变化。我们利用SCRS 方法, 发现原核期与受精卵胚胎聚类关系较近, 而与 卵母细胞和分裂胚胎关系较远, 说明1-细胞期胚胎 具有特异的转录组模式; 对人和小鼠1-细胞期与成 熟卵母细胞的转录组比较分析, 发现人类和小鼠表 现出保守且轻微的ZGA[17], 而Yan等[16]和Vassena等 [13]发现此基因组激活期发生在2-细胞期。基于单核 苷酸变异(single-nucleotide variants, SNV)和单核苷酸多态位点(SNP), 我们发现在人类早期胚胎发育 各阶段中存在着父亲或母亲来源的单等位基因表达 差异。加权基因共表达网络分析(weighted gene coexpression network analysis, WGCNA)显示, 胚胎早 期发育各阶段中的细胞周期、基因调控、蛋白质翻 译以及代谢通路的转录变化是以分步进行的方式按 顺序发生。我们发现了驱动胚胎早期发育各阶段的 关键候选基因, 并确认早期发育调控机制在人类和 小鼠两物种间存在保守性, 仅在发育特异性和时序 上有所差异, 从而证明了哺乳动物早期胚胎发育进 化上的共性(图1)。

在早期胚胎发育过程中, 表观遗传信息起了重 要作用。已有研究发现miRNA[18-19]、组蛋白修饰[7-8] 和DNA甲基化[20-21]等表观遗传标记在胚胎发育中动 态变化, 并起重要作用。DNA甲基化是一种重要的 表观遗传修饰方式, 能够调控基因表达、基因印记 和胚胎的发育过程。在人类, 受精后几个小时内来 源于精子的父源DNA发生迅速的主动去甲基化, 目 前其机制知之甚少, 但研究发现多种DNA修复酶参 与其过程[22]; 而来源于卵子的母源DNA在2-细胞期 后随着DNA的复制被动去甲基化。Smith等[20]首次 在基因组水平上检测了小鼠胚胎发育过程中DNA 甲基化的变化, 发现精子与受精卵间以及ICM与移 植后胚胎间存在两个重要的转变, 并且卵母细胞能够体现早期胚胎DNA甲基化模式。而Jiang等[21]以 斑马鱼为动物模型, 发现早期胚胎选择性地继承精 子DNA甲基化图谱, 而卵母细胞的DNA甲基化在16- 细胞期后通过细胞分裂逐渐丢弃, 并重新编程为类 似精子DNA甲基化的模式。这也许是不同物种间早 期胚胎发育存在DNA甲基化变化差异。鉴于DNA 甲基化在调控基因表达的作用及在基因组水平上对 人类早期胚胎发育的DNA甲基化研究尚未报道, 因 此, 在人类早期胚胎发育过程中, 阐明DNA甲基化的 变化将能够进一步了解基因表达的动态变化。

此外, 我们的研究工作还系统分析了哺乳动物 早期胚胎全能细胞的增殖、分化过程, 获得了细胞 分裂各阶段的重要分子标记, 并证明单细胞RNAseq 技术能用于转录组定量分析, 找到基因印迹等在 基因调节区域上的遗传和/或表观遗传学改变所导 致的表达缺陷。对该研究中发现的人类胚胎早期发 育各阶段的关键候选基因的进一步研究, 必将为改 善人类辅助生殖技术和提高人口出生质量提供科学 依据和技术支持。<\/p>




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应用VisANT软件列举人类桑椹胚和小鼠8-细胞期胚胎各主要模块前300个连接的网络连接可视化。高度连接的模块内部枢纽基因(至少连接20个其他基因)的颜色为红色; 箭头指示为人类和小鼠网络共有的重要基因。
VisANT was used to visualize network connections of the top 300 connections for each of the major modules associated with human morula and mouse 8-cell emryo stages. Highly connected intramodular hub genes (connected to at least 20 other genes) are colored in red. Arrows indicate top genes that are found in both human and mouse networks.
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图1 枢纽基因及相关功能的模块可视化
Fig.1 Module visualization of hub genes and associated function
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薛志刚, 同济大学再生医学系干细胞研究中心研究员。2006年6月毕业于中南大学医学遗传学国家重点实验室, 获博士学位, 主要从事肿瘤的基因治疗。2006年7月~2007年11月, 任中南大学医学细胞遗传学国家重点实验室讲师, 主要负责基因治疗和干细胞相关的研究工作。2007年11月~2009年4月在美国加州大学洛杉矶分校人类遗传学系从事博士后研究, 从事干细胞和表观遗传学研究和转化医学工作。<\/span><\/p>","cshort2":"

薛志刚, 同济大学再生医学系干细胞研究中心研究员。2006年6月毕业于中南大学医学遗传学国家重点实验室, 获博士学位, 主要从事肿瘤的基因治疗。2006年7月~2007年11月, 任中南大学医学细胞遗传学国家重点实验室讲师, 主要负责基因治疗和干细胞相关的研究工作。2007年11月~2009年4月在美国加州大学洛杉矶分校人类遗传学系从事博士后研究, 从事干细胞和表观遗传学研究和转化医学工作。2009年5月被聘为同济大学再生医学系干细胞研究中心副教授, 主要从事发育生物学、DNA甲基化在干细胞分化中的分子和细胞学机制研究以及探讨调节神经细胞功能的具体机制。2013年, 采用单细胞RNA测序技术揭示了人类和小鼠早期胚胎的遗传程序, 研究成果发表在Nature杂志上。作为课题负责人获得国家自然科学基金资助两项, 多次作为科研骨干参与国家基金委、科技部、教育部等科研项目。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"哺乳动物早期胚胎发育的遗传程序","listseq":9,"seqno":"51","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-05-20-10-41-08-273"},{"caddress1":"(中国科学院上海药物研究所, 中国科学院受体结构与功能重点实验室, 上海 201203)","cauthor":"谭秋香 吴蓓丽*","cintpic":"","clicktime":4,"clong1":"

据世界卫生组织统计资料显示, 目前全球约有4 000万艾滋病患者, 约占世界人口总数的1/150, 而且该数字还在以每天1.6万的速度递增[1]。因此, 研发抗艾滋病药物迫在眉睫, 了解人免疫缺陷病毒(艾滋病毒, human immunodeficiency virus, HIV)的入侵以及感染的机制对于研发抗艾滋病药物尤为重要。目前, 已知HIV-1病毒主要通过病毒表面糖蛋白gp120与细胞表面受体CD4结合, 然后与共受体CCR5或CXCR4相互作用, 引起病毒的另外一种糖蛋白gp41的构象变化, 从而实现病毒入侵[2-5]。此外, 最近Melikyan等[6]的研究称, HIV也可能通过内吞的方式进入细胞, 但仍未被证实。为了阐明HIV-1病毒侵入细胞的分子机制, 科学家们进行了大量的研究工作。经过努力, 研究人员在结构生物学领域取得了多项突破, 其中包括gp120与CD4复合物的结构解析[7], 而HIV-1病毒共受体CCR5和CXCR4的结构与功能关系一直未能被明确阐明。这两种共受体属于G蛋白偶联受体超家族(G protein-coupled receptor, GPCR), GPCR是人体内最大的受体蛋白家族, 与多种人体疾病密切相关, 超过40%的上市药物以GPCR为作用靶点[8-9], 其研究价值巨大。但由于GPCR在天然组织中含量极低, 且存在多种功能和构象状态, 因此难以纯化和结晶, 使得其三维晶体结构的解析极具挑战性, 目前国际上仅有少数几个实验室有解析GPCR晶体结构的能力, 这也成为制约以GPCR为靶点的药物研发的重要因素。

早在20多年以前, 科学家们就针对抗艾滋病毒药物的研发展开了一系列的研究, 主要集中在以下几个方面: (1)抗HIV病毒疫苗的研发; (2)阻断HIV病毒糖蛋白gp120与CD4结合的药物的筛选; (3)利用CCR5缺失型供体进行骨髓移植; (4)研发共受体CCR5或CXCR4的小分子抑制剂。在这些思路中, 人们最先想到的是抗病毒疫苗的研发, 但HIV病毒变异较快且难以控制, 这给疫苗研发带来了巨大困难; 同时, 由于HIV病毒的感染力强, 即使减活疫苗也可能使接种者感染, 所以接种抗HIV病毒疫苗存在很大的风险[10-12]。科学家研发出一种风险相对较低的新型抗HIV病毒疫苗, 但它也只能通过一定程度上抑制HIV病毒的复制速度而延缓艾滋病的发病, 并不能完全阻断病毒的传播[10]。人们也尝试阻断HIV病毒表面糖蛋白gp120与CD4的结合, 研发出一系列gp120的抗体和小分子抑制剂, 但都由于缺乏化疗效果及HIV变异太快而失败[13]。与此同时, 利用天然CCR5基因缺失型的供体进行骨髓移植成功治疗艾滋病的例子给人们带来了希望, 但CCR5基因自然缺失的人数极少且骨髓移植配对成功率非常低, 限制了这一技术的使用[14-16]。目前, 仅有的少数成功案例已经在一定程度上证明了CCR5基因的改变在抑制HIV病毒感染人体细胞的同时不会显著影响机体的其他生理功能, 其他很多研究也证实了这一点[17-19]。因此, HIV-1的共受体CCR5和CXCR4成为新型抗HIV病毒药物研发的重要靶点, 而其高分辨率三维结构的解析无疑是基于结构的药物研发的首要难题。

为了进一步深入理解HIV病毒感染细胞的分子机制, 同时为抗HIV病毒感染新药研发提供基础, 我们开始着手于HIV-1共受体CXCR4和CCR5的三维结构解析工作。第一个瓶颈是如何提高蛋白稳定性并增加其产量, 为了解决这一难题, 我们尝试了多种方法。首先, 在蛋白纯化和结晶的过程中添加配体分子以稳定受体蛋白的构象。通过对大量配体的筛选, 我们发现小分子拮抗剂IT1t及环肽CVX15对于稳定CXCR4的构象最为有利, 目前唯一上市的口服类抗艾药物Maraviroc(马拉维若)则可有效提高CCR5蛋白的稳定性。受体与配体复合物的三维结构信息可以帮助我们更为直观地理解这些抑制剂分子与受体分子相互作用的机制, 从而指导未来的新型药物研发。其次, 大量实验数据表明, 在GPCR蛋白的第三个胞内Loop(ICL3)区域插入合适的可溶蛋白片段能够显著提高蛋白的热稳定性和产量[20-21]。经过筛选和优化, 我们发现在CXCR4的ICL3区域插入T4溶菌酶(T4 lysozyme, T4L)能够显著提高其热稳定性, 而在CCR5的ICL3区域插入红素氧还蛋白(Rubredoxin), 效果要显著优于其他6种融合蛋白; 插入位点的选择也直接影响蛋白分子在结晶过程中的相互作用和堆积, 因此必须找到一个合适的插入位点, 必要时需要通过删除和添加氨基酸改变连接肽段的长度。

另外, 由于受体分子N末端及C末端区域通常活性较大, 截除N端或C端的部分区段也可能有效提高蛋白的稳定性。CXCR4和CCR5的N端在与天然配体趋化因子以及gp120蛋白的结合中发挥重要的作用[22-30], 我们的筛选实验结果表明, 删除这两种受体蛋白的N末端残基显著降低了蛋白的表达量和稳定性, 而在C末端进行适当截短则可改善蛋白样品的质量, 提高蛋白的稳定性和均一性。除此之外, Roth等[30]的研究表明, 氨基酸突变也是一种可有效提高GPCR蛋白稳定性的方法, 因此我们采用计算机辅助设计的方法对CXCR4和CCR5的三维结构进行模拟, 选择性地在某些位点进行点突变实验。结果表明, 在CXCR4中氨基酸突变L125W和T240P能够显著提高蛋白的热稳定性; 在CCR5中, C58Y、G163N、K303E、A233D等四个单点突变均能提高蛋白热稳定性, 四个突变组合后则能够达到最佳效果。经过一系列改造之后, 蛋白稳定性得到了充分的提高, 随后通过测定改造后的受体与配体的结合能力, 并与野生型蛋白进行比较, 以确定蛋白分子改造不影响受体分子构象。

获得了稳定的蛋白样品, 接下来要解决的另一瓶颈问题是蛋白质结晶。我们采用膜蛋白脂立方相(lipidic Cubic Phase, LCP)结晶技术进行CXCR4和CCR5蛋白质的结晶实验, 模拟膜蛋白的天然脂环境, 进一步提高受体分子的稳定性和结晶能力。此外, 我们利用荧光淬灭恢复(fluorescence recovery after photo-bleaching, FRAP)方法对上万种溶液条件进行高通量筛选, 可大大提高筛选效率。获得初始蛋白质结晶条件后进行细致优化, 最终得到分辨率为2.5~3.2埃的五种CXCR4晶体结构和分辨率为2.7埃的CCR5晶体结构[19,31]。

比较CXCR4和CCR5的晶体结构, 我们发现这两种共受体整体结构类似(图1), 都具有典型的GPCR七次跨膜螺旋结构和两对保守的二硫键。与其他已知的GPCR结构相比, CXCR4的配体结合位点更加靠近胞外, 配体结合口袋体积更大、开口也更宽。随后解析的CCR5结构显示, 其配体结合口袋比CXCR4的更深、开口更大。不同种类的HIV-1病毒使用不同共受体感染人体细胞, 研究表明, 使用CCR5的HIV-1病毒主要在病毒传播过程中起作用, 以CXCR4作为共受体的HIV-1病毒则在感染后期才会出现, 往往导致病情恶化发展成艾滋病[3,6], 两种共受体的配体结合口袋的差异为HIV-1病毒的共受体选择性提供了结构基础。为了进一步深入了解HIV-1病毒对共受体的选择性, 我们通过比较CCR5和CXCR4的结构, 并搭建了这两种共受体与gp120的第三个可变区——V3 loop(研究表明, V3 loop是HIV-1病毒使用哪种共受体的主要决定因素[32-33])的复合物模型, 发现这两种受体在配体结合区域的一些微小差异可能是造成不同类型HIV-1病毒对共受体具有选择性的主要原因, 这些差异包括电荷分布和由氨基酸侧链造成的空间位阻。这些发现帮助我们从分子结构的角度进一步理解HIV-1病毒的向性(HIV-1 tropism), 同时有助于开展针对不同类型HIV-1病毒的新型药物研发。

以往研究表明, CCR5的N端及胞外Loop区域是CCR5与其天然配体趋化因子和gp120结合的主要位点, 在细胞信号传导和HIV-1病毒感染中起着重要作用[22-27]。而Maraviroc是通过一种变构机制抑制CCR5与趋化因子和gp120的结合[34-36], 但是这种抑制作用的分子机理一直未能被明确阐明。CCR5结构显示Maraviroc位于受体跨膜螺旋区内部, 与CCR5的N端和胞外Loop区无相互作用, 其结合位点与人们公认的趋化因子和gp120的主要结合位点没有重叠, 这为我们深入理解这种药物分子的变构调节机制提供了依据。此外, CCR5结构证明Maraviroc作为一种反向激动剂, 可将CCR5的构象稳定在一种非活性状态。因此, 这种药物分子是通过一种间接性机制达到抵抗病毒感染的目的, 通过改变CCR5的构象, 使其处于一种HIV病毒非敏感的状态, 从而阻断病毒与CCR5的结合, 使得病毒无法感染人体细胞。相比之下, CXCR4结构中的抑制剂分子IT1t和CVX15与CXCR4的胞外Loop区紧密相互作用, 可直接形成空间位阻阻断CXCR4与天然配体CXCL12和gp120的结合, 起竞争性抑制作用。CCR5和CXCR4的结构揭示了HIV-1病毒共受体与各自抑制剂分子的相互作用模式, 可以帮助人们在分子水平理解这些配体分子的作用机理, 有助于在生物学角度进一步研究艾滋病毒, 并促进此类作用模式的靶向药物研究。

很多研究表明, CXCR4能够形成同源或异源二聚体[37-38], 并参与调节细胞信号转导。我们的研究发现, 虽然分子堆积方式不同, 但在五种CXCR4晶体结构中, CXCR4分子都形成一致保守的二聚体结构, 首次为GPCR的二聚化研究提供了直接结构依据。而在CCR5的结构中, 我们未发现CCR5形成类似的二聚体结构, 但有其他研究显示CCR5也是以二聚体的形式与gp120相互作用的[39-40], 因此, CCR5有可能采取其它方式形成二聚体。这些研究结果表明, 阻断CXCR4和CCR5形成同源二聚体可能达到抑制HIV-1病毒感染的目的, 这为新型抗艾药物的研发提供了新的思路。要完全理解HIV感染的分子机制并攻克艾滋病还有一段很长的路要走, 目前我们已经着手开展下一步的研究工作, 进一步深入研究HIV-1病毒共受体与gp120-CD4的作用模式, 从结构生物学的角度上更好地理解HIV病毒入侵人体细胞的机制, 为新型抗HIV病毒感染药物的研发提供更坚实的结构基础。<\/p>

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CCR5用蓝色代表, CXCR4用绿色表示, Maraviroc用橙色棍棒表示, IT1t用洋红色表示。A: 侧视图; B: 细胞外区域的俯视图; C: 细胞内区域仰视图。 CCR5 is shown in blue, and CXCR4 is in green. The ligands are shown in stick representation. Maraviroc in CCR5 and IT1t in CXCR4 have orange and magenta carbons, respectively.
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图1 CXCR4与CCR5结构的比较
Fig.1 Structure comparison between CXCR4 and CCR5
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吴蓓丽, 2006年7月获清华大学博士学位, 2007年至2011年在美国Scripps研究所从事博士后研究工作。2011年入选中国科学院“百人计划”, 现任中国科学院上海药物研究所研究员。吴蓓丽博士一直致力于生物大分子蛋白质的结构生物学研究, 主要利用蛋白质晶体X射线衍射的方法测定蛋白质分子的三维结构, 进而研究其结构与功能关系。<\/span><\/p>","cshort2":"

吴蓓丽, 2006年7月获清华大学博士学位, 2007年至2011年在美国Scripps研究所从事博士后研究工作。 现任中国科学院上海药物研究所研究员。吴蓓丽博士一直致力于生物大分子蛋白质的结构生物学研究, 主要利用蛋白质晶体X射线衍射的方法测定蛋白质分子的三维结构, 进而研究其结构与功能关系。吴蓓丽博士在中国科学院上海药物研究所成功建立了一整套GPCR结构生物学研究技术平台, 并利用该平台针对多种重要GPCR蛋白开展结构生物学研究, 已取得突破性进展。目前, 她的研究重点在于深入理解HIV-1病毒共受体CCR5和CXCR4与配体的相互作用模式, 为研发治疗艾滋病的新方法提供基础。2010年和2013年, 吴蓓丽博士先后解析了CXCR4和CCR5的三维晶体结构(Wu et al. Science, 2011; Tan et al. Science, 2013), 这些结构为深入理解HIV-1病毒感染人体细胞的分子机制, 以及这两种受体与其天然配体的相互作用模式提供了新的线索, 并有助于新型抗HIV-1病毒感染药物的研发。<\/span><\/p>","ctitle":"HIV-1共受体的结构生物学研究","listseq":10,"seqno":"50","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-13-36-925"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所, 上海 200031)","cauthor":"李 坤 周 涛 胡海岚*","cintpic":"","clicktime":6,"clong1":"

抑郁症是现代社会非常普遍的慢性精神类疾 病, 影响了全世界10%的人口, 也是当今社会诱发人 们自杀的首要因素之一。它的高自杀率, 使其成为 威胁人类身体和精神健康的“无形杀手”。然而关于 抑郁症的成因, 目前仍不明确。 传统的观点认为抑郁症的发病原因是由于脑 内的化学物质, 尤其是单胺递质的改变所引起的。 支持这个假说的证据主要是因为很多有效的抗抑郁 药物的作用机理都是增加脑内单胺递质的水平。然 而越来越多的证据显示, 这个假说并不能充分解释 抑郁症的发病机理。例如: 抗抑郁药物可以在很短 的时间内增加脑内的单胺水平, 抑郁情绪的改善却 需要几周的时间; 并且研究者们在单胺递质的信号 通路上, 并不能观察到一致的改变。

近年来, 神经可塑性假说认为抑郁症是由于神 经网络对外界刺激产生了适应性的改变, 而这些改变归根结底是由神经可塑性来介导。尽管这个假说 为人为理解抑郁症的发病机理提供了新的视角, 然 而其中一些关键性的问题, 仍有待解决, 比如: 是哪 些神经环路发生了可塑性的改变, 产生了哪种类型 的可塑性改变, 导致这些可塑性变化的内在分子机 制是什么。我们实验室希望围绕这些问题展开我们 的研究。

抑郁症的核心症状之一是快感缺失, 也就是对 对奖赏的敏感性减弱。外侧缰核是位于大脑奖赏环 路中的一个重要核团, 它是连接前脑边缘系统和中 脑单胺中心的核心枢纽。已有的研究工作表明, 缰 核可以被负面情绪, 如失望、应激、恐惧等激活[1-3]。 并且它的激活会引起对下游单胺类脑区包括奖赏中 心脑腹侧被盖区(VTA)的抑制。在多种抑郁动物模 型以及患有抑郁症的病人中, 都可以观察到外侧缰 核被过度活化[4-6]。在天生抑郁的大鼠模型中, 外侧 缰核神经元的电活动明显增加, 其投射到中脑腹侧 被盖区的突触电流mini EPSC的频率明显增加, 说明 外侧缰核神经元在抑郁时发生了可塑性的改变[7]。以上种种证据提示了这样一个假说: 在正常状态下, 一个相对安静的缰核对奖赏中心VTA有一个较小的 抑制; 而当缰核过度活化时, 这种抑制作用会被极 大地增强, 进而导致了奖赏敏感性的减弱, 这就形成 了抑郁症的核心症状。因此, 我们实验室希望找出 是什么样的分子机制介导了缰核在抑郁时的过度兴 奋。

为了研究这个问题, 我们决定首先寻找天生抑 郁动物缰核中蛋白组分的差异变化。我们从Fritz Henn实验室引进了天生抑郁大鼠品系, 对其后代进 行筛选并选择性地繁殖抑郁动物。并与scripps研究 所的John Yates实验室的廖鲁剑(现为中国科学院生 物化学与细胞生物学研究所研究员)和黄超兰博士 (现为中国科学院生物化学与细胞生物学研究所研 究员)开展了合作。 John Yates实验室发明了一种基 于稳定同位素标记的高通量定量蛋白质谱技术。这 项技术的核心是将每一个蛋白样品与N15标记的大 脑内参进行比较[8]。经过一系列的质谱分析, 对于每 一个蛋白, 在正常和天生抑郁的样本中, 都会产生一 个N14/N15的比值, 然后将这两个比值做除法运算, 我 们就会得到每个缰核蛋白的胎段在抑郁状态下和正 常状态的比值。
我们采用蛋白变化的对数值和显著性作为筛 选候选蛋白的参数(其中显著性是指蛋白变化的标 准平均值减去2倍标准差), 根据变化大于50%和显 著性大于0作为筛选标准, 我们共鉴定出8个上调和5 个下调的蛋白。上调的8个蛋白多数是可塑性相关 的突触分子, 下调的蛋白大都是参与到基础生物合 成过程中的酶分子。当查阅这些上调蛋白的相关文 献后, 我们发现这很多上调蛋白在过表达时, 可以促 进mini frequency的增加或者可以促进突触的生长。 然后, 我们用Western blot来验证了这些候选蛋白的 变化。在急性习得性无助模型和慢性温和性应激两 种动物模型中, 我们发现钙/钙调蛋白激酶II家族中 的一个成员, βCaMKII在抑郁动物的缰核中表达明 显增加。同时, 我们在天生抑郁模型中进一步验证 了βCaMKII分子的表达水平, 并得到了和其他抑郁 动物模型一致的结果。因此, βCaMKII在缰核的表 达增加可能是抑郁症发生的普遍规律, 而不是仅仅 局限于某种特定的抑郁诱导方式。缰核还可以细分 为更小的外侧和内侧亚核, 我们利用免疫组化的方 法进行直接观察βCaMKII和它们的磷酸化究竟是在缰核的哪一部分。 结果表明, βCaMKII及其磷酸化 的变化局限于外侧缰核。而天生抑郁动物海马组织 中, βCaMKII的变化呈现出相反的变化趋势。这说明, βCaMKII在抑郁动物的表达上调具有缰核特异性。

为了研究βCaMKII是否是导致抑郁症发生的充 分和必要条件, 我们克隆出βCaMKII及与其同家族 的另一个成员αCaMKII的cDNA序列, 并构建了利用 ubiquitin的启动子驱动这两个基因表达的AAV病毒 载体。经过多次尝试改进转染方法, 我们成功包装 出了能够在体内表达目的基因并用于行为学实验的 高滴度AAV病毒。我们采用双侧病毒注射的方法, 将AAV-βCaMKII或者AAV-αCaMKII的病毒感染正 常小鼠的外侧缰核, 然后在多种抑郁动物模型中检 测动物的抑郁症状。

与对照组相比, 外侧缰核过表达βCaMKII的小 鼠, 在强迫游泳实验中, 放弃游泳挣扎的时间明显 延长, 而且更早地进入不动状态; 在糖水测试中丧 失对糖水的偏好, 分别表现出行为绝望和快感缺乏 的状态; 在大鼠的习得性无助实验中, 成功逃避电 击的次数明显减少。而在外侧缰核过表达αCaMKII 并不会产生类似的现象。由于βCaMKII既可以作为 激酶又可以作为骨架蛋白发挥功能。当在外侧缰 核过表达βCaMKII的激酶缺失形式, K43R(该分子 在过表达后可以起到显性失活的作用, 从而阻断内 源性βCaMKII的功能), 并不能诱导出动物的抑郁症 状[9]。这说明, βCaMKII在外侧缰核中起促抑郁作用, 依赖于它的激酶活性。这些来自不同种类的行为学 检测结果, 都证实了一个相同的结论: 外侧缰核中 βCaMKII的水平异常增加可以直接导致核心抑郁症 状的形成。

为了了解βCaMKII过表达后影响外侧缰核神 经元活性与功能的细胞学机制, 我们通过成对的细 胞电生理记录比较了病毒感染后过表达βCaMKII的 缰核神经元及临近的未感染神经元。我们首先记 录并比较了这些神经元的微小兴奋性突触后电流 (mEPSC), 它由兴奋性的谷氨酸受体AMPAR介导, 是反映神将元突触特性的一个指标。感染了AAV- βCaMKII的外侧缰核神经元, 其微小兴奋性突触后 电流(mEPSC)的频率和幅度均有了显著的上调, 而 感染了AAV-αCaMKII的神经元则没有类似的变化。 为了进一步搞清楚这些神经元的电活动输出, 我们 又记录了它们的自发放电活动频率。感染了AAVβCaMKII的外侧缰核神经元的自发放电活动输出频 率比未感染病毒的神经元上升了三倍之多, 而感染 了AAV-αCaMKII病毒或者对照组病毒的神经元则 没有这一现象出现。综合以上的电生理记录结果, 我们明确了经过AAV-βCaMKII病毒感染并过表达 βCaMKII后, 外侧缰核神经元的突触能效与动作电 位输出均表现出明显增强, 从细胞学层面上揭示了 神经元功能的变化。

那么, βCaMKII的过表达是否是引起抑郁症表 型的必要因素呢？为了证明这一问题, 我们通过下 调其在外侧缰核的表达或者阻断其功能来看这样 是否可以逆转动物的抑郁行为。首先, 我们使用了 RNA干扰的手段特异性地减少βCaMKII的蛋白表 达量。将特异针对βCaMKII的RNA干扰病毒准确 地注射到天生抑郁大鼠的双侧外侧缰核后, 经过一 段时间的表达, 我们继续使用强迫游泳和习得性无 助测试来检测这些大鼠的抑郁行为。实验结果显 示, RNA干扰后, 这些大鼠在强迫游泳中不动的时 间显著降低, 而在习得性无助测试中逃避电击的行 为则显著增多。习得性无助老鼠的比例也从83%降 低到了25%。进一步使用βCaMKII的激酶失活形式 K43R, 并将其通过病毒过表达在天生抑郁大鼠的外 侧缰核, 我们观察到了同样的抗抑郁效果。尽管这 两种病毒的感染效率略低于βCaMKII过表达病毒的 水平, 但仍然有很强的抗抑郁效果, 这就提示外侧缰 核的神经环路有较小的冗余性, 所以只要影响较少 比例的神经元就能足够逆转抑郁表型。

是什么样的下游分子介导了βCaMKII过表达后 引起外侧缰核过度兴奋以及抑郁表型的呢？前人的研究发现, βCaMKII表达水平的上调会促进海马神 经元上GluR1亚型的谷氨酸受体上膜[10]。因此, 我 们首先检测了天生抑郁大鼠外侧缰核内GluR1受体 的总量与膜上水平的变化, 并且发现GluR1受体在 膜上的水平的确出现了明显上调。抗抑郁药处理可 以降低这一水平。为了检测GluR1受体在βCaMKII 介导抑郁过程中的作用, 我们构建了可以同时过表 达βCaMKII与GluR1受体显性失活形式GluR1Ct的 病毒载体(GluR1Ct可以阻断GluR1受体的上膜)。将 这一病毒注射在双侧外侧缰核后, 小鼠在强迫游泳 和糖水偏好实验中表现出与对照组小鼠类似的正常 表型, 这就说明, GluR1Ct过表达阻断GluR1上膜后 可以阻止由βCaMKII过表达引起的抑郁表型产生。 这一结果提示了GluR1亚型的谷氨酸受体是介导 βCaMKII过表达后引起外侧缰核过度兴奋以及抑郁 表型的重要下游分子。

通过综合一系列的分子、行为与电生理实验手 段, 我们明确了βCaMKII是导致外侧缰核过度兴奋 与抑郁行为表型的决定性分子。综合我们的实验结 果, 我们提出了这样的模型(图1): 因为压力、应激 等诱发抑郁的因素导致了外侧缰核中βCaMKII表达 出现上调, 并进一步引起更多的GluR1受体上膜进 入突触, 从而提高了突触效能。同时, βCaMKII也可 能通过影响缰核神经元上其他通道的特性来一起增 强动作电位输出。这些因素综合起来导致了外侧缰 核整体的活性上调, 对下游单胺能中心VTA等抑制 的加强, 最终导致抑郁行为的产生[10]。尽管以前有 部分研究提示了CaMKII在应激反应及抗抑郁中发 挥作用[12-15], 但是并不明确是具体哪一个CaMKII分子在其中起作用, 以及这一特定分子的变化是否是 引起抑郁表型的充分与必要条件。我们的工作则为 这一问题提供了答案, 同时也为人们进一步认识抑 郁症的发病机理并且为今后抑郁症的治疗提供了新 的方向和可能的靶点。<\/p>

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因为压力等刺激导致外侧缰核神经元中βCaMKII表达出现上调, 从而引起更多的GluR1受体进入突触等变化, 最终导致了外侧缰核整体活性上 调, 并加强了对下游单胺能中心(腹侧被盖区VTA及中缝背核DR)的抑制, 继而产生了抑郁行为。 Stress and other aversive emotional stimuli activate LHb neurons and increase the βCaMKII level, which can induce more GluR1 to insert into the synapse and more spontaneous spiking output. The hyper-activated LHb can further inhibit the VTA and DR (Dorsal Raphe), and then lead to the core symptoms of depression.
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图1 基于外侧缰核的抑郁模型
Fig.1 The model of depression formation
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参考文献 (References)<\/span>
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10 Groth RD, Lindskog M, Thiagarajan TC, Li L, Tsien RW. Beta Ca2+/CaM-dependent kinase type II triggers upregulation of GluA1 to coordinate adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108(2): 828-33.<\/span>

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胡海岚博士, 中国科学院神经科学研究所研究员。1996年毕业于北京大学生物系, 获生物化学和分子生物学专业学士。随后在加州大学伯克利分校师从Corey Goodman博士, 研究神经元轴突导向的信号通路。于2002年获得神经生物学博士学位。2003~2004年和2004~2008年期间分别在美国弗吉尼亚大学Julius Zhu博士的实验室和冷泉港Roberto Malinow博士的实验室进行博士后工作。<\/span><\/p>","cshort2":"

胡海岚博士, 中国科学院神经科学研究所研究员。1996年毕业于北京大学生 物系, 获生物化学和分子生物学专业学士。随后在加州大学伯克利分校师从 Corey Goodman博士, 研究神经元轴突导向的信号通路。于2002年获得神经 生物学博士学位。2003~2004年和2004~2008年期间分别在美国弗吉尼亚大 学Julius Zhu博士的实验室和冷泉港Roberto Malinow博士的实验室进行博士 后工作。发现情绪促进记忆的分子细胞机制(Cell, 2008)。先后获得美国霍 华修斯博士奖学金和Damon Runyon博士后基金。胡海岚博士主 要从事情绪与社会行为的分子与神经环路机制研究。其实验室先后发表了 调节社会等级的大脑环路基础(Wang et al. Science, 2011), 以及抑郁症的分子 与神经环路机制(Li et al. Science, 2013)的研究成果。2012年获国家杰出青 年基金。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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冠状病毒属巢状病毒目(Order: Nidovirales)冠状病毒科(Family: Coronaviridae)冠状病毒属(Genus: Coronavirus), 为一类具囊膜的RNA病毒[1]。在电镜下, 冠状病毒呈现为球形或卵圆形, 病毒粒子直径通常在100~160 nm之间; 粒子内部为单股正链的RNA基因组, 大小可达26~32 Kb; 粒子外部的囊膜中含有刺突蛋白, 因其覆盖表面而使得整个病毒粒子在电镜下如日冕一般, 因而得名冠状病毒。

人们对冠状病毒的认识最早可追溯到上世纪30年代, 研究人员从鸡身上分离得到了第一个冠状病毒——传染性支气管炎病毒; 随后若干冠状病毒被陆续发现, 包括可引起人类疾病的人类冠状病毒OC43、229E等, 但这些冠状病毒通常只引起感冒等普通的呼吸系统疾病[1]。2003年, 一场突如其来的非典疫情在全球造成了超过8 000例的感染病例和逾800例的死亡病例[2], 而其致病原正是被称作重症急性呼吸综合征病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)的冠状病毒, 这使得人们开始重新认识这些“温和”的致病原, 它们一旦跨越种间屏障, 可以造成严重的人类疾病和人群感染。这也是人们对新出现的高致病性中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronaviurs, MERS-CoV)如此关注的原因。

2012年9月23日, 英国健康保护局通报了一例严重的呼吸系统疾病患者, 这位49岁的卡塔尔人在7~8月曾到沙特阿拉伯旅行, 9月初发病后, 病情恶化而转至英国治疗, 经实验室确诊为感染了一种新型的冠状病毒[3]。在此之前, 一位沙特阿拉伯男性已经被证实感染了同样的冠状病毒而死亡[4]; 而在此之后, 越来越多的实验室确诊病例相继在不同国家和地区被报道。截至2013年7月29日, 世界卫生组织已累计通报了91例该新病毒的感染病例, 其中46例死亡, 病死率超过50%; 病毒已扩散到多个中东和欧洲国家, 包括约旦、卡塔尔、沙特阿拉伯、阿拉伯联合酋长国、法国、德国、意大利、突尼斯和英国等[5]。更有切实的证据表明, 这一新型冠状病毒具备一定的人际传播能力[6]。一时间, 其高病死率、人传人的能力以及向其他国家蔓延的趋势引起各方重视和担忧。尽管早先该病毒曾被称作hCoV-EMC(human coronavirus-erasmus medical center), 2012年5月15日, 国际病毒分类委员会正式将该病毒命名为MERS-CoV[7]。

为了更有效地应对MERS-CoV对公共卫生安全所造成的严重威胁, 认识并解析其致病机理是重中之重。MERS-CoV感染引起的临床症状与SARS-CoV非常相似, 包括高烧、呼吸急促、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征等, 并有很高几率伴发急性肾衰竭[8-9]。但全基因组序列分析表明, MERS-COV不同于SARS-CoV。依据目前的分类原则, 冠状病毒包括α-、β-和γ-冠状病毒属[1]。SARS-CoV与MERS-CoV虽同属β-冠状病毒属, 在进化上却隶属于不同的亚群, 前者为2b亚群的成员, 而后者属于2c亚群, 与冠状病毒蝙蝠分离株HKU4和HKU5等亲缘关系最近[10-11]。这也提示我们, MERS-CoV很可能来源于蝙蝠。在组织嗜性上, 与目前已知的其他人类冠状病毒相比, MERS-CoV表现出更广泛的感染能力[12]; 更有证据表明, MERS-CoV的复制周期快于SARS-CoV[13]。这些特征很可能与这一新型冠状病毒的极高致死率密切相关。此外, MERS-CoV还表现出更广泛的种属选择性。有研究显示, MERS-CoV在灵长类、猪、兔、果子狸和蝙蝠来源的细胞系内均能有效复制[12]。在宿主的免疫应答方面, MERS-CoV感染并不会有效诱导干扰素和促炎性因子的产生; 与之对应的, I型干扰素可以有效抑制该病毒在体外培养的肺组织中的复制[14]。

上述研究开启了人们认识MERS-CoV致病机理的大门。但作为囊膜病毒, MERS-CoV识别何种宿主细胞分子作为受体, 如何介导病毒的黏附和侵入从而起始感染, 是致病机理研究中不可或缺的一环。虽然新近的研究显示, SARS病人的康复期血清对MERS-CoV存在一定的交叉反应[15], 提示我们两者的表面刺突蛋白可能存在一定的相似性, 但MERS-CoV并不能利用SARS-CoV的受体血管紧张素转换酶2(angiotension converting enzyme 2, ACE2)侵入细胞[16]。2013年3月14日, 一个荷兰的研究小组首先鉴定了MERS-CoV在宿主细胞的功能性受体[17]。研究人员发现, MERS-CoV的刺突蛋白可以特异性地与人二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase 4, DPPIV, 又称CD26分子)相互作用; 人为表达CD26分子可以使非敏感细胞对MERS-CoV变得易感; 而CD26的抗体能够有效阻断病毒的感染[17]。这一工作极大地深化了人们对该病毒致病性和宿主范围的认识, 但更深入的问题随之而来, MERS-CoV识别该受体分子的分子机制为何？这一问题的研究对于解析MERS-CoV的侵入机制和有效药物靶点的发现都具有重要意义。

为了解决这一问题, 首先需要鉴定病毒的刺突蛋白中与CD26分子发生特异相互作用的部分, 即病毒的受体结合域(receptor binding domain of MERS-CoV, MERE-RBD)。与其他的冠状病毒类似, MERE-CoV的刺突蛋白(spike, S)在宿主细胞中也会被加工成S1和S2两个亚基[18], 其中S1负责结合宿主的受体分子, 而S2含有典型的七肽重复区, 通过形成六螺旋簇结构而介导病毒与宿主细胞的膜融合[19]。根据前人的研究, 冠状病毒的S1亚基又可以进一步分成N-端和C-端两个结构域: 有些冠状病毒, 如鼠肝炎病毒[20], 利用N-端结构域结合受体分子; 而目前已知的更多的冠状病毒, 包括SARS-CoV[21]、人冠状病毒NL63[22]等, 则通过C-端结构域识别受体。据此, 我们分别制备了MERS-CoV刺突分子的S1、N-端和C-端蛋白, 并通过流式分析测定各蛋白对于细胞表面CD26分子的结合。结果显示, MERS-CoV刺突的C-端蛋白(367-606位氨基酸)能够识别CD26[23]。进一步的结合动力学研究表明, 这一C-端蛋白特异性结合CD26分子, 两者的亲合力(Kd)高达16.7 nmol/L; 但对于SARS-CoV的受体ACE2则没有任何互作(图1A)。

受体结合域的成功鉴定为我们进一步剖析MERS-CoV识别CD26的分子机制奠定了基础。我们的目标是通过结构生物学手段, 在分子层面直接“观察”MERS-RBD结合CD26的互作细节。我们首先解析了MERS-RBD的高分辨率晶体结构。整体上, MERS-RBD可分为“核心”和“外部”两个亚结构域。前者为α/β结构, 包括一个由5个反向平行的β-折叠片形成的片层, 以及围绕在片层两侧的4个α-螺旋、2个310-螺旋和2个短β-折叠片等二级结构元件; 在这一“核心”的内部存在3对二硫键, 对于其结构的稳定性起着关键作用。而后者是一个β-折叠为主的结构, 主体为3个长折叠片和一个短折叠片以反向方式排列所形成的片层。这一片层的一侧接触“核心”亚结构域, 而另一侧则几乎完全暴露于溶剂[23]。

我们进一步解析了MERS-RBD与CD26的复合物晶体结构。与之前对CD26的结构研究一致, 在我们所解析的结构中, 该受体分子由两个结构域组成, 包括一个α/β催化结构域和一个由8-桨叶片(blade I~VIII)所组成的“β-螺旋桨”样结构域; MERS-RBD识别CD26分子的IV、V桨叶片。在宿主细胞表面, CD26以同源二聚体的形式存在, 而MERS-RBD结合在CD26分子的远膜端, 形成类似U-型的分子结构(图1B)。对病毒刺突蛋白而言, 受体识别区则完全位于蛋白的“外部”亚结构域中, MERS-RBD利用上述提到的片层中暴露于溶剂的一侧结合受体。细致的分析表明, MERS-RBD与CD26的结合在两分子中的包埋面积均超过1 100 ?2, 这从分子层面揭示了两者间高亲合力的结构基础; 在病毒配体识别受体的过程中, 侧链基团形成的氢键和盐桥等亲水相互作用至关重要。与这一结合模式相一致, 当我们将RBD中的关键氨基酸突变后, 该病毒配体即失去结合CD26分子的能力[23]。

有趣的是, 虽然MERS-CoV与SARS-CoV的刺突蛋白在一级序列上同源性很低, 但两者的RBD结构却存在一定的相似性[21,23]。结构比对显示, 两种冠状病毒RBD的“核心”亚结构域高度同源; 但“外部”亚结构域则差异显著。这提示我们, 前者很可能作为结构支架而在进化中被保留; 后者由于趋异进化而形成完全不同的结构域, 以实现一些病毒特异的致病过程, 如受体识别。

通过上述结构和功能研究, 我们成功破译了MERS-CoV识别细胞受体的分子机制。这一新型冠状病毒对公共卫生安全的潜在威胁亟需特异、高效的抗病毒药物。阻断病毒的结合和侵入, 防患于未然, 是最有效的抗病毒手段之一。在分子层面上对病毒配体/受体互作细节的分析, 为我们设计靶向病毒侵入的小分子药物提供了重要的参考。同时功能性RBD蛋白的成功表达和制备, 也为疫苗设计奠定了基础。上述研究还为我们更深入了解MERS-CoV的致病机制指出了新的研究方向。比如我们发现, MERS-RBD与腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)在CD26分子中的识别位点完全重叠[23-24], 这意味着病毒蛋白结合CD26后, 将竞争性地抑制ADA对该受体分子的结合。有研究表明, ADA/CD26的互作是T细胞活化中非常重要的共刺激信号[25]。因此, MERS-CoV很可能通过竞争ADA对CD26的结合而对宿主的免疫应答进行“操纵”。<\/p>

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A: 表面等离子共振的结果。MERS-RBD以高亲合力与CD26分子相互作用, 但不结合SARS-CoV的受体hACE2; B: MERS-RBD与CD26的复合物晶体结构。CD26以二聚体形式存在于细胞表面, MERS-RBD结合于CD26分子的远膜端, 形成U形的分子结构。 A: an SPR assay. MERS-RBD can specifically bind to CD26, but not to the SARS-CoV receptor ACE2, with high affinity; B: the complex structure between MERS-RBD and CD26. CD26 is present on the cell surface as homodimers. MERS-RBD locates at the distal-tip of the receptor dimer, forming an overall “U”-shaped structure.
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图1 MERS-CoV与宿主受体分子CD26的相互作用特征(根据参考文献[23]修改)
Fig.1 Characterization of the interaction between MERS-CoV and its cellular receptor CD26 (modified from reference [23])<\/p>


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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-37-43-943.jpg","cshort":"

高福, 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室主任, 中国科学院微生物研究所研究员, 中国科学院北京生命科学研究院副院长, 中国疾病预防控制中心副主任。先后在山西农业大学和北京农业大学获得学士和硕士学位, 1995年在英国牛津大学获得博士学位, 相继在英国牛津大学、加拿大卡尔加里大学、美国哈佛大学从事博士后研究工作。<\/span><\/p>","cshort2":"

高福, 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室主任, 中国科学院微生物研究所研究员, 中国科学院北京生命科学研究院副院长, 中国疾病预防控制中心副主任。先后在山西农业大学和北京农业大学获得学士和硕士学位, 1995年在英国牛津大学获得博士学位, 相继在英国牛津大学、加拿大卡尔加里大学、美国哈佛大学从事博士后研究工作。2001–2004年在英国牛津大学任讲师、实验室主任、博士生导师。2005、2011连续两次担任国家973项目“病毒跨种间传播机制”的首席科学家, 是国家基金委“病原微生物与宿主互作”创新研究群体带头人。2006年起任国际抗病毒联盟(International Consortium of Anti-Virals, ICAV)国际执委会委员。2010年起被聘为英国牛津大学客座教授(Visiting professor)。在多个国际杂志编委会任职。2012年获得发展中国家科学院(TWAS)基础医学奖。2013年获年度科技创新人物。2013年当选中国科学院院士。<\/span>
高福研究员长期从事病原微生物与免疫学领域研究, 整合分子生物学、流行病学、结构生物学等研究手段, 针对病原跨种传播机制, 特别是在病原与宿主界面的相互识别和相互作用、免疫细胞与感染细胞(靶细胞)的相互识别机制研究方面进行了系统性和创新性工作。MERS-CoV的疫情在中东地区暴发后, 高福研究员带领课题组逯光文等迅速开展研究, 破译了这种新型冠状病毒的受体识别过程和膜融合机制(Lu et al. Nature, 2013)。高福研究员在包括Nature、Science、The Lancet、NEJM、PNAS等在内的SCI杂志发表论文260余篇。<\/span><\/p>","ctitle":"高致病性中东呼吸综合征冠状病毒识别细胞受体分子机制的破译","listseq":12,"seqno":"48","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-12-17-613"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 细胞生物学国家重点实验室, 上海 200031)","cauthor":"赵惠杰 鄢秀敏*","cintpic":"","clicktime":3,"clong1":"

中心粒是由九组三联体微管组成的圆筒状细胞器, 主要存在于动物细胞中[1]。中心粒在细胞中主要行使两大功能: 一方面, 中心粒是中心体的核心, 而中心体是哺乳动物细胞的微管组织中心, 在有丝分裂间期参与细胞迁移、胞内运输和形态维持等, 而在有丝分裂期则作为纺锤体的极点参与纺锤体的形成, 参与细胞分裂和遗传物质的分配; 另一方面, 细胞进入G0/G1期后, 中心粒可迁移并锚定到细胞质膜上, 作为基体支持纤毛发生[2-4]。纤毛是一种突出于细胞表面、主要由微管组成的毛状结构。根据纤毛的功能, 可以将其划分为两大类, 运动纤毛(motile cilia)和静纤毛(immotile cilium, primary cilium)。运动纤毛大多在多种终末分化的上皮细胞表面成束存在, 例如气管上皮、室管膜上皮及输卵管上皮细胞等[5-7]。但也存在一些特殊的运动性纤毛, 其在细胞表面单根存在, 如小鼠胚胎发育过程中出现的胚节(embryonic node)区域细胞表面的纤毛[8]。运动性纤毛的摆动可以在细胞表面形成液体流、排除异物或黏液以及为细胞运动提供动力。静纤毛通常不具备运动能力, 大多为单根突出于细胞表面, 主要行使信号转导和感知功能, 在动物体内各种细胞类型中广泛分布。纤毛功能异常会导致多种遗传疾病, 统称为纤毛病(ciliopathies), 症状包括不育、多囊肾、多指、肥胖、慢性气管炎、内脏倒位等[9-12]。

在增殖细胞中, 为了保证遗传物质能稳定遗传到子代细胞, 中心粒的复制和数目受到严格调控, 即在每个细胞周期中一个“母”中心粒会并且只会产生一个“子”中心粒[3,13-14]。中心粒数目异常会造成染色体分离错误或失败, 从而导致细胞死亡或癌症的发生[10]。而与此同时, 在动物体内又存在大量的表面有上百根纤毛的多纤毛细胞, 在纤毛发生过程中需要在短时间内产生大量的中心粒, 这类细胞的功能异常也会导致疾病的发生。那么, 生物体是如何同时满足不同类型的细胞对中心粒数目的不同需求的呢？

目前, 关于增殖细胞中心粒的复制过程已经有较为详细的研究报道, 其中心粒的复制主要以母中心粒依赖的方式(mother centriole dependent, MCD)进行, 主要由少量的几个关键蛋白质来调控, 包括Cep63、Cep152、Plk4和Sas-6等。一般认为, Cep63和Cep152在母中心粒的基部形成环状结构[15], 招募Plk4, 确定子中心粒复制的位点, 然后招募Sas-6 起始子中心粒的复制[16-19]。而对于多纤毛细胞中 心粒复制, 在上世纪六十年代, Sorokin和Anderson 两个研究组运用电子显微成像技术发现, 在多纤 毛发生过程中母中心粒打破了“一胎制”, 即一个 母中心粒可以同时产生多个子中心粒(一般为5~6 个)。此外, 他们还发现95%左右的中心粒主要是 由被称作deuterosome(暂译“摇篮体”)的环状结构产 生的, 这种不依赖于母中心粒的方式即为“从无到 有”(de novo)的扩增方式, 也被称为摇篮体依赖(deuterosome dependent, DD)的中心粒扩增方式[5,20]。虽 然多纤毛细胞中心粒扩增的方式已经发现了半个世 纪, 但是人们对于其中的分子机制以及摇篮体的分 子组成几乎还是一无所知。

虽然多纤毛细胞中心粒复制的神秘面纱没有 被揭开, 但是增殖细胞中心粒复制相关的研究为揭 示该问题提供了一定的线索。Habedanck等[21]发现, 在增殖细胞中外源过表达Plk4、Sas-6等关键基因可 以打破母中心粒复制的“一胎制”, 使得一个母中心 粒可以同时产生多个子中心粒, 这一现象与电镜观 察到的多纤毛细胞MCD的复制方式类似。因此, 在 多纤毛细胞中的MCD的复制方式极有可能是通过 提高多个关键基因的表达量实现的。那么, DD的中 心粒扩增方式的分子机制又是怎样的呢？ Khodjakov 等[22]的研究发现, 在增殖细胞中使用激光束人为 去除中心粒后, 细胞也可采取de novo的方式产生子 中心粒, 说明中心粒的两种复制方式可能共享了一 些基因及其相关机制。另外, 在MCD的中心粒复制 过程中, 由Cep63和Cep152形成的环状结构[15,19]与电 镜观察到的摇篮体有一定的结构类似性, 提示两者 可能是结构类似物, 并有可能是由两个同源基因分 别介导形成的。根据以上的推测, 关于多纤毛细胞 中心粒扩增的分子机理, 我们提出了以下几个假设: (1) MCD和DD的中心粒复制方式共享了部分分子机 制和关键基因; (2)这些共享的基因在多纤毛细胞分 化过程中高表达; (3)某个或某几个中心粒复制相关 的关键调控基因存在旁系同源基因(paralog), 不同 的同源基因分别介导了MCD和DD的中心粒扩增。

我们将现已知的中心粒复制起始相关基因, 包括Cep63、Cep152和Plk4, 进行了生物信息学 分析, 结果发现, 仅Cep63存在一个旁系同源基因 Ccdc67(我们后续的研究发现其为deuterosome结构蛋白, 因此将其命名为Deup1, 即deuterosome protein 1)。我们首先在U2OS细胞中观察过表达Deup1是 否与中心粒的复制相关, 发现在U2OS细胞中过表 达GFP融合的Deup1会造成中心粒的过度复制。更 有意思的是, 借助3D-SIM超高分辨率显微镜, 我们 发现GFP-Deup1在细胞中形成类似于摇篮体的、大 小较为均一的环状结构, 该结构还能招募Cep152和 Plk4, 并能在其周围产生新的中心粒, 这一现象高度 模拟了多纤毛细胞中的DD的中心粒扩增。免疫共 沉淀实验证实, Deup1与Cep63一样可以与Cep152结 合, 而且Deup1和Cep63与Cep152的相互作用具有排 他性, 即两者不能同时结合同一个Cep152分子。此 外, 组织表达谱分析也发现, 不同于Cep63比较广谱 的表达, Deup1只特异性表达在多纤毛细胞和组织 中, 如气管、输卵管等。这些结果提示, Deup1极有 可能就是我们寻找的摇篮体的结构组分。

为了深入研究多纤毛细胞中心粒复制的分 子机理, 我们在研究中采用了小鼠气管上皮细胞 (MTECs)体外分化系统。在MTECs分化过程中, 细 胞首先进行中心粒的扩增, 产生大约200个中心粒, 然后以此为基础长出200根左右的动纤毛[23], 因此该 系统是研究多纤毛细胞中心粒扩增的理想平台。和 我们预想的相同, Deup1、Cep63以及多个与中心 粒复制相关的基因, 如Plk4、Cep152和Sas-6等, 在 MTECs分化过程中无论是mRNA还是蛋白质水平 都有较大的提高。随后, 我们利用超高分辨率显微 镜对Cep63、Deup1、Cep152、Plk4和Sas-6在分化 的MTECs中进行了精细的亚细胞定位。我们发现, Deup1在母中心粒有微弱定位, 主要染色信号呈现 明显的环状结构, 并且该结构环绕有Cep152和3~6 个子中心粒。该结构与早期电镜观察到的摇篮体极 其相似(图1), 我们推断Deup1可能特异性地标记了 摇篮体。免疫电镜观察进一步证实了Deup1确实定 位在摇篮体上。而与Deup1相反, Cep63只定位在母 中心粒的周围(图1)。与Deup1和Cep63不同, Cep152 (图1)、Plk4和Sas-6在摇篮体和母中心粒周围都有 定位。这些结果进一步说明Deup1和Cep63极有可 能就是我们寻找的在多纤毛细胞中分别介导DD和 MCD的扩增方式的一对旁系同源基因, 而这两条扩 增途径的确共享了部分重要蛋白质。

为了进一步研究Deup1和Cep63的功能, 我们利 用慢病毒介导的shRNA感染MTECs来敲低Deup1或Cep63。与对照组相比, Deup1敲低后摇篮体无法形成, DD途径被显著抑制, 而MCD途径则大大地增强, 每个母中心粒复制的子中心粒数目加倍。连续切片电镜观察进一步证实了敲低Deup1后摇篮体不能形成。意想不到的是, 当我们在MTECs中敲低Cep63时, 无论是母中心粒依赖的还是摇篮体依赖的途径都没有明显的变化。我们猜测, Deup1作为Cep63旁系同源基因是否可能代偿了Cep63的功能？免疫荧光染色发现, 确实, 在Cep63敲低的细胞中Deup1在母中心粒位置的染色明显增强。为了进一步了解这两个蛋白质的功能, 我们在MTEC中同时敲低Deup1和Cep63, 结果显示, 当两者同时被敲低后, 中心粒复制的MCD和DD两个途径均被显著抑制。因此, 这些结果说明Deup1是摇篮体的重要组成成分, 参与DD途径, 对摇篮体的形成至关重要, 而Cep63则在MCD途径中发挥作用。
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Deup1特异性标记摇篮体, Cep63定位在母中心粒周围, 而Cep152在摇篮体和母中心粒周围都有定位。箭头和箭头头分别指示母中心粒和摇篮体。 Deup1 specifically localizes at the deuterosome, while Cep63 is only located around the mother centriole. Cep152 associates with both the deuterosome and the mother centriole. The arrows and arrowheads indicate the mother centrioles and the deuterosomes, respectively.
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图1 Deup1、Cep63和Cep152在多纤毛中心粒扩增过程中的亚细胞定位
Fig.1 The subcellular localization of Deup1, Cep63 and Cep152 during centriole biogenesis in MTECs<\/p>


在增殖细胞中心粒复制过程中发挥重要作用的Cep152和Plk4在多纤毛细胞中心粒扩增以及摇篮体的形成中又行使怎样的功能呢？我们发现, 无论是敲低Cep152还是Plk4, MTECs中都能形成摇篮体, 但是不论MCD还是DD途径的中心粒扩增均无法进行, 说明Plk4和Cep152是MCD和DD途径共享的关键基因。此外, 我们发现敲低Cep152后, 虽然摇篮体可以形成, 但是数目明显减少。Western blot结果显示, 敲低Cep152后Deup1和Cep63的蛋白水平也明显下调, 暗示Cep152可能是通过影响Deup1的蛋白质稳定性进而影响了摇篮体的数目。为了进一步确证Deup1单独就能形成摇篮体, 并不需要Cep152等额外的蛋白质, 我们在E. coli中表达His-Deup1, 发现His-Deup1可以形成类似摇篮体的环状结构。

综合上述结果, 我们认为在DD途径中, Deup1作为摇篮体的核心结构蛋白质, 形成摇篮体并依次招募Cep152和Plk4, 而Cep152和Plk4并不是摇篮体的结构成分, 但Cep152通过与Deup1形成复合物, 可以起到保护Deup1蛋白质稳定性同时招募Plk4和Sas-6, 起始子中心粒的扩增; 而在MCD途径中, 和增殖细胞中的一样, 首先是Cep63和Cep152在母中心粒形成环状结构, 然后招募Plk4和Sas-6起始子中心粒的扩增。

最后, 我们还对Deup1和Cep63这对旁系同源基因在进化中的关系进行了研究。通过分子进化树分析, 我们发现从低等的尾索动物海鞘(Ciona intestinalis)到高等哺乳动物中都存在Cep63, 而Deup1则是从硬骨鱼类腔棘鱼(Latimeria chalumnae)开始出现的, 而腔棘鱼被认为是陆生脊椎动物的祖先, 并且为了适应陆地生活在腔棘鱼体内已经进化出大量含致密多纤毛的细胞[24-25]。因此, 进化树分析提示Deup1源于Cep63基因复制, 并且由于这一基因的出现促进了含致密多纤毛的细胞出现, 很可能因为增强了气管清除异物、脑脊液流动、配子在输卵管和附睾中的流动而促进了脊椎动物的陆地适应性。

我们的研究工作不但通过超高分辨率显微镜图像清晰地展示了多纤毛细胞中心粒复制的完整过程, 而且还解析了其中的分子机制和生物体是如何同时满足增殖细胞和多纤毛细胞对于不同的中心粒数目需求的。在增殖细胞中, 生物体关闭Deup1的转录, 同时控制MCD途径相关蛋白质的表达量, 从而使得每个母中心粒只能产生一个子中心粒。而在多纤毛细胞中, 由于MCD和DD途径共享大部分的基因, 生物体只需启动Deup1的表达, 同时提高其他基因的表达, 就能通过MCD和DD途径产生大量的子中心粒, 满足纤毛发生的需求。这种机制的精美之处在于生物体可以通过简单地开启或关闭Deup1基因的表达, 较为容易地控制在多纤毛细胞中同时采用MCD和DD的方式, 而在其他类型细胞中采用可控性较强的MCD途径, 既满足不同细胞对不同中心粒数目的需求, 又可以有效地避免中心粒异常进而引起细胞功能的异常和疾病的发生。<\/p>


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鄢秀敏, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所副研究员。2002年获中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学专业博士学位, 随后在德国马普生物化学研究所从事博士后研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

鄢秀敏, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所副研究员。2002年获中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学专业博士学位, 随后在德国马普生物化学研究所从事博士后研究。2007年回国后, 在国家海洋局第三海洋研究所开展对虾抗病和对虾病毒的分子与细胞生物学方面的研究。2009年起在生物化学与细胞生物学研究所从事纤毛发生和中心粒复制相关机理方面的研究。作为共同通讯作者, 发现了第一个影响初级纤毛发生的miRNA (Cao et al. Nat Cell Biol, 2012); 揭示了多纤毛细胞中心粒复制的分子机理(Zhao et al. Nat Cell Biol, 2013)。获得过2012年赛诺菲 · 安万特–中国科学院上海生命科学研究院优秀青年人才奖和2003年中国细胞生物学学会-CST青年优秀论文奖一等奖。<\/span><\/p>","ctitle":"多纤毛细胞中心粒扩增的分子机制","listseq":13,"seqno":"47","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-05-20-10-36-49-754"},{"caddress1":"(复旦大学生物医学研究院, 复旦大学附属肿瘤医院, 上海 200032)","cauthor":"程净东 徐彦辉*","cintpic":"","clicktime":8,"clong1":"

DNA甲基化是表观遗传学最重要的修饰之一, 哺乳动物的DNA甲基化修饰主要发生在胞嘧啶第5位碳原子上, 称为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)。DNA甲基化参与了诸多的生物学过程, 包括基因印迹、X染色体的失活、基因组稳定性、转座子及逆转录转座子的沉默及组织特异性基因的沉默等[1]。DNA甲基化模式的紊乱可以引起多种神经退行性疾病、免疫系统疾病、实体肿瘤及白血病。1948年, Hotchkiss[2]在从牛胸腺组织提取的DNA中首次观察到了DNA的甲基化现象。在之后几十年的研究中, 科学家们发现DNA甲基化修饰不仅存在于高等哺乳动物, 还广泛分布于古菌、细菌和其他真核生物中。

与组蛋白的甲基化类似, DNA甲基化的建立、维持和去除存在动态变化。DNA甲基化模式可以通过复制来维持, 也可以通过有性生殖传递给下一代[3]。DNA甲基化主要由DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)催化完成, 主要发生在CpG位点。甲基化模式的建立主要由DNMT3a、DNMT3b和DNMT3l蛋白负责, 在DNA复制过程中, DNA甲基化的维持由DNMT1蛋白负责。在哺乳动物中, DNA的甲基化去除主要发生在两次重编程过程中, 一次是在配子发生过程中, 一次是从受精到胚胎发育的早期[4]。这两个过程中都发生了显著的DNA主动去甲基化。DNA上发生的主动去甲基化过程对于配子的发生和胚胎的发育至关重要, 但催化该反应的酶一直没有被鉴定出来。

2009年, 《Science》杂志的一篇文章揭开了DNA去甲基化研究的新篇章。研究者发现, TET1蛋白可以将5-甲基胞嘧啶(5mC)氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)[5]。后续的研究还发现, TET家族的蛋白还能进一步将5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)氧化成5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)和5-羧甲基胞嘧啶(5-carboxylcytosine, 5caC)[6](图1)。5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是5-甲基胞嘧啶(5mC)的羟基化形式, 最早于1953年在噬菌体中发现[7], 后来在脊椎动物的脑组织中也发现了这种修饰[8]。5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是重要的表观遗传调控修饰, 与肿瘤的发生有密切关联。5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)被人体内的一种糖苷水解酶TDG识别, 启动细胞内碱基错配切除修复, 将其替换成胞嘧啶, 最终实现DNA去甲基化[9]。TET蛋白介导的DNA去甲基化成为近年来表观遗传研究领域的热点。

TET蛋白最早发现于2002年。研究人员发现, 在一种急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)中, 第10号和11号染色体发生易位, 导致MLL基因与一个新基因发生融合, 该基因由此被命名为ten eleven translocation(TET)。哺乳动物TET蛋白家族包括TET1、TET2和TET3。其结构都包括一个保守的C端的催化区和一个N端的调节区。C端的催化区属于Fe2+和α酮戊二酸(α-KG)依赖的双加氧酶家族, 是氧化5mC的催化结构域。与其他双加氧酶不同的是, TET蛋白催化结构域还包含一个TET蛋白特有的半胱氨酸富集结构域(Cysteine-rich), 该结构域对于保持酶活性是必须的[10]。TET1与TET3的N端具有CXXC结构域, 有研究表明该结构域对于TET3准确的染色体定位是至关重要的[11]。虽然TET2没有CXXC结构域, 但是后来的研究发现TET2与CXXC4蛋白的相互作用, 可以辅助TET2蛋白的基因定位[12]。

最近的研究表明, 血液系统肿瘤患者的基因中TET2蛋白的突变率非常高, 这些突变影响了TET2蛋白的活性, 对于白血病的发生起着非常重要的作用[13]。因此, 研究TET蛋白的三维结构, 揭示其识别底物和催化反应的分子机制, 将对开发靶向TET蛋白的特异性药物有重要意义。我们课题组在国际上首次成功地解析了TET2-DNA复合物的晶体结构(分辨率2.02Å)[10](图2)。<\/p>

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DNA甲基化主要是由DNA甲基转移酶(DNMT)建立和维持。5-甲基胞嘧啶(5mC)可以被TET蛋白氧化生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧甲基胞嘧啶(5caC)。5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)可以被脱氨酶AID(activation-induced cytidine deaminase)识别脱氨生成胸腺嘧啶(T)和5-羟甲基尿嘧啶(5hmU)。5-甲酰胞嘧啶(5fC)、5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-羟甲基尿嘧啶(5hmU)以及5-甲基胞嘧啶(5mC)脱氨形成的G/T错配可以被糖苷水解酶识别水解, 形成AP位点(apurinic/apyrimidinic site), 从而启动碱基错配修复途径, 完成去甲基化。
DNA methylation (5mC) is established and maintained by DNA methyltransferases(DNMT). 5mC can be oxylated by the TET family of dioxygenases to generate 5hmC, 5fC and 5caC. Alternatively, 5mC and 5hmC may be further deaminated to become T or 5hmU by AID/APOBEC deaminases. 5hmU, 5fC, 5caC and G/T mismatch (generated by 5mC deamination) can be excised from DNA by DNA glycosylases such as TDG and MBD4. Through base excision repair pathway, 5mC can be replaced by cytosine (C).
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图1 TET蛋白介导的DNA去甲基化反应示意图
Fig.1 Proposed models of Tet-initiated DNA demethylation pathways<\/p>


我们的研究表明, TET2蛋白具有保守的双加氧酶的催化中心, 形成double-stranded beta helix(DSBH)折叠, Fe2+和NOG(α-KG类似物)位于DSBH结构域形成的催化中心。Cysteine-rich结构域被分割成了Cystine-rich氨基端(Cys-N)和羧基端(Cys-C)两个部分。Cysteine-rich结构域将DSBH结构域包裹在中心。二者通过多个结合面的作用, 在三个锌指结构域的螯合作用下, 构成了一个完整的催化结构域。Cysteine-rich结构域即维持催化结构域的稳定性, 又负责与DNA底物的结合。含有甲基化CpG的DNA底物位于催化中心的正上方, 被DSBH和Cysteine-rich结构域牢牢的锚定。Cysteine-rich结构域中的loop1和loop2两个片段参与了DNA的识别和结合。其中, loop2的疏水氨基酸还参与了5mCpG附近DNA的解旋。在DSBH和Cysteine-rich结构域的共同作用下, 5-甲基胞嘧啶(5mC)被翘出DNA双螺旋, 通过碱基翻转机制插入TET蛋白催化中心, 将甲基指向催化反应中心, 在氧气和α-KG的参与下完成氧化反应。

我们的研究发现, TET2通过TET家族中高度保守的氨基酸, 特异性的识别CpG二核苷酸。由于哺乳动物中5-甲基胞嘧啶主要存在于CpG二核苷酸中, 结构的发现很好的解释了TET对DNA底物的选择性。TET对CpG二核苷酸其周围的DNA序列没有明显的偏好性, 这也提示我们TET2蛋白在染色体的定位可能会受到其相互作用蛋白的辅助。插入到催化中心5-甲基胞嘧啶被几个特定的氨基酸稳定到一个固定的构象, 使其甲基朝向具有催化活性的Fe2+和α-KG。有趣的发现是甲基的周围并没有疏水相互作用的存在, 这一特点也解释了该催化中心能够将亲水性的5hmC和5fC继续催化。

通过进一步的结构和生化实验分析, 我们发现白血病病人体内TET2的突变大部分都发生在对TET结构或功能至关重要的氨基酸上。病人来源的氨基酸突变参与到DNA的结合、5mC的翻转以及催化中心的组成。这些突变有的降低TET2蛋白稳定性, 有的影响底物DNA的识别, 有的削弱TET2蛋白酶活力。这一研究也很好的将TET2的功能与白血病的发生机制建立了联系。


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使用丝带模式表示的TET2催化结构域和底物DNA三维结构(两种不同的视角)。图中底物DNA被标记成黄色, Cysteine-rich结构域被标记成粉色和紫色, DBSH核心标记成绿色。甲基化胞嘧啶(mC6)、铁离子和N-oxalylglycine(NOG)在图中标记出。识别DNA的loop1和loop2以及催化结构域的N端和C端也在图中标出。
Ribbon representation of TET2-DNA structure in two different views. The DNA is colored in yellow, cysteine-rich domain is colored in pink and violet, DBSH core is colored in green. mC6, Fe ion and NOG are marked. DNA-interacting loops (Loop1 and Loop2), and N and C termini are indicated.
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图2 TET2-DNA复合物三维结构示意图(根据参考文献[10]修改)
Fig.2 Overall structure of TET2-DNA complex (modified from reference [10])<\/p>


上述研究揭示了TET蛋白催化结构域的空间构成, 阐明了TET2发生催化反应, 特异性识别5-甲基胞嘧啶的分子机制, 为TET蛋白家族的结构与功能研究打开了一扇大门。高分辨率TET2-DNA复合物的晶体结构也为进一步设计靶向TET蛋白的药物奠定了重要的结构基础。

TET蛋白酶活性的调节机制将是后续研究中的一个重要问题。首先, TET蛋白的N端调节区和DBSH结构域里的无序区域的功能都还未知。但是这两段区域在TET蛋白家族内都存在, 说明他们对于TET蛋白的功能非常重要。这两段区域的不保守性, 恰好可以解释三种TET蛋白功能的非冗余性。其次, 结合蛋白对TET的功能也很重要。已经有研究证明, TET相互作用蛋白可以调节其染色体定位和酶活。新的相互作用蛋白的鉴定和功能研究还有待于我们去完成。再次, 体内代谢小分子对TET的酶活也有调节作用, 从而影响体内表观遗传学的改变, 引发疾病。总之, 对TET蛋白的研究才刚刚开始, 回答上述问题将有助于我们对TET功能深入理解, 并为治疗因TET失活而引起的疾病奠定理论基础。

另外, 是否存在DNA甲基化脱羧酶仍是个迷。迄今为止, 我们知道的DNA主动去甲基化过程主要有以下几个途径: 一是通过脱氨途径。5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)分别在脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase, AID)的作用被转化成胸腺嘧啶(T)和5-羟甲基尿嘧啶, 然后通过碱基错配修复途径完成去甲基化。二是通过TET蛋白的氧化作用。最终生成的5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC), 可以被体内的糖苷水解酶识别, 然后通过碱基切除修复途径完成去甲基化[14]。这一类途径与植物中的DNA去甲基化非常相似[15], 但是体内很有可能存在一类脱羧酶, 它们可以识别5-羧甲基胞嘧啶(5caC), 催化脱羧最终生成胞嘧啶。这需要科学家们继续去发现。

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徐彦辉, 复旦大学生物医学研究院研究员、博士生导师; 复旦大学附属肿瘤医院兼职教授; 中国生物物理学会理事; 上海生物物理学会理事。1999年获清华大学生物科学与技术系学士学位, 2004年获清华大学生物科学与技术系博士学位, 2004~2007年在普林斯顿大学分子生物学系做博士后。<\/span><\/p>","cshort2":"

徐彦辉, 复旦大学生物医学研究院研究员、博士生导师; 复旦大学附属肿瘤医院兼职教授; 中国生物物理学会理事; 上海生物物理学会理事。1999年获清华大学生物科学与技术系学士学位, 2004年获清华大学生物科学与技术系博士学位, 2004~2007年在普林斯顿大学分子生物学系做博士后。2008年回国, 受聘于复旦大学生物医学研究院。先后任职副研究员、研究员、附属肿瘤医院兼职教授。长期从事表观遗传调控的结构生物学研究, 阐明其发挥功能的分子机理, 并为相关疾病的治疗提供理论基础。主持与承担国家“973”计划(课题组长)、国家自然科学基金重点项目、面上项目、“重大新药创制”专项、上海市科委项目等十几项课题。迄今为止, 已在国内外学术刊物上发表论文近40篇。自2008年组建课题组以来, 已在国内外学术刊物上以通讯作者发表多篇SCI论文, 包括Cell、Genes & Dev、Mol Cell、Proc Natl Acad Sci、Cell Res、J Biol Chem等。 获得了“明治生命科学奖(杰出奖)”、中国生物物理学会“贝时璋青年生物物理学家奖”、上海市生物物理学会“上海市生物物理学科青年科技英才”等奖项。<\/span><\/p>","ctitle":"哺乳动物TET2蛋白氧化5-甲基胞嘧啶的结构生物学研究","listseq":14,"seqno":"46","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-11-13-091"},{"caddress1":"(中国科学院生命科学研究院上海逆境植物学研究中心, 上海 201602)","cauthor":"曹 珉 徐通达*","cintpic":"","clicktime":7,"clong1":"

植物在生长过程中会受到多种内源(如植物激素)[1]和外源(如光)[2]信号的调控, 而植物细胞在感受各个信号之后经过不同信号通路的信号传递和汇总, 最终对细胞生长、细胞分裂和细胞分化进行精细调控。植物细胞在不同的组织中通过形成不同形态的细胞来执行不同的功能, 其中, 植物细胞的极性生长(cell polar growth)在细胞形态建成(cell morphogenesis)过程中起到至关重要的作用, 如花粉管通过极性生长来保证配子完成双受精过程、根毛通过极性生长来摄取土壤中养分等。对于不同细胞极性生长调控分子机制的研究表明, 小G蛋白作为细胞内信号传递的开关, 能调控各种细胞的极性生长过程[3]。ROP家族蛋白属于植物特有的Rho GTPase(Rho-related GTPase from plants, ROP), 该家族有11个成员[4]。ROP蛋白在细胞中被极性激活, 从而激活下游效应因子RIC蛋白(ROP-interactive CRIB motif–containing proteins, RICs)和ICR1蛋白(interactor of constitutively active ROP1 proteins, ICR1 and ICR1-like), 通过调控细胞骨架的动态变化来调控细胞极性生长。已有研究表明, ROP1在花粉管细胞中顶端部位激活, 并激活下游RIC4蛋白, 通过调控F-actin来促进花粉管极性伸长。在根毛细胞中, ROP2在根毛顶端被激活, 并激活下游RIC蛋白, 调控F-actin的动态分布, 从而促进根毛的极性生长[5-10]。

在各种极性生长的细胞中, 叶表皮铺板细胞(epidermal pavement cell)因具有非常特殊的嵌套铺板形状而成为研究细胞形态建成的一种模式细胞。铺板细胞并不像其他大多数极性生长细胞那样单方向极性生长, 而是在局部区域向外极性生长, 形成凸起(lobes), 而在相邻区域向外极性生长受到抑制, 表现为凹陷(indentations)。更有意思的是, 在一个细胞的凸起处, 恰好是相邻细胞的凹陷处, 最终使得整个叶表皮扁平细胞看上去像嵌套拼图一样(jigsaw-puzzle appearance)(图1A)。因此, 叶表皮扁平细胞的生长不仅受到自身细胞信号的调节, 同时也势必受到细胞间信号的调控[11-12]。

研究发现, 在叶表皮细胞中小G蛋白ROP2可以在细胞形成凸起(lobe)的位置上被特异性激活, 使其下游效应蛋白RIC4在凸起处聚集。RIC4可以调节细胞骨架中的微丝(F-actin)来促进该区域向外极性 生长形成凸起。与此同时, ROP6可以在细胞形成凹 陷的位置上被特异性激活, 从而激活其下游效应蛋 白RIC1。RIC1可以结合到细胞骨架中的微管蛋白 (microtubule), 并通过调控微管的动态结构从而形成 平行规则的维管束来抑制细胞向外生长。这两条信 号通路互相抑制, 从而在细胞膜上间隔性激活ROP2 和ROP6, 以调控叶表皮细胞形成特殊的嵌套形状。 然而, 激活ROP2和ROP6的上游发育信号分子却一 直没有找到[11-13]。

Xu等[14]在2010年发现了生长素(auxin)可以通过 细胞膜定位的生长素结合蛋白ABP1(auxin binding protein 1)激活小G蛋白信号通路, 从而调节叶表皮 细胞的形态建成。生长素作为一种重要的植物激素 (phytohormone), 它的作用贯穿于植物生长发育的各 个时期, 如胚胎发育、根的生长、叶片的发育和顶 端分生细胞分化等。前期研究发现, 生长素在细胞 核被其受体TIR1结合, 通过泛素化–蛋白酶体降解 途径将抑制子IAA蛋白降解, 从而促进ARF蛋白调 控基因转录[15-17]。然而, 此信号途径无法解释生长 素的所有功能, 如生长素如何调节细胞的极性生长 等。研究发现, 生长素可以激活小G蛋白来促进叶 表皮细胞的局部极性形态建成。定量分析表明, 生长素能在30秒内激活小G蛋白ROP2和ROP6。这种 快速激活机制意味着生长素不太可能通过细胞核 内TIR1(transport inhibitor response 1)介导的信号转 导途径来激活小G蛋白。研究发现, 另一个定位于 细胞膜上的生长素结合蛋白ABP1能介导生长素快 速激活小G蛋白[14,18](图1B)。ABP1作为生长素结合 蛋白已经被发现了40多年, 前期研究证实了其在生 长素信号途径中的重要作用, 但其作用的分子机制 一直不清楚。ABP1蛋白定位于细胞膜上却不具有 跨膜域及胞内功能域, 这预示着ABP1需要辅助蛋 白来传递生长素信号以激活细胞膜小G蛋白信号途 径。具有胞外域和胞内激酶域的类受体蛋白激酶 RLK(receptor like kinase)在结构上提供了介导ABP1 行使生长素功能的可能性[19-21]。

TMK家族属于类受体蛋白激酶家族中的一个 小的亚家族, 该家族由4个同源蛋白组成。它们都拥 有一个胞内激酶域(intracellular kinase domain)、一 个跨膜区域(transmembrane domain)和一个胞外域 (extracellular domain), 其中胞外域含有富含亮氨酸 的重复序列(leucine rich repeat, LRRs)。研究发现, tmk突变体表现出生长素功能缺失表型, 比如胚胎致 死表型、子叶发育缺失表型及叶表皮细胞形态建成 缺失表型等。这些表型为TMK可能参与细胞膜上生长素信号通路提供了可靠证据[22]。<\/p>

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A: 拟南芥叶表皮细胞形成特殊的铺板形状, 由相互间隔的凸起和凹进组成, 相邻细胞协调形成对应的凸起和凹进; B: 生长素由细胞膜上
ABP1介导激活小G蛋白ROP2信号途径来控制凸起的形成及调控PIN1在此处的定位; 生长素同时激活临近细胞小G蛋白ROP6信号途径来控
制凹进的形成, 最终形成完整的叶表皮细胞。
A: the jigsaw-puzzle cell shape of leaf pavement cells. Pavement cell forms interdigitated lobes and indentations; B: the working model for auxin
dependent activation of ROP2 and ROP6 signaling cascades in changing pavement cell morphogenesis.

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图1 生长素激活小G蛋白信号途径来调控叶表皮细胞的形态建成的分子机制
Fig.1 The molecular mechanism about how auxin regulates pavement cell morphogenesis through activating Rho GTPase signaling pathway<\/p>


Xu等[23]通过叶表皮细胞来探索TMK是否与ABP1一起介导细胞膜上的生长素信号转导途径。 tmk突变体分析发现, 其叶表皮细胞类似于abp1突变体, 存在形态建成缺陷, 并且这种缺陷不能通过施加外源生长素恢复。为了检测TMK是否与ABP1类似能介导生长素激活小G蛋白, 研究团队将带有GFP标签的ROP2和ROP6分别引入到tmk突变体和野生型植株中。在野生型中, 100 nmol/L NAA(萘乙酸, 人工合成的生长素)能显著提高ROP2和ROP6的活性; 在tmk突变体中, 类似于在abp1突变体中, NAA无法快速激活ROP2和ROP6。

为了进一步证明TMK能介导生长素激活小G蛋白, 研究团队利用ROP下游的效应分子的定位来间接指示小G蛋白在活体细胞内的活性。ROP2的下游效应蛋白RIC4只能与活性的ROP2结合, 在野生型拟南芥的叶表皮细胞中定位于ROP2被激活的凸起处, 并促进微丝蛋白在此处的动态聚集。在tmk突变体中, RIC4无法定位在细胞膜上, 也无法检测到微丝蛋白在凸起形成处富集。ROP6的下游效应蛋白RIC1在被活性ROP6激活后, 定位于微管上并促进微管的有序排列, 而在tmk突变体中, RIC1无法定位于微管上, 导致细胞内微管分布混乱。这些实验证据与前期在abp1及rop突变体下的结果相一致, 进一步说明了TMK在叶表皮细胞中与ABP1一起介导生长素激活小G蛋白ROP2和ROP6信号通路。研究团队根据上述结果大胆假设, TMK能和ABP1形成生长素在细胞膜上的受体复合体。

首先, 通过研究TMK1和ABP1的定位来探索ABP1和TMK形成复合体在空间上的可能性。研究团队利用pTMK1::TMK1-GFP转基因植物来检测TMK1的定位, 发现TMK1蛋白主要定位于细胞膜上。同时, 利用免疫组织电镜技术及ABP1-GFP融合蛋白来检测ABP1的定位, ABP1蛋白主要定位于内质网和细胞膜上。

那么, 同时定位于细胞膜的ABP1和TMK1是否能形成一个膜上蛋白复合体来传递生长素信号？我们利用pTMK1::TMK1-GFP转基因植物提取蛋白, 通过免疫共沉淀的方法, 证明ABP1和TMK1的确可以形成蛋白复合体。同时我们发现, 生长素处理之后能促进ABP1/TMK1复合体的形成。
我们知道, ABP1作为生长素结合蛋白能直接和生长素结合, 如果生长素能够促进ABP1/TMK1复合体形成, 那么ABP1与生长素的亲和力将直接调控ABP1/TMK1复合体的形成。前期研究报道abp1-5突变体是一个点突变体, 在ABP1蛋白生长素结合位点上氨基酸的点突变(生长素与ABP1蛋白结合位点)导致其和生长素的结合能力降低。在abp1-5突变体中, ABP1-5/TMK1复合体的形成效率显著降低, 并且生长素无法促进ABP1-5/TMK1复合体形成。这一结果直接证明了ABP1/TMK1蛋白复合体的形成依赖于ABP1与生长素的结合。

为了能进一步解析ABP1/TMK介导生长素信号转导的作用机制, 我们希望探索ABP1和TMK1蛋白的哪个功能区域相结合。通过烟草叶片瞬时表达系统共表达ABP1和HPB标签的TMK蛋白片段, 然后利用免疫共沉淀的方法检测到ABP1和TMK1形成蛋白复合体。结果表明, ABP1只可以与TMK1细胞外区域(Ex-TMK1)相互作用, 并且外源生长素可以促进ABP1和EX-TMK1的相互作用。同时, ABP1-5突变体蛋白与EX-TMK1的相互作用较弱于ABP1野生型蛋白, 并且生长素不能促进ABP1-5和EX-TMK1复合体的形成。上述结果说明, 生长素可以调节ABP1和TMK1胞外域的相互作用, 这个结论与ABP1在细胞膜外膜接收生长素信号的假设相一致, 从而提出了如图2所示的ABP1/TMKs作为生长素受体复合体介导生长素激活小G蛋白信号途径的可能工作模型。Auxin结合ABP1后, 促进ABP1/TMKs在细胞表面形成受体复合体, 激活下游小G蛋白ROPs, 通过激活相应效应因子调控细胞骨架的动态变化, 最终调控叶表皮铺板细胞的形态建成[23]。

我们的研究工作精确阐明了拟南芥叶表皮细胞形态建成的分子机制: 首先, 我们找到了上游发育调控信号生长素, 并且首次将植物生长素信号转导途径与小G蛋白信号转导途径相关联, 成功地阐述了这两条植物中最重要的信号途径如何互相协作调节植物的生长发育。其次, 我们清晰阐明了一条位于细胞表面调节细胞骨架的生长素信号转导途径, 协同生长素在细胞核内调控基因表达的信号途径, 进一步完善了生长素在植物生长发育过程中的功能。最后, 我们首次发现了细胞膜上ABP1/TMK生长素受体复合体, 成功地解开了植物学界长期以来对于ABP1是否为生长素受体的疑虑, 并阐述了其受体复合体的作用模式, 为将来生长素的研究开辟了新的领域。<\/p>

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19 Chen JG, Ullah H, Young JC, Sussman MR, Jones AM. ABP1 is required for organized cell elongation and division in Arabidopsis embryogenesis. Genes Dev 2001; 15(7): 902-11.

20 Jones AM, Im KH, Savka MA, Wu MJ, DeWitt NG, Shillito R, et al. Auxin-dependent cell expansion mediated by overexpressed auxin-binding protein 1. Science 1998; 282(5391): 1114-7.

21 Jones AM, Herman EM. KDEL-containing auxin-binding protein is secreted to the plasma membrane and cell wall. Plant Physiol 1993; 101(2): 595-606.

22 Dai N, Wang W, Patterson SE, Bleecker AB. The TMK subfamily of receptor-like kinases in Arabidopsis display an essential role in growth and a reduced sensitivity to auxin. PLoS One 2013; 8(4): e60990.

23 Xu T, Dai N, Chen J, Nagawa S, Cao M, Li H, et al. Cell surface ABP1-TMK auxin-sensing complex activates ROP GTPase signaling. Science 2014; 343(6174): 1025-8.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-34-39-510.jpg","cshort":"

徐通达, 中国科学院上海生命科学研究院植物逆境生物学研究中心研究员, 博士生导师。2010年毕业于美国加州大学河边分校, 获分子细胞发育生物学博士学位。2011年至2013年在新加坡淡马锡生命科学院担任青年研究员。徐通达研究员主要从事植物激素生长素信号转导途径的功能研究, 鉴定了定位于细胞膜的生长素受体复合体。<\/span><\/p>","cshort2":"

徐通达, 中国科学院上海生命科学研究院植物逆境生物学研究中心研究员, 博士生导师。2010年毕业于美国加州大学河边分校, 获分子细胞发育生物学博士学位。2011年至2013年在新加坡淡马锡生命科学院担任青年研究员。徐通达研究员主要从事植物激素生长素信号转导途径的功能研究, 鉴定了定位于细胞膜的生长素受体复合体。从事科研工作以来共发表研究论文10篇, 代表性研究成果发表在Cell、Science、Plos Biology等国际核心期刊上。2010年, 在Cell上发表论文, 解析了生长素激活小G蛋白调节细胞形态建成的分子机制。最近, 在Science杂志上发表了关于细胞膜上生长素受体复合体ABP1/TMK的最新研究成果。<\/span><\/p>","ctitle":"植物生长素ABP1-TMK膜受体复合体调控细胞极性形态建成","listseq":15,"seqno":"45","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-08-41-415"},{"caddress1":"(云南中科灵长类生物医学重点实验室, 昆明 650500)","cauthor":"陈永昌 牛昱宇 季维智*","cintpic":"","clicktime":8,"clong1":"

1 研究背景<\/strong>

灵长类动物, 如猕猴和食蟹猴, 在遗传和生理 特性上与人类具有很高的相似性, 是研究人类疾 病、发育和临床前治疗等方面最为理想、有时甚 至是唯一的实验动物[1]。通过遗传修饰的方法获 得灵长类动物模型对探讨疾病的致病机理和治疗 有重大的意义, 因此科学家一直在努力构建理想的 灵长类动物模型。来自美国、日本和中国的科学 家们先后获得了利用逆转录病毒或慢病毒介导的 转基因猴[2-5], 但这些通过外源基因的随机插入和过 量表达来实现对基因组的修饰, 无法对确定的目的 基因进行修饰和控制, 所获得的动物模型具有一定 的局限性和不确定性。最近发展起来的锌指核酸 酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases, TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复 序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)等系统是利用特异的核酸内切 酶, 通过碱基配对的原理, 与基因组的靶位点结合, 形成二聚体发挥内切酶活性, 引起双链DNA断裂 (double-strand breaks, DSB), 从而诱发DNA损伤修复 机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制(nonhomologous end joining, NHEJ)修复DNA。NHEJ修 复机制并不精确, 极易发生错误(缺失/插入), 从而造 成移码突变, 达到基因敲除的目的[6-7]。或者利用同 源重组修复(homology-directed repair)机制, 利用细 胞自身的修复机制对DNA进行遗传学修饰。ZFNs 因脱靶效应严重, 而且很难完全找到符合条件的匹 配3连子锌指, 因而限制了该技术的发展和推广[8]。<\/span>

相对于ZFNs技术, TALENs具有经济、高效、 可以靶向更长的基因序列以及相对更容易构建等优势。TALENs已广泛应用于动物及植物的基因修饰 研究, 然而尚未见在灵长类动物中的研究报道。与 同济大学孙毅教授研究团体合作, 我们选用X-连锁 的、突变及缺失可导致雷特综合征(Rett syndrome, RTT)的甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG binding protein 2, MECP2)基因[9], 构建MECP2靶向TALEN 质粒并注射到猕猴及食蟹猴的1细胞期胚胎。最终 获得了高效打靶并符合RTT表型特征的猕猴模型组 织材料及食蟹猴模型个体。首次证明TALENs技术 可以用于灵长类基因修饰动物模型的构建[10]。<\/span>

CRISPR/Cas9因其操作简便、高效、特异性 高、可同时操作多个基因等特性, 被认为是有力的 真核基因组遗传修饰工具[11]。目前, 该系统已广泛 应用在哺乳动物细胞系和多个物种, 包括小鼠和大 鼠等[12-14], 然而能否成功应用在灵长类动物中尚不 清楚。因此, 与南京医科大学沙家豪教授和南京大 学黄行许教授研究团队合作, 我们选定3个目的基因 [Nr0b1(nuclear receptor subfamily 0 group B member 1, 参与调节肝细胞的干性以及参与调节动物性别决 定); Ppar-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, 帮助调节新陈代谢); Rag1(recombination activating gene 1, 与健康的免疫功能相关)], 将Cas9 mRNA及3个基因特定的向导RNA混合物注射到食 蟹猴1细胞期胚胎的卵胞质中。成功获得了2个基因 (Ppar-γ和Rag1)同时被敲除的食蟹猴[15]。<\/span>

2 TALENs构建遗传修饰灵长类动物模型<\/strong>

2.1 TALENs的设计及实验流程<\/strong>

与人和小鼠类似, 猴MECP2基因包含4个外显 子, 其中外显子3包含351个核苷酸, 是最为重要和非 常保守的功能区域, 我们针对该外显子设计了3对 TALEN靶向序列(图1A)。<\/span>

为了验证TALENs的有效性, 我们利用构建的 质粒转染了293T细胞、食蟹猴间充质细胞以及人 间充质细胞, 均发现了突变剪切的发生。并将单对 TALEN和3对TALEN的超螺旋环状质粒DNA组合 或对应转录后的mRNA, 连同可以促进DNA修复的 RAD51一起以5 pL每个胚胎(2 ng/μL)的量注射到1 细胞期胚胎, 结果发现3对TALENs的质粒对基因组 的编辑效果很好, 对8细胞到囊胚阶段的胚胎检测 发现, 40%~50%胚胎的MECP2基因发生了突变。之 后, 在猕猴和食蟹猴上开展了胚胎移植, 并获得了TALENs介导的基因修饰猴。实验步骤见图1B。<\/span>

<\/p>

<\/p>

图1 TALENs的设计及MECP2基因修饰猴构建实验流程示意图(根据参考文献[10]修改)
Fig.1 The design of TALEN-targeting sites within monkey MECP2 and schematic map of experimental procedure (modified from reference [10])<\/p>

2.2 TALENs介导的猴模型构建结果<\/strong>

X染色体连锁基因MECP2的突变可引起RTT综 合征, 该病是雄性致死的, 患者基本是雌性。我们 的实验结果发现, 在怀孕中期流产的胎儿均为雄性, 而正常出生的新生猴为雌性。经PCR、T7EN1酶切 和测序等检测, 流产雄性胎儿及出生的雌性均存在 基因突变, 符合RTT的性别表型特征。经过对父母 本单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析, 这些突变并不是由SNP引起的, 而是由 TALENs介导的。这些结果表明, TALENs系统利用 超螺旋的环状质粒DNA对猕猴及食蟹猴的基因组 进行定向遗传改造是高效而可行的。<\/span>

3 CRISPR/Cas9构建遗传修饰灵长类动 物模型<\/strong>

3.1 Cas9/sgRNA的设计<\/strong><\/span>

我们选取了3个目的基因: Nr0b1、Ppar-γ和 Rag1。这几个基因不会影响胚胎发育, 无致死性, 多 个基因的缺失或突变不会导致某种综合征, 相互之 间不存在相互调节或上下游关系。实验的第一步是 设计sgRNA, 针对Nr0b1基因设计了2条sgRNA, 中间 有117个碱基相隔; Ppar-γ的2条sgRNA被49个碱基 相隔; 而Rag1基因只设计了1条sgRNA。<\/span>

3.2 CRISPR/Cas9构建基因修饰猴的实验流程及 结果
<\/strong>
为了验证这些sgRNA的有效性, 首先将它们与 Cas9 mRNA混合, 并共转染进非洲绿猴肾脏COS-7 细胞系中, 72 h后, 收集并提取细胞的基因组DNA, 通过PCR扩增、T7EN1酶切分析等检测了特异位点 基因修饰的效率, 并做了进一步的测序分析。结果 发现, 5个目标打靶位点均实现了突变(包括碱基插 入、缺失和替换等), 突变效率在10%~25%之间。之 后, 我们将Cas9 mRNA(20 ng/μL)与sgRNA的混合 物(分别为5 ng/μL)注射到22个食蟹猴的1细胞期原 核胚中, 其中15个胚胎发育到了桑葚胚或囊胚阶段。 同样利用PCR、T7EN1及测序的办法进行了检测。 结果发现, Nr0b1、Ppar-γ和Rag1基因突变的效率分 别是26.7%、46.7%和60%; 而且40%的胚胎中Ppar-γ 和Rag1基因同时突变, 13.3%的胚胎中Nr0b1和Rag1 基因同时突变。表明CRISPR/Cas9系统在猴胚胎中 可正常发挥基因修饰的功能。我们随后开展了基因修饰猴胚胎移植的实验, 并获得了1对双胞胎后代, 对胎盘、脐带以及耳朵皮肤的检测结果显示, 这对 双胞胎实现了Ppar-γ和Rag1两个基因的同时突变。 实验的主要流程见图2。<\/span>

4 脱靶效应和嵌合情况分析<\/strong><\/span>

对TALENs系统和CRISPR/Cas9系统是否存在脱 靶效应进行了检测。对TALENs小猴的胎盘、脐带、 耳朵皮肤及其父母本基因组, 流产胎儿的脑组织、睾 丸、其他组织及其父母本基因组等, 共计1 882个样品 或PCR产物的测序结果分析发现, 没有脱靶效应的存 在。此外, 在基因修饰猴所有材料的基因组内并未发 现TALENs质粒的整合情况。这些结果表明, TALENs是 可靠的可用于开展灵长类动物基因修饰研究的工具。<\/span>

人们对CRISPR/Cas9体系开展基因遗传修饰较 为关心的问题之一是脱靶效应的存在。我们提取了 出生猴的脐带并提取了基因组DNA, 筛选了针对3 个基因的84个可能存在的脱靶位点, 通过PCR扩增、 T7EN1酶切、TA克隆序列分析等, 并未发现脱靶突 变的存在。由于脱靶效应与位点的选择、sgRNA的 设计等密切相关[16]。我们的结果也说明只要优化相 关操作程序, CRISPR/Cas9系统是可应用于灵长类 动物的可靠的基因修饰工具。<\/span>

实验还发现, 无论是体外培养的早期胚胎, 还是 获得的基因修饰猴, TALENs和CRISPR/Cas9系统获得 的基因修饰猴基因组测序结果都发现具有多种基因 型, 表明所获得的1只TALENs介导的基因修饰猴和一 对CRISPR/Cas9介导的基因修饰猴都是嵌合体。类似 的结果也在其他物种中得到印证[17-18]。希望未来获得 并分析更多数量的基因修饰猴, 深入了解经TALENs 或Cas9/RNA系统获得的基因修饰猴的遗传学特性。<\/span>

5 结论与展望<\/strong>

我们首次利用CRISPR/Cas9和TALENs系统分 别实现了灵长类动物的基因修饰, 并获得起始精准 遗传修饰的灵长类动物, 说明在猴的1细胞期胚胎注 射Cas9 mRNA/sgRNA或TALENs质粒DNA是可行 的开展基因修饰的操作方法, 还可实现同时开展多 个基因的修饰操作, 并可有效避免脱靶效应。这两 种强有力的遗传操作技术体系有望未来为开展人类 重大疾病的发病机理研究及探索新的治疗方案建立 更多基因修饰的灵长类动物模型。<\/span>
<\/p>

<\/p>

图2 获得CRISPR/Cas9基因修饰食蟹猴的操作流程(根据参考文献[15]修改)
Fig.2 Schematic diagram of generation of CRISPR/Cas9 mediated genetic modified cynomolgus monkeys (modified from reference [15])<\/p>


<\/p>


参考文献 (References)<\/span>
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10 Liu H, Chen Y, Niu Y, Zhang K, Kang Y, Ge W, et al. TALENmediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgus monkeys. Cell Stem Cell 2014; 14(3): 323-8.

11 Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013; 339(6121): 823-6.

12 Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013; 153(4): 910-8.

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14 Ma Y, Zhang X, Shen B, Lu Y, Chen W, Ma J, et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res 2014; 24(1): 122-5.

15 Niu Y, Shen B, Cui Y, Chen Y, Wang J, Wang L, et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell 2014; 156(4): 836-43.

16 Ran FA, Hsu PD, Lin CY, Gootenberg JS, Konermann S, Trevino AE, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 2013; 154(6): 1380-9.

17 Sung YH, Baek IJ, Kim DH, Jeon J, Lee J, Lee K, et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol 2013; 31(1): 23-4.

18 Tesson L, Usal C, Ménoret S, Leung E, Niles BJ, Remy S, et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. Nat Biotechnol 2011; 29(8): 695-6.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-32-08-876.jpg","cshort":"

季维智, 研究员。现任生物医学动物模型国家地方联合工程研究中心主任, 云南中科灵长类生物医学动物重点实验室理事长。“国家干细胞研究指导协调委员会”专家, “国家重大科学研究计划生殖与发育专家组”成员, “国家实验动物研究委员会”专家组成员和973项目首席科学家。<\/span><\/p>","cshort2":"

季维智, 研究员。现任生物医学动物模型国家地方联合工程研究中心主 任, 云南中科灵长类生物医学动物重点实验室理事长。“国家干细胞研究指 导协调委员会”专家, “国家重大科学研究计划生殖与发育专家组”成员, “国 家实验动物研究委员会”专家组成员和973项目首席科学家。1985~1987年赴 美国俄勒岗灵长类研究中心和华盛顿史密研究院从事神经生殖内分泌和胚 胎移殖研究。1995~1997年任美国威斯康星大学动物医学与生物化学系客座 教授。1996年与威斯康星灵长类研究中心在中国科学院昆明动物研究所共 建了中–美灵长类生物学联合实验室。1996~2005年任中国科学院昆明动物 研究所所长。

多年来, 一直从事灵长类生殖发育生物学和干细胞的研究, 作为负责人承 担了包括863、973在内的多项国家及省部级重大科研项目。主要的研究方 向包括: (1)灵长类卵成熟和胚胎发育的分子调控机制; (2)灵长类干细胞生物 学; (3)人类重大疾病的非人灵长类动物模型。在Cell、Cell Stem Cell、 Proc Natl Acad Sci USA、Cell Res、Stem Cell、J Biol Chem、Biol Rep、Human Rep等杂志上发表论文90余篇。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"通过CRISPR/Cas9和TALENs介导的基因打靶技术获得基因修饰的猴模型","listseq":16,"seqno":"44","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-05-20-10-32-08-876"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031)","cauthor":"高义萌 惠利健*","cintpic":"","clicktime":6,"clong1":"

一般认为, 在高等动物发育过程中, 干细胞向终末细胞分化的过程是单向且不可逆的, 这一现象被称之为细胞命运决定。在正常生理状态下, 已经决定了命运的终末分化细胞受到胞内信号通路、表观遗传以及胞外微环境的严格调控, 维持在一个相对稳定的类型和状态, 一般不会转变为其他类型的细胞。这种细胞命运的稳定对于维持高等动物细胞功能、组织稳态等都极为重要[1]。<\/span>

最近的研究发现, 在特定的条件下, 细胞命运是可以转变的。例如, 日本科学家Yamanaka等[2]发现, 可以将终末分化的皮肤成纤维细胞去分化为多能干细胞。一系列关于转分化的研究也指出, 不同种类的细胞之间可以发生转化[3]。此外一个极端的例子是, 极少数的终末分化细胞也会出现病态的命运转变, 成为恶性增殖的癌化细胞[4-5]。这些事例都说明, 终末分化细胞具有可塑性, 细胞命运是可以被改变的(图1)。那么既然细胞的命运是可以转变的, 那么在体内, 为了维持组织稳态, 细胞命运转变是如何被抑制的？哪些条件下, 我们可以诱导细胞命运转变？而在病理条件下, 细胞癌化又是如何发生的？对这些问题的回答, 不仅对于理解基本的细胞生物学现象极为重要, 同时对于研究疾病发病机理和转化医学都具有深刻的意义。我们实验室以肝细胞为对象, 研究细胞命运转变, 特别是癌化与转分化, 希望能为临床治疗提供新思路和新策略。<\/span>

1 肝细胞癌化的早期分子事件<\/strong>
细胞癌化作为细胞命运的一种病态转变, 由于其机制的复杂和治疗的困难一直威胁着人类的健康。正常细胞发生癌化后表现出增殖信号的持续激活、增殖抑制通路的失活、免疫监视的逃避等多个特征。细胞癌化涉及到众多的基因突变或表达变化以及肿瘤细胞与微环境的相互作用[6]。对肝细胞癌化过程分子病理机制的研究, 不仅对揭示维持细胞命运和组织稳态的调控机制有重要意义, 同时也将为癌症治疗提供新的靶点和方法。<\/span>


<\/p>

<\/p>

A: 由多能干细胞向终末分化细胞的命运决定过程, 一般认为是单向不可逆的。这个过程可以用小球从山顶滚下坡来形象比喻, 最早由发育生物学家Conrad Hal Waddington描绘; B: 最近的研究成果表明, 终末分化的细胞具有可塑性, 可以发生去分化和转分化。特别是在一些病理条件下, 细胞的癌化也被认为是细胞身份改变的一种极端形式。
A: the determination of terminally differentiated cells from pluripotent stem cells is one-way and irreversible during development. This process could be metaphorized by a ball rolling down the slopes of a complex hillside, which was originally depicted by developmental biologist Conrad Hal Waddington; B: latest findings have demonstrated the plasticity of terminally differentiated cells, showing their potential to be dedifferentiated and transdifferentiated into other types of cells. Specifically, tumorigenic transformation under pathological conditions could be taken as an extreme form of cell identity changes.<\/p>

图1 细胞命运的决定与改变
Fig.1 The determination and change of cell identity<\/p>


在肝细胞发生癌化的早期, 伴随着HBV、HCV等感染引起的慢性炎症, 造成肝细胞死亡和代偿性增生等一系列反应。一方面, 在肝癌发生早期的炎症反应中, NF-κB调控STAT3依赖的IL-6表达, 而IL-6的表达促进了肝细胞增殖和肝细胞发生癌化[7]。NF-κB信号通路和MAPK信号通路的抑制蛋白CYLD和TGF-β激活激酶TAK1被证明在肝癌发生过程中具有重要的稳态维持作用。这些蛋白的失活导致炎症、肝细胞死亡和纤维化, 进而引起过度代偿性增生导致肝癌发生[8-9]。另一方面, 肝细胞癌化早期由于癌基因激活导致肝细胞衰老并分泌细胞因子, 引起CD4+ T细胞的免疫反应, 从而清除癌化早期的衰老细胞, 抑制肝细胞癌化的发生[10]。<\/span>

对肝细胞癌化的研究发现, MAPK信号通路常常被异常激活, 诱导肝癌的产生[11]。MAPK的一个成员蛋白JNK下游的c-Jun转录因子对小鼠以及人的肝癌形成有重要作用[12-13]。我们利用可诱导的c-Jun缺失小鼠, 对肝癌发生早期分子机制进行了研究。结果表明, c-Jun通过增强肝癌起始细胞的存活, 促进肿瘤的形成。在c-Jun被敲除的细胞中, 另一个AP-1转录因子c-Fos的表达会被上调, 引起去乙酰化酶SIRT6的高表达。高水平的SIRT6进而使Survivin基因启动子区域组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)的乙酰化水平降低, 造成Survivin这个细胞凋亡抑制蛋白基因的转录表达下调。降低的Survivin水平会使细胞凋亡增加, 肝癌起始细胞数目降低, 最终表现为肿瘤形成减少[14]。分离鉴定这一在肝细胞癌化早期阶段发挥重要作用的分子机制, 为肝癌的预防治疗提供了新策略。<\/span>

2 成纤维细胞的肝向转分化<\/strong>
肝脏作为人体的重要器官调节许多生理过程, 如糖原储存、脂质代谢、血浆白蛋白分泌、细胞解毒等[15]。对于重症肝病和晚期肝癌, 唯一有效的治疗就是肝脏移植。最近, 肝细胞移植作为器官移植的替代方法也在临床治疗中被尝试[16]。但是, 肝供体的严重缺乏限制了这些应用, 所以如何获得具有功能的肝细胞成为了研究的热点。利用特定的培养条件, 胚胎干细胞或者iPS细胞可以在体外定向分化成具有功能的肝细胞类似细胞[17]。但是, 采用此方法获得肝脏细胞, 具有步骤繁琐、效率低和成本过高等缺点。因此, 如何建立新方法获得非供体依赖的有功能的肝细胞, 具有很高的理论及应用价值, 也具有极大的挑战性。<\/span>
目前, 采用过表达组织特异的转录因子来改变细胞命运的方法已经被科学家们广泛地采用[3]。通过这种重编程的方式直接实现细胞谱系间的转换, 可以在不依赖供体器官的情况下快速地产生细胞, 应用于再生医学和个性化药物治疗[5]。在2011年, 我们以及其他研究者证明了通过在小鼠成纤维细胞中过表达肝细胞特异转录因子将其转分化为肝细胞[18-19]。最近, 还发现利用Hnf1β、Foxa3两个转录因子, 可将小鼠成纤维细胞转变为肝干细胞[20]。<\/span>

利用人类细胞获得转分化的肝细胞, 是将此种方法应用于再生医学的必经之路[5,21]。尽管很多研究已经成功将小鼠的成纤维细胞直接转变为其他类型的细胞, 然而诸多研究也表明人类细胞较难进行重编程[22-24]。有研究人员将人类成纤维细胞转分化为神经细胞, 但是转分化产生的神经细胞的体内治疗功能并没有很好鉴定[22-23]。最近的一项研究将人类成纤维细胞转分化为心肌细胞, 但是这些细胞缺乏相应的成熟心肌细胞功能[24]。<\/span>

我们以人类成纤维细胞作为起始细胞, 转入FOXA3、HNF1A和HNF4A后, 可诱导获得具有功能的肝细胞(hiHep)[25]。hiHep细胞具有原代肝细胞的上皮样形态, 表达肝特异性基因。hiHep细胞能够积累糖原、分泌血清白蛋白、吸收和积累脂质。转分化获得的hiHep细胞还具有药物代谢和胆汁排泄功能。由于转分化产生的细胞不能持续增殖, 因此无法获得大量细胞用于体内治疗和生物医药的应用[26]。我们发现过表达SV40 Large T可以诱导hiHep细胞的持续增殖。可增殖的hiHep细胞同样具有肝特异基因表达、糖原贮存、脂质积累以及药物代谢等功能。<\/span>

我们采用了两种动物疾病模型来检验hiHep细胞的治疗效果。首先, 我们采用了Fah–/–小鼠模型。这种小鼠罹患致命肝脏代谢疾病, 需要依赖NTBC药物来维持肝脏功能。停止NTBC治疗后6~8周, 动物会全部死亡[27]。移植hiHep细胞可以使40%的Fah–/–小鼠在停止NTBC后仍然存活。我们进一步验证了hiHep细胞能否治疗刀豆蛋白诱导的急性肝衰竭小鼠[28]。我们用海藻酸钠–聚左赖氨酸–海藻酸钠形成的半透膜微囊包裹hiHep细胞来防止免疫排斥, 并维持物质交换。移植了hiHep细胞的14只急性肝衰竭小鼠中, 有5只完全康复; 而移植成纤维细胞或者HepG2肝癌细胞的对照组全部死亡。<\/span>

在我们工作发表的同时, 其他实验室也报道了从人类成纤维细胞转变为具有功能的肝细胞的方法[29-30]。今后可以通过转分化产生病人自体来源的功能肝细胞进行早期药物毒性研究、药物筛选以及细胞移植治疗, 这可以很大程度上解决肝供体不足以及不同个体表观遗传上的差异问题, 从而增强临床治疗效果[5]。<\/span>

3 展望<\/strong>
终末分化细胞基因表达、形态和功能的稳定维持对于高等动物保持组织器官的稳态和功能极为重要。这个相对稳定状态的维持需要多种机制的协同作用, 以防止细胞命运的转变。研究肝细胞癌化发生早期的信号通路, 有助于了解细胞癌化的机制, 从而发现有效防止肝癌发生的方法。利用转分化手段改变细胞命运而产生的hiHep细胞, 可作为实验模型研究细胞命运维持的机制, 也可用于肝脏疾病的研究模型或者晚期肝脏疾病的治疗手段。最后, 我们认为癌化和转分化两个细胞命运转变过程, 可能存在一些共同的调控机制。譬如, p53的激活可以抑制转分化和细胞癌化的发生。能否在此共同调控机制的基础上, 灵活地控制细胞命运的转变, 将有待科学家们后续的研究。<\/span>
<\/p>


参考文献 (References)<\/span>
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惠利健, 中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞研究所研究员。2003年于中国科学院上海生命科学院生化与细胞研究所获博士学位, 获得中国科学院院长奖和中国科学院优秀博士学位论文奖。<\/span><\/p>","cshort2":"

惠利健, 中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞研究所研究员。2003年于中国科学院上海生命科学院生化与细胞研究所获博士学位, 获得中国科学院院长奖和中国科学院优秀博士学位论文奖。2003年至2008年于奥地利维也纳分子病理学研究所从事博士后研究, 获得EMBO长期奖学金和居里夫人奖学金。2008年底回生化与细胞所工作, 担任研究员、博士生导师, 为中国科学院“百人计划”、上海市“浦江人才”获得者和上海市优秀学科带头人。2011年获中国青年科技奖和中国科学十大进展, 2012年获得国家自然科学杰出青年基金支持。惠利健研究员以肝细胞为研究对象, 长期从事细胞命运维持与转分化、癌化机理研究, 为肝癌等重症肝病治疗提供新策略。主要贡献有: (1)成功将成纤维细胞转分化为功能肝细胞, 给出获得功能肝细胞的一个全新方法(Nature 2011, Cell Stem Cell 2014); (2)运用小鼠遗传学模型和人类癌病组织, 揭示肝细胞的癌化分子机制(Nat Genetics 2007, J Clin Invest 2008, Nat Cell Biol 2012, Hepatology 2013)。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"细胞命运转变——癌化和转分化的研究","listseq":17,"seqno":"43","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-05-20-10-30-52-799"},{"caddress1":"(北京大学生命科学学院, 北京 100871)","cauthor":"蔡昌祖 周悦欣 朱诗优 魏文胜*","cintpic":"","clicktime":4,"clong1":"

探索基因及其表达蛋白在各种生理和病理过程 中的作用是生命科学领域研究的永恒主题。对原核 或者模式生物来说, 有相对简单和成熟的遗传技术手 段; 但是对高等生物特别是哺乳类细胞或者个体, 一 直缺乏有效方法实现对特定基因的精准修饰来进行 功能研究。随着近几年基因组靶向编辑技术的出现, 对单一真核基因进行定点改变的遗传手段得以迅速 发展。这一炙手可热的新型遗传工具包括锌指核酸 内切酶(zinc finger endonuclease, ZFN)[1-4]、类转录激活 因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)[5-7]以及成簇规律间隔短回文重 复及其关联蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR; CRISPR-associated protein 9, Cas9)[8-10]系统。CRISPR/Cas9系统因其简 便和高效的特性, 得到了最为广泛的应用与关注。 虽然对单一真核基因的修饰技术已经日趋 成熟, 在哺乳细胞内基于基因完全敲除进行大规模功能性筛选的方法依然空缺。RNA干扰(RNA interference, RNAi)文库曾被广泛应用于功能缺失型 基因筛选。这种文库主要分为siRNA和shRNA两类, 二者的原理都是通过RNA干扰降低目的基因的表达 来引起表型改变。不同之处在于, siRNA为人工合 成的短RNA片段, 只能在96孔或384孔等培养板中进 行彼此独立的表型筛选[11]; shRNA需要通过表达载 体实现作用, 因此可以构建到慢病毒等载体上通过 病毒侵染方式进行混合型文库筛选, 再通过微阵列 芯片(microarray)[12-13]或者深度测序(deep sequencing) 技术[14-15]对筛选后富集的shRNA进行解码和分析。 混合型shRNA文库筛选具有简便、经济、高效等特 点, 逐渐成为RNAi文库筛选的主流方案。利用RNA 干扰鉴定高等生物基因功能的技术虽然已经普及, 甚至被应用于高通量、全基因组规模的功能性筛选 中, 但是由于RNA干扰不能完全抑制基因表达, 常常 不足以造成稳定的表型变化, 从而影响对基因功能 的正确判断。另外, RNA干扰经常伴随脱靶现象, 其 基因回补验证的过程也非常繁琐复杂, 使用起来不 尽如人意。<\/span>

另外一种高通量功能性研究手段是基于 KBM7、HAP1等类单倍体细胞系进行的基因捕获 筛选(gene trapping)[16-17]。以KBM7细胞系为例[16], 其 染色体除第8号以外均为单拷贝, 在这样的细胞系中 可以通过随机插入突变实现基因敲除, 进行功能缺 失型基因筛选研究。然而这种方法局限于少数细胞 系, 而且类单倍体细胞核型极不稳定, 在培养过程中 很容易转变成二倍体型。另外, 被敲除基因的范围 和数目也难以控制, 文库质量得不到保障。<\/span>

为了验证上述思路的可行性, 我们首先构建 了带有Cas9及OCT1基因的慢病毒表达载体、包 装病毒并分别感染HEK293T、HT1080和HeLa细 胞, 得到上述细胞的Cas9稳定表达细胞系。我们 表达OCT1基因的目的是为了进一步增强用于转录 sgRNA的U6启动子[19]。同时我们也构建了sgRNA 的慢病毒表达载体, 将已被证实可以有效造成 CSPG4基因敲除的sgRNA序列克隆至该表达载体 上, 包装病毒感染上述稳定表达Cas9蛋白的细胞系, 培养5~8 d后, 通过T7核酸内切酶(T7 Endonuclease I, T7E1)检测证实, 通过慢病毒感染后表达的sgRNA能 够在稳定表达OCT1和Cas9的细胞系中对目标位点 造成序列增减错误(indel)。然而, 在上述三种细胞系 中, sgRNA产生的indel效率并不相同, HeLa细胞中 的效率明显低于另外两者。对单克隆细胞株的鉴定, 发现造成indel的效率在细胞个体间差别很大。我们 分离得到一个高效细胞株用于后续的建库实验。这 个结果说明, 利用慢病毒搭载sgRNA的策略是可行 的, 并且对一些“困难”的细胞系, 筛选高效的OCT1-Cas9表达系十分重要。另外, 我们还证明CRISPR/ Cas9结合慢病毒表达系统不会产生严重的脱靶效 应。<\/span>

基于上述验证, 本课题组开发了一种基于 CRISPR/Cas9系统的慢病毒聚焦型人源细胞文库、 功能性基因筛选平台以及基于高通量深度测序技术 解析数据的完整技术路线[20]。首先, 利用慢病毒感 染构建稳定表达Cas9以及OCT1蛋白的细胞系, 从中 筛选介导sgRNA切割目标基因组序列效率最好的细 胞克隆, 用来构建sgRNA文库。sgRNA质粒文库是 将设计及合成好的双链寡聚核苷酸通过Golden Gate 法[21]克隆到慢病毒载体完成, 这一载体同时表达 EGFP蛋白用于病毒感染细胞后通过流式细胞分选 得到sgRNA文库。整合进入染色体的sgRNA编码序 列可以通过PCR特异地扩增出来, 这些来自功能性 筛选富集获得的细胞和未经过处理的原文库细胞的 PCR扩增序列, 通过深度测序分析及比较, 可以获得 被富集的sgRNA序列信息以及其所对应的基因(图 1)。<\/span>

在这篇报道中[20], 我们针对感兴趣的291个可 能与炭疽毒素或白喉毒素毒性作用相关的基因设计 了总共869条sgRNA, 其中大多数基因设计了三条 不同的sgRNA。分别使用两种致病细菌毒素进行文 库筛选: 嵌合型炭疽毒素(PA/LFnDTA)和白喉毒素 (Diphtheria toxin)。经过三轮毒素重复处理之后, 对 照组细胞全部死亡时, 实验组细胞基本无可见死亡。 经过PCR扩增、深度测序以及统计分析, 发现在炭 疽毒素筛选后, 针对已知炭疽毒素受体ANTXR1编 码基因设计的三条sgRNA均得到了最大程度的富 集; 同样, 在白喉毒素筛选后, 针对已知的白喉毒素 受体的一条sgRNA也获得最高程度的富集。这说 明, CRISPR-Cas9文库可以起到有效地筛选功能相 关基因。除此之外, 我们还成功鉴定出PLXNA1、 PECR、FZD10以及CD81等与炭疽毒素作用机制相 关的新型蛋白, 与白喉毒素作用相关的RAB2A。<\/span>

较之于shRNA文库, CRISPR-Cas9文库通过靶 向基因的敲除制造表型变化, 可以使用更加严苛的 筛选标准, 更有效地去除假阳性; 而且有着成本低 廉、构建简单、操作方便等优点。<\/span>

在本工作被报导的同一时期, Science杂志刊登 的两篇文章[22-23]以及Nature Biotechnology杂志的一 篇文章[24]也分别报导了类似技术路线。主要差异在于, Zhang课题组将sgRNA和Cas9串联表达在同一个 慢病毒载体上, 通过感染将二者一次性转入细胞[22]; 而Lander课题组虽然将二者分别克隆在不同的载体 上, 但仅仅是将Cas9先转入细胞, 获得稳定表达细胞 系后不挑选单克隆直接使用携带有sgRNA的病毒进 行感染[23]。而我们的实验结果显示, 在细胞系中即 便Cas9的表达量相近, 同样一条sgRNA造成的indel 效率也可能会有较大差异。因此, 预选出高效率的Cas9稳定表达克隆对文库构建和筛选意义重大。此 外, 另外几个课题组都着眼于构建覆盖全基因组的 CRISPR-Cas9文库, 然而覆盖全基因组所需要的细 胞数目及其庞大, 实际操作极为困难。对大部分功 能性筛选, 我们认为策略性选择较小规模、基于以 往知识构建的聚焦型文库, 反而可以提高成功率。<\/span><\/p>

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图1 利用慢病毒载体搭载CRISPR/Cas9系统在哺乳类 细胞进行混合型功能性遗传筛选的流程图 Fig.1 Schematic of a pooled approach for functional screening in mammalian cells using a lentiviral CRISPR/Cas9 system<\/p>


总之, 这一高通量敲除技术的建立对基因的功 能性筛选鉴定具有重要意义, 未来在广泛的生命科 学研究领域将发挥巨大的推动作用。<\/span>
<\/p>


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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-29-46-866.jpg","cshort":"

魏文胜, 北京大学生命科学学院研究员。1999年7月毕业于密西根州立大学,获得遗传学博士学位; 之后在美国斯坦福大学医学院从事博士后研究, 2005年转为Research Associate。<\/span><\/p>","cshort2":"

魏文胜, 北京大学生命科学学院研究员。1999年7月毕业于密西根州立大学, 获得遗传学博士学位; 之后在美国斯坦福大学医学院从事博士后研究, 2005 年转为Research Associate。2007年7月获北京大学“百人计划”引进国外杰出 人才项目资助, 回国建立实验室。长期从事病原微生物和宿主细胞的相互 作用研究, 多篇第一或者通讯作者论文发表在包括Cell、Nature、PNAS等学 术杂志。近期, 在真核基因编辑技术的研发方面取得重要进展, 首次完成了 TALE蛋白碱基识别RVD的全部解码(Yang et al, Cell Res 2014), 并开发出基 于CRISPR/Cas9系统的人源细胞敲除文库, 用于基因的高通量功能性筛选研 究(Zhou et al, Nature 2014)。<\/span><\/p>","ctitle":"通过哺乳细胞CRISPR/Cas9敲除文库实现高通量功能性基因筛选","listseq":18,"seqno":"42","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-05-20-10-29-46-866"},{"caddress1":"(中国科学院上海药物研究所, 中国科学院受体结构与功能重点实验室, 上海 201203)","cauthor":"张凯华 赵 强*","cintpic":"","clicktime":4,"clong1":"

急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes, ACS)是一种常见的心血管疾病, 临床表现主要为不稳定心绞痛、非Q波心肌梗死、Q波心肌梗死和心脏缺血性猝死等[1]。即使得到最大限度的治疗, 仍然有5%~10%的ACS患者在初次发病后的一个月内出现心脏功能反复性失常, 甚至是死亡。我们知道, ACS属于冠心病的一种, 当冠脉内粥样斑块发生松动、裂纹或破裂时, 斑块内高度致血栓形成的物质暴露于血流中, 而这些物质将引起血小板在受损表面黏附、活化、聚集, 导致血栓的形成, 最终造成心肌血流灌注受损。因此, 血小板是ACS病理生理学上的关键因子。市场上也出现了诸多抗血小板药物, 它们有效缓解了这类患者的病情。血小板上有两种G蛋白偶联受体(P2Y1和P2Y12)与血小板聚集相关, 其中P2Y1受体开启微弱的血小板活化, 而由P2Y12受体缓慢渐进地将信号放大。再加上P2Y12受体在血小板膜上的表达占优势, 这使得P2Y12受体成为理想的抗血栓靶点。<\/span>

氯吡格雷是继噻氯匹定的第二代P2Y12受体拮抗剂, 需要在体内代谢成活性物质才能起到抗血小板效应。相似地, 随后出现的普拉格雷也是一种前体药物, 同样需代谢转变成活性成分。而替卡格雷是一种新型P2Y12抑制剂, 它并不直接抑制激动剂ADP结合到P2Y12受体上, 取而代之的是通过改变受体构象以阻止血小板活化[2]。其他的P2Y12受体拮抗剂包括坎格雷洛、依诺格雷等, 它们直接对P2Y12受体产生抑制作用。然而, 目前多数P2Y12受体抑制剂存在抗血栓疗效不足及治疗风险过高等缺陷, 同时, 个体受药差异性也比较严重。如何设计发展出抗血栓效果显著并有效降低自发性或手术后出血风险的P2Y12抑制剂, 仍然面临各种困难, P2Y12受体的三维结构以及受体配体识别方式等信息的缺失阻碍了我们对药物分子在受体上作用机理的理解, 进而制约了新的抗血栓药物的研发。<\/span>

人类基因组编码800多种G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs), 它们是规模最大、种类最多的膜蛋白家族之一[3]。近年来, 关于GPCRs的结构生物学发展迅速, 这得益于蛋白质组学技术和结晶学方法的突飞猛进[4]。通常蛋白序列中的灵活区域需要被改造, 高亲和力的配体被用来稳定受体性质, 然后选择合适的去污剂在脂立方相(lipidic cubic phase)方法下进行结晶实验, 这使高分辨率晶体结构解析变得更有可能。<\/span>

从2000年至今, 陆续有21种GPCRs的晶体结构和1种GPCR(CXCR1)的NMR结构被发表, 这些结构主要集中在class A家族, 但也覆盖了class B、class C和class F家族。除视紫红质受体(rhodopsin)本身存在天然配体外[5], 其他解析的GPCR结构中其配体都是再结合。这些晶体结构中结合拮抗剂的受体有: 人源趋化因子受体4(human chemokine receptor type 4, hCXCR4)[6]、人源多巴胺受体3(human dopamine receptor 3, hD3R)[7]、人源组胺受体1(human histamine receptor 1, hH1R)[8]、人源κ型阿片受体(human kappa opioid receptor, hκ-OR)[9]、小鼠μ型阿片受体(mouse mu opioid receptor, mμ-OR)[10]、小鼠δ型阿片受体(mouse delta opioid receptor, mδ-OR)[11]、人源孤菲肽受体(human nociceptin/orphanin FQ receptor, hNOP)[12]、人源蛋白酶激活受体1(human protease-activated receptor 1, hPAR1)[13]、人源鞘氨醇受体(human sphingosine 1-phosphate receptor, hS1PR1)[14]、人源促肾上腺皮质激素释放因子受体1(human corticotropin-releasing factor receptor type 1, hCRF1)[15]、人源胰高血糖素受体(human glucagon receptor, hGCGR)[16]和人源SMO受体(human smoothened receptor, hSMOR)[17]; 结合激动剂的受体有: 大鼠神经降压素受体1(rat neurotensin receptor 1, rNTSR1)[18]、人源5-羟色胺受体2B(human 5-hydroxytryptamine receptor 2B, h5-HT2B)[19]和人源5-羟色胺受体1B(human 5-hydroxytryptamine receptor 1B, h5-HT1B)[20]; 既有结合拮抗剂也有结合激动剂的受体: 人源β2肾上腺素能受体(human beta2 adrenergic receptor, hβ2AR)[21-22]、火鸡β1肾上腺素能受体(turkey beta1 adrenergic receptor, tβ1AR)[23-24]、人源A2腺苷受体(human alpha2 adenosine receptor, hA2AR)[25-26]、人源M2乙酰胆碱受体(human M2 muscarinic acetylcholine receptor, hM2mAChR)[27-28]。而大鼠M3乙酰胆碱受体(rat M3 muscarinic acetylcholine receptor, rM3mAChR)[29]、人源趋化因子受体CCR5(human CCR5 chemokine receptor, hCCR5)[30]和人源代谢型谷氨酸受体1(human metabotropic glutamate receptor 1, hmGlu1)[31]结构中配体为变构调节, 并且人源M2乙酰胆碱受体(human M2 muscarinic acetylcholine receptor, hM2mAChR)[28]也有变构调节剂结合的晶体结构被发表。<\/span>

这里, 我们首次报道P2Y12受体与一种抗血栓药物的复合物晶体结构, 分辨率在2.6埃。从系统进化来看, P2Y12受体属于class A家族中的delta分支。为了达到顺利结晶的目的, 我们基于P2Y12野生型序列, 在第三个胞内环区插入了热稳定性脱辅基细胞色素 b562 RIL(BRIL), 在位于第七个跨膜区的N[D]P7.50xxY 基序中引入提高蛋白产量的D2947.49N(上标采用Ballesteros-Weinstein命名法)突变。并使用来自阿斯利康公司的抗血栓候选药物AZD1283(ethyl 6-(4-((benzylsulfonyl)carbamoyl)piperidin-1-yl)-5-cyano-2-methylnicotinate)作为配体, 其本质是P2Y12受体的一种非核苷酸类可逆性拮抗剂。这些措施显著提高了蛋白性质, 并且生物功能实验证明对蛋白序列进行的改造并没有破坏P2Y12受体的天然构象。<\/span>

P2Y12受体的晶体结构包含典型的七次跨膜螺旋, 螺旋之间存在相互作用, 形成稳定的堆叠。而这种保守的三维空间结构正是GPCR发挥重要生物功能的基础。因为第三个跨膜螺旋处于结构的中心位置, 并与剩余其他跨膜螺旋(除第一个距离较远外)形成保守的相互作用, 所以第三个跨膜螺旋构成了P2Y12结构骨架的核心。与其他已知结构的GPCR进行跨膜区域比较, 可以发现P2Y12的第五个以及第六个跨膜螺旋发生很大的变化, 尤其是第五个跨膜区域非常突出, 表现得直且长。结构中明显可见由N末端上C17与第七个跨膜螺旋上C2707.25形成的一对二硫键, 但是另一对被认为保守的二硫键(C97-C175)并未观察到, 这可能与第二个胞外环区(C175位于此区域)的柔性有关。P2Y12受体结构中结合有两个胆固醇分子, 揭示了胆固醇分子在受体信号传导中的作用机理(图1A和图1B)。<\/span>

AZD1283在P2Y12受体上的结合口袋由第三个到第七个跨膜螺旋形成。在此前解析的GPCR结构中, 只有PAR1以类似的方式与配体相互作用。而这也可能是delta家族受体的共有特征。结合口袋中的一系列氨基酸侧链参与了多对与配体间的极性和疏水作用。可以观察到Y1053.33的苯环与AZD1283的烟酸基团、哌啶基团分别形成了π-π、疏水相互作用, 而F2526.51、R2566.55、Y2596.58、L2767.31和K2807.35形成的疏水口袋容纳着AZD1283的苯基(图1C和图1D)。<\/span>

有功能实验显示, 在P2Y12受体结构中未形成二硫键的C97与某些药物(比如普拉格雷)活性代谢产物可发生共价结合。而C97所在的位点却不包含于AZD1283的结合口袋, 这也暗示着P2Y12受体可能存在其他的配体结合口袋, 容纳与AZD1283不同的配体。建立分子对接模型后, 我们发现R-138727(普拉格雷的活性代谢产物)的结合位置与AZD1283所在的结合位置并无直接重叠。其他报道又提示核苷酸类配体(如2MeSADP等)与药物活性代谢产物(如R-138727等)的结合位置一致, 并且配体结合实验也支持这种可能性, 即P2Y12受体潜在的非单一配体结合口袋是嘌呤能受体与配体结合的特色机制。<\/span><\/p>

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A: P2Y12受体的卡通图。P2Y12结构、AZD1283分别用浅绿色带和紫红色球表示。另外黄色碳骨架表示胆固醇和脂类, 黄色棒条表示二硫键, 而黑色虚线和紫色虚线分别表示结构信息丢失的序列和胞膜边界; B: P2Y12(浅绿色圆柱)受体与β2肾上腺素受体(PDB ID: 2RH1, 棕色)、凝血酶受体PAR1(PDB: 3VW7, 浅蓝色)比较的侧面图。配体颜色: AZD1283: 紫红色; carazolol: 蓝绿色; Vorapaxar: 黄色; C: P2Y12受体中结合AZD1283(紫红色碳骨架)的关键氨基酸(绿色碳骨架); D: P2Y12与AZD1283结合的示意图。虚线表示极性相互作用。其他元素: 氧: 红色; 氮: 深黑色; 硫: 黄色。<\/span>
A: cartoon representation of P2Y12R. P2Y12R is coloured green. AZD1283 is shown as magenta spheres. Cholesterol and lipids have yellow carbons. The disulphide bridge is shown as lime sticks. Missing loops and membrane boundaries are indicated as black and blue dashed lines, respectively; B: side views of P2Y12R (green cylinders) compared with β2AR (PDB accession 2RH1, brown) and PAR1 (PDB accession 3VW7, blue). The ligands AZD1283, carazolol and vorapaxar are shown as sticks with magenta, cyan and yellow carbons, respectively; C: key residues (green carbons) in P2Y12R for AZD1283 (magenta carbons) binding; D: schematic representation of interactions between P2Y12R and AZD1283. Polar interactions are shown as red dashed lines. Other elements are coloured as follows: oxygen: red; nitrogen: dark blue; sulphur: yellow.<\/span>
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图1 P2Y12受体结合拮抗剂AZD1283的晶体结构(根据参考文献[32]修改)
Fig.1 The crystal structure of P2Y12 receptor in complex with an antagonist AZD1283 (modified from reference [32])<\/p>


参考文献 (References)<\/span>
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32 Zhang K, Zhang J, Gao ZG, Zhang D, Zhu L, Han GW, et al. Structure of the human P2Y12 receptor in complex with an antithrombotic drug. Nature 2014; 509(7498): 115-8.<\/p>


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赵强, 2002年加入清华大学饶子和院士的研究组, 并于2007年初获得清华大学博士学位。之后加入美国Scripps研究所Ray Stevens研究组做博士后, 开始从事膜蛋白结构尤其是G蛋白偶联受体的结构研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

赵强, 2002年加入清华大学饶子和院士的研究组, 并于2007年初获得清华大学博士学位。之后加入美国Scripps研究所Ray Stevens研究组做博士后, 开始从事膜蛋白结构尤其是G蛋白偶联受体的结构研究。2011年入选中国科学院“百人计划”, 进入上海药物研究所成立课题组, 开展G蛋白偶联受体(G-protein coupled peceptor, GPCR)的高分辨率结构解析以及基于结构的新药发现等研究, 主要集中在以下几个方向: GPCR结构解析新技术的开发与应用; 心血管疾病、自身免疫病、代谢性疾病中关键GPCR的结构解析及其作用机制研究, 以及基于结构的新药开发; GPCR与下游分子的复合物结构研究。2014年, 赵强研究员带领团队相继解析出嘌呤能受体P2Y12分别结合拮抗剂类抗血栓药物和激动剂的三维晶体结构(Zhang K et al. Nature, 2014; Zhang J et al. Nature, 2014), 这些结构为深入理解P2Y12受体介导血栓形成的分子机制以及受体分别结合不同类型配体的相互作用模式提供了新的线索, 有助于新型抗血栓药物的研发。<\/span><\/p>","ctitle":"抗血栓靶点P2Y12受体的结构学研究","listseq":19,"seqno":"41","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-05-20-10-28-53-637"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所, 上海 200031)","cauthor":"田雪莹 周 斌*","cintpic":"","clicktime":6,"clong1":"

冠状动脉是为心肌供应血液的血管, 在医学上具有非常重要的意义。当冠状动脉较大的分支发生堵塞时, 下游心肌因缺血缺氧导致急性心肌梗死。随后, 受损的心脏通过瘢痕组织替代损伤的心肌, 以维持心室壁的完整性, 而心脏的泵功能却受到了不可逆的影响, 最终导致心力衰竭[1]。<\/span>

冠心病引起的心梗是全世界因疾病死亡的首要原因。冠状动脉是如何发育的, 这是一个对于人类健康和疾病具有重要意义的基础生物学问题。冠状动脉血管的发育以及冠状动脉干连接到胚胎封闭的血管系统, 是胚胎持续生长和存活的基础。随着心脏发育生长和腔室壁增厚, 氧气和营养物质的被动扩散被重构扩大形成的成熟冠脉系统血管丛所替代。尽管心脏血管发育这一课题已经相对密集地研究了一个多世纪, 关于冠状动脉血管的细胞起源和组织来源问题仍在不断地争论。明确冠状动脉起源的发育过程, 将为先天性心脏病和成年心血管疾病冠状动脉血管损伤修复和再生提供重要信息[2]。<\/span>

最近, 围绕冠状动脉发育起源和心血管细胞的组织来源以及决定其命运和功能的特异性信号开展了许多讨论。目前认为, 前体心外膜结构(pro-epicardial organ, PEO)/心外膜、静脉窦(sinus venosus, SV)和心内膜为冠状动脉内皮潜在的细胞来源。<\/span>

早期的解剖学观察证明, 冠状动脉血管仅仅是主动脉的分支, 但是后来观察到冠状动脉伸入主动脉的研究对此提出了质疑[3]。最近, 逆转录病毒标记、腺病毒细胞谱系示踪和鸡–鹌鹑嵌合体(chimera)研究提出PEO是冠状动脉血管的来源[4-6]。PEO是一个短暂的心外间皮细胞群, 位于鸡的静脉窦和肝脏之间, 小鼠的横隔表面[7]。PEO细胞迁移到正在发育的心脏, 形成包裹在表面的心外膜。心外膜来源的祖细胞亚群从原始上皮分层而来, 经过上皮–间质转变(epithelial-mesenchymal transition, EMT)产生一群间质细胞, 迁移到下面的心肌层并形成血管平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞和心肌细胞[4,8-10]。冠状动脉来源于心外膜的观点是有争议的。不是所有的血管内皮细胞都是由心外膜参与形成的[11]。诱导小鼠前体心外膜中的Cre重组酶表达, 标记一部分(Scx-Cre和Sema3d-Cre)[12]或很少的(Wt1-Cre和Tbx18-Cre)[9-10,13]冠状动脉内皮细胞。目前, 越来越多的研究表明, 几乎没有冠状动脉内皮是PEO心外膜来源的。在鸡–鹌鹑嵌合体研究中, 内皮免疫组化显示冠状动脉内皮是由肝窦通过PEO延伸到静脉窦腔内而来的, 随后提出肝脏是内皮祖细胞最初的来源。在小鼠发育期间, 利用谱系示踪(lineage tracing)和命运图谱(fate mapping)技术, 研究人员很少观察到心外膜来源的内皮细胞[14-15]。<\/span>

最近, 在小鼠的研究中表明, 冠状动脉来源于静脉窦的血管生成萌芽, 静脉窦是位于胚胎心脏流入部位内皮衬里的腔[16]。在巨头鲸经典胚胎学研究中, 已经确定静脉窦是心脏最早出现血管的部位[17], 在小鼠中也已经证实未分化的冠状动脉血管网与静脉窦相连[18]。Red-Horse等[16]最近的研究发现, 冠状动脉内皮起源于静脉窦。通过ephrinB2-lacZ报告基因对lacZ+内皮细胞的命运作图, 确定了冠状动脉萌芽与静脉窦是连续的, 而不是来源于PEO。器官培养和组织重组证明, 内皮细胞生长限制在静脉窦和心房, 依赖于来自心室和心外膜的未知信号, 用可诱导的VE-cadherin-CreER转基因克隆分析, 在体内定位起源并对冠状动脉内皮祖细胞命运作图。通过早期(胚胎7.5天)诱导VE-cadherin-CreER的克隆分析表明, 冠状动脉祖细胞来源于已分化的静脉, 由于动静脉是从静脉窦出现的, 在冠状动脉萌芽中从静脉(EphB4+)到动脉(EphB2+)的分子识别标志转换证实了这一观点。<\/span>

克隆分析也揭示了心内膜是冠状动脉内皮的第二个来源[16]。在小鼠中, 心内膜细胞位于生心区内从Vegf-2+的多潜能祖细胞分化而来的最早的内皮细胞之中[19]。它们通过重新生长或血管发生形成一个心内膜的管[20], 后来变成心脏的内层上皮衬里或心内膜, 接着通过内皮–间质转化参与形成心脏瓣膜和膜性室间隔[21]。与心内膜内皮细胞相比, 冠状动脉内皮细胞出现较晚, 在发育的心脏中建立了心内膜内皮细胞参与形成冠状动脉内皮的潜能, 虽然到目前为止这一观点仍有争议。在发育的大鼠心脏以及随后在小鼠中描述了原始血管床的出现可能是心内膜的延续, 通过心内膜的内陷套叠形成心脏的第一根血管[7,22]。相反, 鸡中的逆转录病毒示踪表明, 冠状动脉血管内皮除心内膜内皮外, 有一个不同的克隆起源[8]。Red-Horse等[14]首次运用基因示踪和克隆技术发现冠状动脉内皮细胞的心内膜起源, 虽然观察到心内膜细胞很少参与血管内皮的形成, 但是描述了心内膜萌芽形成内皮血岛(blood island)的过程, 提出了血岛可能加入静脉窦来源的血管丛的假说。<\/span>

冠状动脉有三层组织: 由内皮组成的内层、平滑肌细胞组成的中间层和成纤维细胞组成的外层。在冠状动脉形成过程中, 内皮层是最早形成的。原始冠状动脉血管(或冠状动脉丛)由一层内皮细胞组成。然后, 冠状动脉丛招募平滑肌细胞和成纤维细胞组装成成熟的动脉。内皮也是成年冠状动脉疾病首先发生的部位。因此, 确定冠状动脉内皮的细胞起源是阐明冠状动脉发育或再生的机制所必需的。心内膜是心脏内部的上皮层。心内膜细胞是发育过程中必需的最早的内皮细胞群之一, 由生心区的多能干细胞分化而来。通过血管发生过程形成心内膜管, 后来变成心脏的心内膜。冠状动脉血管的内皮细胞在发育晚期出现, 并在心肌层形成冠状动脉血管。心室的心内膜细胞被认为是终末分化的, 在冠状动脉血管形成中贡献很少内皮细胞。最近, Wu等[23]的研究认为, 心室心内膜细胞是冠状动脉内皮的主要来源。心肌Vegf-a到心内膜Vegfr-2信号通路是心室心内膜细胞分化为冠状动脉内皮所必需的。由于心内膜细胞和内皮前体细胞非常相似, 不易进行明确的谱系示踪和嵌合体分析, 因此心内膜内皮细胞是否广泛参与冠状动脉血管的形成仍有待确定[15]。<\/span>

为了追溯冠状动脉的细胞起源, 根据Apln基因在冠状动脉内皮细胞中表达, 而在心内膜内皮细胞中不表达的特点, 我们首次成功构建了AplnCreER基因敲入小鼠, 对冠状动脉内皮细胞进行遗传标记谱系示踪。小鼠心脏在胚胎发育11.5天(E11.5)开始形成血管。我们通过在胚胎发育10.5天(E10.5)给AplnCreER基因敲入小鼠灌注他莫昔芬(tamoxifen), 诱导Cre报告等位基因的重组, 永久地标记早期冠状动脉新生血管内皮细胞及其子代细胞。在胚胎发育15.5天(E15.5)观察到, 几乎标记了胚胎心室壁所有的冠状动脉血管。我们发现心外膜下内皮细胞是心脏发育过程中心肌内冠状动脉血管的主要来源, 既能够迁移到胚胎心室的致密心肌层形成冠状动脉, 也能够在心室表面形成冠状静脉。这些心外膜下内皮细胞主要来源于静脉窦和心房的心内膜, 是心脏发育过程中冠状动脉和静脉共同的起源[24]。<\/span>

关于冠状动脉起源, 以往的研究大多集中在胚胎发育中期, 即冠状动脉血管在心脏上最初形成的时期。而且, 普遍认为出生后的冠状动脉血管就是来源于这些胚胎期已经形成的冠状动脉血管。然而这种假设并没有严格地论证过。胚胎期冠状动脉血管最初形成血管丛覆盖心脏外表面。心肌组织由致密心肌层和心肌小梁两部分组成。外侧的致密心肌层形成游离心室壁, 而内侧的心肌小梁向心室腔内形成指状凸起。致密心肌层中发育形成心肌内冠状动脉血管, 而心肌小梁因缺乏心肌内冠状动脉血管, 直接与心室腔内的血液进行氧气和营养物质交换。然而, 在出生后心脏内侧的心肌小梁经过致密化, 与外侧致密心肌层融合。心脏内侧新形成的致密心肌层得到了冠状动脉血管丰富的血液供应。出生后新形成的致密心肌层发生血管化的发育过程, 以前是未知的。<\/span>

我们将E10.5通过AplnCreER激活标记上的冠状动脉血管群定义为第一冠状动脉血管群。随后, 我们继续观察在出生后0天(P0)到7天(P7)的新生小鼠心脏中第一冠状动脉血管群的命运。我们发现, 在出生后3天(P3)和7天(P7), 标记上的冠状动脉血管仅限于外侧心室壁。在此期间, 心肌致密化过程伴随着内侧心室壁中未标记的冠状动脉血管的逐渐增多。通过冠状动脉内皮细胞分子标记物APLN和FABP4(fatty acid binding protein 4)抗体的免疫组织化学染色, 证实了这些血管确实是冠状动脉血管。这些数据表明, 新生小鼠心脏内侧心室壁中新形成的血管并不是来源于第一冠状动脉血管群, 而是另有起源。在E10.5用他莫昔芬诱导, 很少标记室间隔的血管内皮细胞。在E13.5用他莫昔芬诱导, 标记上了为室间隔供应血液的冠状动脉血管, 这些血管也不是来源于第一冠状动脉血管群。<\/span>

这些新生冠状动脉血管究竟起源于哪里？为了揭示起源之谜, 我们构建了心内膜特异性Nfatc1CreER基因敲入小鼠。在冠状动脉血管形成之前, 通过他莫昔芬诱导, 标记E8.5到E9.5的心内膜细胞, 我们观察到, 出生后7天(P7)的小鼠心脏内侧心室壁中大多数血管内皮细胞都被标记上了, 表明新生小鼠心脏内侧心室壁中的冠状动脉血管内皮细胞是在心肌小梁致密化的过程中通过心内膜细胞发生谱系转换而来的。此外, 我们还观察到在胚胎期和新生小鼠心脏中, Nfatc1CreER标记了大多数室间隔中的冠状动脉血管内皮细胞。表明室间隔和内侧心室壁一样, 都是心内膜细胞经过谱系转换成为冠状动脉内皮细胞的。我们将来源于心内膜的这两部分血管定义为第二冠状动脉群。定量分析表明, 第二冠状动脉血管群为心脏的大部分心肌(60%以上)供应血流, 对出生后心脏自身的血液供应具有重要意义。<\/span>

我们的研究首次揭示了心内膜是大部分冠状动脉血管的起源。我们发现心脏的一部分冠状动脉血管是在出生后新生成的, 打破了以往研究认为出生后心脏的冠状动脉血管是由胚胎期已经形成的血管扩增而来的观念。心室壁外侧的冠状动脉血管来源于胚胎发育早期生成的血管。位于室间隔中的冠状动脉血管是在胚胎发育中期形成的。而心室壁内侧的冠状动脉血管是在出生后新生成的。依据冠状动脉血管发育在时间和空间上的差异, 首次提出冠状动脉血管的起源可以划分为两个血管群: 即位于心室壁外侧的第一冠状动脉血管群和心脏内部(包括心室壁内侧和室间隔)的第二冠状动脉血管群(图1)。<\/span>

我们还发现, 来源于两个血管群的冠状动脉血管是通过不同的发育机制形成的, 而且在出生后仍然保持在空间上的分隔。第一冠状动脉血管群来源于胚胎心脏最初的冠状动脉血管丛产生的心外膜下祖细胞。心内膜是第二冠状动脉血管群的起源。心内膜不仅仅是内衬于心肌小梁的一层膜, 心内膜干/祖细胞可以分化为成纤维细胞、间充质细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞等。心内膜干/祖细胞作为冠状动脉血管内皮细胞库, 在心肌小梁融合的过程中发生迁移并分化为血管内皮细胞, 是出生后冠状动脉血管迅速增多的有效方式, 从而提供充足的血流灌溉为增强泵功能而迅速增厚的心肌层。这种出生后冠状动脉血管快速生长的内源性机制为探索先天性心脏病的发病机制、诊断和治疗提供重要线索,也为冠心病引起心梗后冠状动脉血管损伤修复和再生治疗以及体外人工心脏血管生成奠定理论基础并提供新的思路和途径[2]。<\/span>
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遗传谱系示踪技术显现新生小鼠心脏中的第一冠状动脉血管群(1st CVP, 蓝色)和第二冠状动脉血管群(2nd CVP, 黄色)。 The first coronary vessel population (1st CVP, blue) and the second coronary vessel population (2nd CVP, yellow) were visualized by genetic lineage tracing.
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图1 第一和第二冠状动脉血管群
Fig.1 1st and 2nd coronary vessel population<\/p>


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周斌, 中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究员。2002年毕业于浙江大学医学院, 获学士学位; 2006年毕业于中国医学科学院协和医科大学, 获博士学位; 2006~2010年在美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院从事博士后研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

周斌, 中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究员。2002年毕业于浙江大学医学院, 获学士学位; 2006年毕业于中国医学科学院协和医科大学, 获博士学位; 2006~2010年在美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院从事博士后研究。2009年担任哈佛大学医学院讲师和助理研究员。2010年受聘于中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所担任研究员和研究组长。2011年入选中国科学院“百人计划”获择优支持, 同年获得上海市“浦江人才”和“赛诺菲–安万特—中国科学院上海生命科学研究院优秀青年人才奖”, 2012年获得国家基金委首批优秀青年科学基金, 2013年获得中央组织部首批万人计划“青年拔尖人才”支持, 2014年获得“中国科学院上海分院第四届杰出青年科技创新人才奖”。周斌研究员主要从事心脏发育与再生过程中心脏干细胞的起源及命运、揭示先天性心脏病及成体心血管疾病的分子调控机制以及新一代遗传谱系示踪技术的建立及应用等研究工作, 并致力于推动心脏干细胞在心脏损伤修复和再生医学中的应用。周斌研究组利用已建立的多种转基因小鼠模型结合遗传谱系示踪技术揭示了冠状动脉起源之谜, 发现心内膜是大部分冠状动脉血管的起源, 新生小鼠心脏具有新生血管的能力(Tian et al. Science, 2014)。近期的研究论文发表在Nature、Science、Cell Stem Cell、Cancer Cell、J Clin Invest、Circ Res、Cell Res、Proc Natl Acad Sci USA、 J Biol Chem等学术期刊上。<\/span><\/p>","ctitle":"揭示冠状动脉起源之谜——心内膜","listseq":20,"seqno":"40","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"20-05-20-10-27-59-675"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所, 中国科学院食品安全重点实验室(筹), 上海 200031)","cauthor":"李晓光 王 慧*","cintpic":"","clicktime":5,"clong1":"

胆囊癌是一种高度恶性的消化道肿瘤, 居消化道 肿瘤第5位, 其发病具有典型的地域性、种族和性别 差异性, 女性发病率显著高于男性, 男女发病的性别 比为1:(3~4)[1]。胆囊癌与遗传、饮食习惯、生活方式、 营养代谢、激素等多种因素有关[2]。流行病学调查表明,胆结石是胆囊癌最重要的高危诱发因素, 尤其是伴发 胆囊炎的患者; 其他高危因素包括胆囊钙化、胆囊息 肉以及致癌物接触。智利是目前全球胆囊癌发病率最 高的国家, 其中男性为7.0/10万, 女性为13.4/10万, 这与 该国家人口胆囊结石高发相关[2-3]。统计显示, 男性高 发病率集中在韩国和日本, 女性高发于印度、秘鲁、 韩国、日本、哥伦比亚和美国[2]。在我国, 近年来胆 囊癌男女发病率和死亡率均呈现明显上升趋势。病人主要以老年女性为主, 西北和东北地区发病高于 长江以南地区, 农村比城市发病率高, 其中以陕西省 最高[4]。以上海市为例, 最新统计显示男性胆囊癌发 病率为5.61/10万, 女性为10.03/10万, 这一数据均超 过世界中等发病水平[5]。<\/span>

由于胆囊癌起病隐匿, 往往发现时已经处于疾 病晚期, 早期诊断困难, 根治机会少, 目前治疗主要 依靠手术, 总体预后极差, 80%以上的胆囊癌患者生 存不足一年, 五年生存率仅为5%, 总体中位生存时 间为8~10个月[6]。68%~98%的胆囊癌病人伴有胆 石症, 且胆石症病人患癌率较正常人高2~3倍, 结石 直径>3 cm比<1 cm的病人患胆囊癌风险高10倍[7-8]。 遗传因素在胆囊癌发病中发挥重要作用, 但这方面 研究相对较少。多数研究聚焦在单个或者少数基因 在胆囊癌中的突变(如TP53、KRAS、CDKN2A等)[2,9-10] 或异常表达(EGFR/HER2、MUC4等)[11-14]。目前认为, 有两条途径可以诱导胆囊癌的发生, 即胆囊结石–慢 性胆囊炎–胆囊癌途径和胰胆管合流异常相关胆囊 癌发生途径, 前者作为胆囊癌发生的主要途径常见 于世界各地病人, 而后者多见于日本患者。令人遗 憾的是, 胆囊癌对于临床上标准的细胞毒治疗方案 (放疗和化疗)极度不敏感, 关于胆囊癌的诊断和治 疗目前仍无突破性进展[2,6]。因此, 深入研究胆囊癌 发生发展的分子生物学和分子遗传学特征, 明确胆 囊癌的分子分型、寻找早期高敏靶标, 对有效预防 和治疗胆囊癌极为重要。<\/span>

新一代测序技术(next generation sequencing)的 迅猛发展为疾病研究带来了新的契机。人类全基因 组测序成本费用高及数据量庞大等因素限制, 催生 了全基因组外显子捕获测序技术。与前者相比, 外 显子测序仅针对人类基因组序列1%外显子区的蛋 白编码信息进行研究, 其覆盖深度更深, 数据更为准 确, 可用于寻找单基因病或包括癌症在内的复杂疾 病的致病基因[15-16]。利用外显子测序技术对肿瘤进 行深入研究, 有助于寻找肿瘤相关的癌基因、抑癌 基因及相关突变的最佳药物靶点, 因而成为肿瘤遗 传学致病基因研究最为有效的策略之一[17]。该技术 能够发现外显子区域大部分疾病相关变异, 可检测 常见基因变异和<5%的低频突变, 适合大样本人群 研究, 通过系统比对揭示这些疾病的遗传致病机理 和驱动基因。靶基因深度测序技术是针对感兴趣的 目的基因的蛋白编码区域DNA或其他特定区域进行捕获, 富集后进行高通量超深度测序的一种基因 组分析方法。该方法通过目标区域测序可以对候选 位点或候选基因进行验证, 也可以用于药物敏感性 筛查和药靶基因的发现。<\/span>

目前, 系统阐述与胆囊癌相关的体细胞突变图 谱的研究尚属空白, 利用先进的全基因组外显子测 序结合靶基因深度测序技术, 系统研究胆囊癌和正 常细胞之间的基因谱系差异, 就有可能发现与胆囊 癌发生密切相关的基因变异类型, 为发现有关驱动 胆囊癌发生及生长的分子途径和潜在的药物靶标提 供重要线索。研究中, 我们选择了57对原发胆囊癌 患者, 并收集每例患者术后的癌及癌旁组织, 并对患 者进行定期跟踪随访。首先, 我们使用Illumina公司 的Solexa系统对32对样本进行全基因外显子组测序 (whole-exome sequencing), 平均测序深度为50x。通 过严格筛选标准过滤, 共获得了1 450个体细胞单核 苷酸变异(single-nucleotide variations, SNV)和34个 体细胞插入或缺失突变, 这些变异均导致蛋白编码 序列的改变。具体发现如下:<\/span>

(1)胆囊癌的体细胞突变以APOBEC突变类型 为主。有报道表明, 根据基因组核苷酸突变的模式 可以推测细胞突变发生的机制。APOBEC嘧啶脱氨 基酶是一种能将胞嘧啶转化为尿嘧啶的酶, 这种改 变主要发生于TCN三核苷酸元件上, APOBEC突变 类型常发生于癌症基因组中, 如HER2阳性的乳腺 癌、肺癌、膀胱癌等[18-19]。我们发现, 41.6%的胆囊 癌的体细胞单核苷酸突变以C>T/G>A为主, 且主要 发生在TCN, 尤其是TCA这种APOBEC作用元件上, 这一结果提示, APOBEC介导的突变模式在胆囊癌 发病过程中可能发挥一定作用。<\/span>

(2)揭示ERBB家族基因为胆囊癌新型驱动基 因。我们在这些肿瘤样本中发现了包括TP53、CS、 ERBB3、ERBB2等在内的23个基因存在3个或3个以 上的体细胞突变。众多研究已证实, 肿瘤相关基因 (cancer-related genes)在绝大多数肿瘤的发生发展过 程中发挥了重要作用。为了进一步探究上述胆囊癌 突变基因及其他已报道的肿瘤相关基因在胆囊癌中 的遗传变异情况, 我们采用了靶基因超深度测序技 术(ultra-deep targeted gene sequencing), 在51对胆囊 癌样本中对283个靶基因进行了深度测序, 平均测序 深度为367x。这283个靶基因筛选标准如下: 在32对 胆囊癌中发现的胆囊癌高频突变基因(如TP53、CS、ERBB3、ERBB2等)、根据COSMIC数据库统计得到 的肿瘤高频突变基因以及与肿瘤药物敏感性相关基 因、其他消化系统肿瘤高频突变基因。经过严格筛 选和矫正, 我们在51对样本中发现了271个体细胞非 同义突变, 其中统计数据显示, TP53、KRAS和ERBB3 突变最为显著(FDR<0.05, 通过MutSigCV软件计算)。 TP53作为最为重要的抑癌基因, 其在胆囊癌病人中 的突变频率为47.1%, 这一数据与之前研究报道胆囊 癌TP53的突变频率在50%以上相类似[2,20-21]。有研究 显示, 在胆囊癌中存在KRAS 12或13位密码子的激活型突变[21]。与之相类似, 我们的研究发现, 在胆囊癌 病人中存在7.8% KRAS突变, 其均发生在为12或13 位密码上, 该突变能够导致KRAS组成型激活, 进而 促进肿瘤细胞的生长和增殖。有趣的是, 我们首次 在胆囊癌组织中发现人表皮生长因子受体家族基因 (epidermal growth factor receptor family)在胆囊癌中 存在高频突变(ERBB3, 11.8%; ERBB2, 9.8%; EGFR, 3.9%; ERBB4, 3.9%), 且这些基因在胆囊癌病人中存 在突变互斥(mutual exclusion)现象(图1A和图1B)。 研究已证实, ERBB受体酪氨酸激酶参与了多种肿瘤发生发展过程, 尤其是EGFR和ERBB2的过表达或 激活现象存在于多种上皮性肿瘤中。有研究报道, 在33%~64%的胆囊癌组织中存在ERBB2基因扩增 或过度表达现象[22-23]。此外, 在小鼠转基因模型中, 胆囊上皮组织特异性过度表达ERBB2可以导致小鼠 胆囊癌的发生[24]。而有关ERBB家族基因高频突变 尚属首次, 这一结果提示, ERBB信号通路的异常激 活参与了胆囊癌的发生发展过程。需要指出的是, 我们发现在ERBB家族基因中ERBB3突变频率最高, 此前在胆囊癌中尚未发现该基因的遗传变异、过度 表达或激活现象。ERBB3是ERBB家族的一个特殊 的成员, 该蛋白只能通过其胞外端与同家族其他受 体(通常为ERBB2)结合形成异源二聚体才能激活胞 内下游信号通路。研究中我们发现, 5/6的ERBB3突 变位点集中于其胞外端, 其中4/5的突变发生在104 密码子(V104)上, 提示V104为胆囊癌组织中ERBB3 基因的突变热点。我们进一步通过RNA干扰和点 突变过表达技术评估了野生型和突变型ERBB3和 ERBB2蛋白在细胞生长和侵袭转移过程中的作用, 证实了ERBB2和ERBB3蛋白赋予了胆囊癌细胞生 长和浸润能力, 而来源于肿瘤病人的相应突变体能 进一步促进这一效果, 这一结果提示, ERBB受体酪 氨酸激酶在胆囊癌的发病和恶性进展中发挥重要功 能, 可能作为胆囊癌发生的重要驱动基因。<\/span>

(3)ERBB信号通路突变与胆囊癌病人临床预后显 著相关。我们进一步对胆囊癌突变基因进行了信号 通路富集分析, 发现ERBB信号通路在众多细胞信号转 导通路中是突变最为显著的一个(FDR=9.2×10–14)。研 究发现, 36.8%(21/57)的病人存在该信号通路基因 的体细胞非沉默突变(non-silent somatic mutations)。 在15个ERBB信号通路相关基因(ERBB3、ERBB2、 ERBB4、EGFR、KRAS、NRAS、HRAS、PIK3CA、 BRAF、MAP2K4、MAPK10、SRC、MYC、NRG1和 SOS2)中, 共发现了37个非沉默突变(图1A和图1B)。 结合病人的临床病理特征和预后信息, 我们发现, 携 带ERBB信号通路基因突变病人的术后总体生存期 (overall survival)显著小于无ERBB信号通路突变病 人(图1C)(P=0.012, 中位生存期分别为8个月和13个 月)。通过多变量cox比例风险模型多重矫正后, 结果 显示, 肿瘤组织中携带ERBB信号通路突变的病人相 对于未携带突变病人的死亡风险增加10倍(HR=10.4, P=0.001), 提示ERBB信号通路突变与胆囊癌病人临床预后显著相关。<\/span>

该研究揭示了胆囊癌相关的体细胞突变图谱 和关键的致癌基因突变和信号通路, 加深了我们对 于胆囊癌发生发展的了解, 为胆囊癌病人临床诊断 和个体化治疗提供新指标和新靶点。由于ERBB受 体及下游相关信号通路在多种肿瘤中异常激活, 因 此成为较为理想的抗癌药物靶标, 多种ERBB受体 或信号通路的靶向药物已进入临床使用或处于临 床试验阶段[25]。目前, 有两大类ERBB抑制剂正在 临床使用: 一类是针对EGFR或ERBB2胞外端的人 源化抗体, 包括西妥昔单抗(Cetuximab)、曲妥珠 单抗/赫赛汀(Trastuzumab/Herceptin)、帕妥珠单抗 (Pertuzumab)等; 另一类是针对受体酪氨酸激酶的小 分子抑制剂, 包括吉非替尼/易瑞沙(Gefitinib)、拉帕 替尼(Lapatinib)、厄洛替尼(Erlotinib)等[25]。后续研 究需要在分子、细胞、动物和临床水平评估携带 ERBB不同变异的胆囊癌细胞对于单独使用ERBB 靶向药物或联合传统化疗药物使用的敏感性和治疗 效果, 进一步确定对于ERBB靶向治疗的敏感人群和 相关标记物。同时需要尽快组织我国胆道疾病多中 心、大样本、随机双盲、循证医学的研究, 进而确 定ERBB家族基因在中国人群胆囊癌病人中的表达、 基因扩增或突变情况, 通过开展深入的ERBB靶向临 床干预试验明确疗效, 为病人提供更好的诊治方案。<\/span><\/p>

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A: 在57个胆囊癌病人中21个病人肿瘤组织中携带有ERBB信号通路基因的突变, 且ERBB家族基因在病人中存在突变互斥现象; B: 胆囊癌中 ERBB信号通路中关键基因及其突变频率; C: ERBB信号通路携带突变病人(n=21)总体生存期显著低于不存在突变病人(n=36)。 A: shown are the mutation status of genes of the ERBB pathway in the 21 gallbladder carcinoma (GBC) that carry at least 1 non-silent mutation. Mutations in the ERBB family are mutually exclusive; B: the key genes of the ERBB signaling pathway with mutation frequencies in GBC are shown; C: cases with mutations in the ERBB pathway (n=21) demonstrate worse overall survival than cases without mutations in the ERBB signaling pathway (n=36).
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图1 胆囊癌ERBB信号通路的体细胞突变
Fig.1 Somatic mutations of the ERBB signaling pathway in GBC<\/p>


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16 Veltman JA, Brunner HG. De novo mutations in human genetic disease. Nat Rev Genet 2012; 13(8): 565-75.

17 International Cancer Genome Consortium, Hudson TJ, Anderson W, Artez A, Barker AD, Bell C, et al. International network of cancer genome projects. Nature 2010; 464(7291): 993-8.

18 Alexandrov LB, Nik-Zainal S, Wedge DC, Aparicio SA, Behjati S, Biankin AV, et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature 2013; 500(7463): 415-21.

19 Roberts SA, Lawrence MS, Klimczak LJ, Grimm SA, Fargo D, Stojanov P, et al. An APOBEC cytidine deaminase mutagenesis pattern is widespread in human cancers. Nat Genet 2013; 45(9): 970-6.

20 Fujii K, Yokozaki H, Yasui W, Kuniyasu H, Hirata M, Kajiyama G, et al. High frequency of p53 gene mutation in adenocarcinomas of the gallbladder. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1996; 5(6): 461-6.

21 Hanada K, Itoh M, Fujii K, Tsuchida A, Ooishi H, Kajiyama G. K-ras and p53 mutations in stage I gallbladder carcinoma with an anomalous junction of the pancreaticobiliary duct. Cancer 1996; 77(3): 452-8.

22 Suzuki T, Takano Y, Kakita A, Okudaira M. An immunohistochemical and molecular biological study of c-erbB-2 amplification and prognostic relevance in gallbladder cancer. Pathol Res Pract 1993; 189(3): 283-92.

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24 Kiguchi K, Carbajal S, Chan K, Beltran L, Ruffino L, Shen J, et al. Constitutive expression of ErbB-2 in gallbladder epithelium results in development of adenocarcinoma. Cancer Res 2001; 61(19): 6971-6.

25 Hynes NE, Lane HA. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors. Nat Rev Cancer 2005; 5(5): 341-54.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-26-58-416.jpg","cshort":"

王慧, 中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究员。1999年在天津医科大学/美国伯明翰阿拉巴马大学(UAB)获得医学、理学博士学位(中美联合培养); 1999年至2005年先后在美国UAB大学药理与毒理系<\/span><\/p>","cshort2":"

王慧, 中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究员。1999年在天津 医科大学/美国伯明翰阿拉巴马大学(UAB)获得医学、理学博士学位(中美联合 培养); 1999年至2005年先后在美国UAB大学药理与毒理系、临床药理部从事博 士后研究(1999~2001)、讲师(2001~2002)、助理教授及癌症药理学中心实验室 副主任(2002~2005); 2005年10月至今任中国科学院上海生命科学研究院营养科 学研究所研究员、博士生导师、研究组长, 食品安全研究中心主任(2007–), 国家 食品安全风险评估分中心常务副主任(2014–), 中国科学院食品安全重点实验室 (筹)主任(2014–)，卫生部食品安全风险评估重点实验室副主任(2012–)。现任国 务院食品安全委员会专家委员会委员、第一届食品安全国家标准评审委员会委 员、微生物分委员会主任委员, 中国毒理学会第六届理事会理事, 中国抗癌协会 肿瘤病因学专业委员会委员, 国家科学技术奖评审专家, 国家食品药品监督管理 总局保健食品和新药评审专家, 卫生计生委食品安全评审专家, 卫生计生委新食 品原料评审专家, 上海市食品安全委员会专家组成员, 上海市第一届食品安全风 险评估专家委员会及地方标准评审委员会委员。 王慧研究员长期致力于肿瘤分子靶点、营养药学、食品安全的基础和应用研 究。发现肿瘤人群易感标志物和诊断治疗新靶点, 研究靶点功能及其分子调控 和信号转导, 探索以膳食营养素、天然植物活性成份、化学小分子探针等靶向 干预和治疗肿瘤的新机制和新方法。已在Nat Genet、Proc Natl Acad Sci USA、 Cancer Res、Clin Cancer Res、J Clin Endocrinol Metab等刊物发表研究论文90余 篇, 申请专利16项、授权6项, 研究成果得到国际同行认可和高度评价。近期, 我 们运用全基因组外显子测序和靶基因深度测序技术首次系统阐述了胆囊癌基因 突变图谱(Li et al. Nat Genet 2014)。<\/span><\/p>","ctitle":"破译胆囊癌基因突变图谱","listseq":21,"seqno":"39","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-53-02-111"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所, 分子生物学国家重点实验室, 上海 200031)","cauthor":"刘征兆 胡荣贵*","cintpic":"","clicktime":5,"clong1":"

细胞选择性自噬<\/strong>

自噬(autophagy)途径是细胞对胞内的大分子物质的包被、吞噬后在溶酶体中降解的过程[1-2]。细胞受到饥饿、高温、低氧及荷尔蒙等外界刺激, 或细胞器的损坏、突变蛋白的积聚及微生物的侵袭等, 都可能引起细胞自噬的发生[3]。自噬最早被认为是非选择性的, 而近期研究发现, 自噬受体蛋白(autophagy receptor)对自噬底物有特异性的识别、分选和运输的作用, 可以选择性地靶向自噬底物的降解[4-5], 从而赋予了依赖自噬降解的蛋白质稳态极其精密的动态调控。自噬受体蛋白一方面通过泛素结合结构域(UBA domain)以依赖或非依赖的方式识别和结合自噬底物蛋白, 同时也以其LC3相互作用结构域(LC3-interaction region, LIR)锚定在自噬体膜上, 最终通过自噬小体和溶酶体的融合而伴随底物进入溶酶体降解。目前已知的自噬受体蛋白约有十种[6], 如p62/SQSTM1(sequestosome 1)、NBR1(next to BRCA1 gene 1)、OPTN(optineurin)等。已知这些自噬受体蛋白的基因突变或缺失与多种人类疾病相关。这些疾病表现各异却有部分共同的特点。OPTN由于其基因某些位点的突变最早被发现与人类的各型青光眼有关而得名。近来, OPTN的另一些基因位点的突变被发现与肌萎缩侧索性硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)或Paget’s骨系统疾病有关[7-8]。已知OPTN蛋白参与调节细胞内重要的免疫信号通路、细胞极性及细胞自噬等, 但其机理尚不清楚。关于这些自噬受体蛋白本身的修饰和功能调控以及自噬受体蛋白之间的相互作用及其组织方式(如是否和如何形成复合物)等目前的了解还很粗浅, 因此这方面的研究也成为当前自噬领域的热点之一。<\/span>

HACE1介导的泛素化信号通路调控细胞选择性自噬<\/strong>

研究表明, 编码泛素连接酶HACE1(HECT domain ankyrin repeats-containing E3 Ub ligase 1)的基因在多种人类肿瘤中发生了染色体片段缺失、基因突变或启动子区域甲基化, 而且HACE1敲除的小鼠多个组织都发生肿瘤, 其肿瘤抑制活性依赖于HACE1的泛素连接酶活性, 但HACE1作为泛素连接酶的底物则鲜有报道。近年有报道发现, 某些泛素化途径可能影响细胞自噬水平, 但机制并不清楚[9-10]。我们实验室近期的研究发现, 具有肿瘤抑制活性的泛素连接酶HACE1能够与OPTN蛋白直接相互作用并催化OPTN的多泛素化[11]。<\/span>

有趣的是, OPTN蛋白经HACE1介导的以泛素K48方式连接的泛素链修饰后主要通过溶酶体依赖的自噬途径被降解。这个发现不同于“泛素K48连接的多泛素链只靶向底物进入蛋白酶体降解”的经典知识。Komatsu等[12-13]发现, 自噬受体蛋白p62一方面作为自噬受体介导自噬底物向自噬泡的运输, 同时自身也通过自噬途径被降解。我们发现, HACE1-OPTN激活自噬, OPTN蛋白本身也通过自噬途径降解[11]。这种看似矛盾的现象充分展示了典型自噬受体如OPTN和p62等在自噬调控过程中扮演的多种角色: 它们既识别自噬底物并介导自噬底物运输, 同时自身伴随自噬的底物一起通过自噬被降解。<\/span>

OPTN经HACE1泛素化后与p62相互作用形成自噬受体复合物并激活选择性自噬<\/strong>

自噬受体在选择性自噬底物的识别、募集和运输中起着至关重要的作用。然而, 不同的自噬受体含有不同的功能结构域, 决定了它们的功能各异。如p62和NBR1都能够通过N末端的PB1(Phox and Bem1p)结构域形成多聚体, 在选择性自噬过程中的执行和调控中起关键作用, 而其他自噬受体则没有这种结构[14-15]。它们是否与其他自噬受体相互作用则未有报道。<\/span>

我们的研究发现, 在p62被敲除或敲低的细胞中, HACE1-OPTN“激活”细胞自噬的效应都被显著削弱。这说明了p62在HACE1-OPTN介导的细胞自噬过程中起着关键作用。免疫共沉淀实验表明, 内源性的OPTN、p62和HACE1能形成一个复合物。我们的实验数据进一步显示, HACE1介导的OPTN泛素化修饰, 特别是在OPTN的193位赖氨酸残基侧链上形成的泛素链能够与p62的UBA结构域特异性地相互作用, 并形成可以通过免疫共沉淀检测到的复合物, 激活细胞自噬。显然, 泛素化的OPTN与p62相互作用可以提高通过自噬受体介导的自噬底物向自噬泡运输的效率, 显著增加细胞自噬降解的通量(autophagic flux), 从而更加有效地招募和运输自噬底物, 促进自噬溶酶体途径的降解[11]。<\/span>

HACE1-OPTN-p62抑制肿瘤细胞增殖<\/strong>

肿瘤克隆形成和裸鼠成瘤实验表明, HACE1和OPTN可以协同作用抑制肿瘤增殖[11]。此前一些研究显示, 多种肿瘤细胞都表现为自噬缺陷、p62蛋白质的累积以及细胞内自由基(reactive oxygen species, ROS)增加, 而促进p62蛋白质的降解被认为是细胞自噬抑制肿瘤生长的主要机制之一[13,16]。我们的研究发现, HACE1-OPTN激活细胞内自噬, 可有效降低细胞内p62蛋白水平, 同时也能降低细胞内ROS的生成以及加速氧化损伤蛋白的清除。已知, 被氧化损伤的蛋白的累积在肿瘤发生发展中扮演着重要角色[17]。这些累积的被氧化的蛋白和p62的清除, 以及胞内ROS水平的降低, 可能是HACE1-OPTN激活细胞自噬抑制肿瘤的主要机制。<\/span>

泛素化修饰调控选择性自噬新机制的临床相关性及意义<\/strong>

我们发现, 在小鼠胚胎成纤维细胞、巨噬细胞、人肺癌细胞系和人胚胎肾细胞等多种细胞系中, HACE1-OPTN功能轴心均能够调控细胞自噬, 从而表现出细胞类型非特异的作用特点。基于大量临床样本的数据进一步表明, HACE1和OPTN在肝癌、胃癌等肿瘤组织中高突变或低表达。而在多种肿瘤细胞中, 恢复HACE1-OPTN轴心可以激活自噬而显著抑制肿瘤增殖[11]。 HACE1-OPTN功能缺陷导致其调控的自噬底物累积, 这些被累积的蛋白可能成为相关肿瘤分型的分子标志物。<\/span>

综上所述, 我们的此项工作表明, 被HACE1泛素化的OPTN为p62的泛素结合结构域所识别并形成大的自噬受体蛋白复合物, 显著增加细胞内自噬途径降解蛋白质的通量从而“激活”细胞自噬[11]。本发现提示了细胞内泛素信号途径调控自噬的新机制(图1), 也为进一步研究OPTN的生理作用及其突变的病理意义提供了新的研究视角, 并可能有助于以细胞自噬为靶向的肿瘤化疗药物的开发。<\/span>

<\/p>

<\/p>

泛素连接酶HACE1介导自噬受体OPTN的泛素化, 促进OPTN与p62的相互作用, 并形成大的自噬受体蛋白复合物, 显著增加自噬途径降解底物的通量, 从而“激活”细胞自噬、抑制肿瘤增殖。
HACE1, a HECT-domain Ankyrin-repeats-containing E3 Ub ligase, mediates ubiquitylation of autophagy receptor OPTN and promotes physical interaction between OPTN and p62 to form autophagy receptor complexes, thus significantly augmenting cellular autophagic flux and “activating” autophagy to suppress tumor.
<\/p>

图1 HACE1泛素化自噬受体蛋白OPTN激活细胞自噬并抑制肿瘤的分子机制示意图(根据参考文献[11]修改)
Fig.1 A model depicting how the HACE1-OPTN axis suppresses tumor through activating autophagy in vivo (modified from reference [11])<\/p>


<\/p>


参考文献 (References)<\/span>
1 Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, Abraham RT, Acevedo-Arozena A, Adeli K, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 2012; 8(4): 445-544.

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10 Kim ST, Tasaki T, Zakrzewska A, Yoo YD, Sa Sung K, Kim BY, et al. The N-end rule proteolytic system in autophagy. Autophagy 2013; 9(7): 1100-3.

11 Liu Z, Chen P, Gao H, Gu Y, Yang J, Peng H, et al. Ubiquitylation of autophagy receptor Optineurin by HACE1 activates selective autophagy for tumor suppression. Cancer Cell 2014; 26(1): 106-20.

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17 Xu W, Trepel J, Neckers L. Ras, ROS and proteotoxic stress: A delicate balance. Cancer Cell 2011; 20(3): 281-2.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-26-00-708.jpg","cshort":"

胡荣贵, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员。1995年毕业于安徽师范大学生物系, 获理学学士学位。2000年8月毕业于中国科学院上海生物化学研究所, 获理学博士学位。2001年至2006年在加州理工学院生物系Alexander Varshavsky实验室从事博士后研究<\/span><\/p>","cshort2":"

胡荣贵, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员。1995年毕业于安徽师范大学生物系, 获理学学士学位。2000年8月毕业于中国科学院上海生物化学研究所, 获理学博士学位。2001年至2006年在加州理工学院生物系Alexander Varshavsky实验室从事博士后研究。2006年任加州理工学院生物系Senior Research Fellow。自2006年起获加州再生药物研究所资助研究干细胞发育过程中蛋白质降解系统的调控。2009年7月起担任中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所担任研究员、博士生导师, 建立和领导蛋白质稳态调控与分子识别课题组, 课题组主要致力于研究蛋白质泛素化及降解等稳态调控及其异常的生理病理意义, 并基于蛋白质的分子识别的工程设计并开发有效的诊断和治疗手段。现已在Nature、Science、Cancer Cell、Proc Natl Acad Sci USA、Cell Res、Cell Rep、Biomaterials、J Mol Cell Biol、 J Biol Chem等刊物发表多篇研究论文, 其研究成果多次被国际学术期刊如Nat Rev Mol Cell Biol、J Cell Biol、Sci Signal、Chem Biol等选为亮点。课题组最新发表在Cancer Cell的工作阐明了肿瘤抑制活性的泛素连接酶HACE1泛素化修饰自噬受体OPTN促进自噬受体复合物的形成激活细胞自噬并抑制肿瘤的分子机理, 揭示了细胞内泛素化信号与细胞自噬交叉调控的新机制。<\/span><\/p>","ctitle":"泛素化信号调控细胞选择性自噬的新机制","listseq":22,"seqno":"38","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-52-17-864"},{"caddress1":"(1<\/sup>中国科学院–德国马普学会计算生物学伙伴研究所, 中国科学院计算生物学重点实验室, 上海 200031;
2<\/sup>中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 分子生物学国家重点实验室, 上海 200031)","cauthor":"董 瑞1<\/sup> 陈玲玲2<\/sup> 杨 力1*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":2,"clong1":"

经典的分子生物学中心法则认为, 遗传信息(基因)通过转录从DNA传递到RNA, 再通过翻译从RNA传递到蛋白质; 在此过程中, RNA是遗传信息从DNA传递到蛋白质的中间体[1]。然而, 从上个世纪70~80年代起的研究发现, 遗传信息的传递在RNA水平也存在着广泛而又复杂的调控作用[2-3]。生命起源的RNA世界假说[4]和全转录组RNA表达分析结果[5]都显示基因表达在RNA水平存在着更复杂而又精细的调控作用(RNA complexity), 而且这种调控作用具有显著的时间和空间特性, 揭示RNA水平的调控可能是生命功能复杂性的核心所在[6]。<\/span>

真核生物基因序列的不连续性和RNA剪接<\/strong>
真核生物蛋白编码基因在转录生成前体RNA后, 通常会通过RNA剪接将含有蛋白编码信息的外显子序列顺序地连接在一起, 形成成熟的线形mRNA分子, 而去除不需要的内含子序列。在高等真核生物(从果蝇到人类)中, 通过可变剪接反应可以由一个基因产生多种不同功能的成熟mRNA及其相应蛋白产物, 这在不改变基因数目的前提下极大地提高了基因表达及其功能的复杂性和多样性。RNA可变剪接与生命体正常的生理活动息息相关, 例如神经系统中的可变剪接极大地丰富了神经反应的多样性[7]。最新的研究结果表明, 至少90%的人类基因通过可变剪接由一个基因产生多种不同功能的成熟mRNA及其相应蛋白产物[5,8-9]。然而, RNA的异常可变剪接则导致多种重要人类疾病[10], 包括一些严重的遗传性疾病, 如由于SMN异常剪接导致的脊髓肌肉萎缩症(spinal muscular atrophy)、囊肿性纤维化(cystic fibrosis, 一种遗传性胰腺病)和强直性肌营养不良症(myotonic dystrophy)。因此, 对RNA可变剪接的正常生理功能和异常病理作用及其机制的研究一直是领域的热点。<\/span>

反向剪接反应和环形RNA的产生<\/strong>
一般来讲, 正常的RNA剪接反应可以被简单地分为两步转酯反应: (1)位于分支位点的核苷酸(一般为腺嘌呤核苷酸, A)通过其2′-羟基(2′-hydroxyl)攻击上游5′剪接位点, 将上游外显子从内含子上解离, 并形成含有套索结构(lariat)的内含子和下游外显子中间体; (2)位于上游外显子末端剪接位点的3′-羟基攻击下游剪接位点, 将上下游外显子顺序地连接在一起, 最终形成成熟的(线形)RNA分子, 而剩余的内含子套索结构RNA片段则被释放并快速降解[11]。然而, 在真核生物体内还存在特殊的反向剪接反应(back splicing), 使得下游外显子序列反向与上游外显子连接环化, 我们将这种反应称为反向剪接导致的外显子环化, 或者简称为“外显子环化(exon circularization)”, 其最终产物为环形RNA(circular RNA)。尽管在上个世纪就已经在哺乳动物细胞中[12-14]发现了外显子环化导致的环形RNA产生, 但是因为这一类环形RNA的表达量非常低, 并且被认为是一类由于错误剪接造成的剪接副产物[15], 推测它们可能没有任何生物学功能, 这样在随后的二十年里再也没有发现新的环形RNA。<\/span>

新技术和新思路带来的环形RNA大发现<\/strong>
人类和其他模式生物基因组计划[16-20]的完成让我们认识到人类基因组所蕴含的蛋白编码基因不是原来推测的10万个, 而是只有2~3万个, 和果蝇(1.4万)、线虫(2万)等的编码基因相差无几。显而易见的是, 人类要比果蝇和线虫复杂的多, 这揭示物种间的差异不是简单的体现在基因数目差异的水平上, 而更多的是在基因表达调控的层面上。利用经典的、针对3′-末端含有poly(A)尾巴的mRNA分离纯化并结合高通量测序和计算分析, 科学家们获得了来自不同物种/组织等的详尽mRNA表达谱, 并进一步揭示了基因表达在可变剪接[5,8-9]和非编码调控[21-22]等水平的RNA复杂性调控。<\/span>

然而, 由于技术和认识上的局限性, 一直以来对那些3′-末端不具有poly(A)尾巴的RNA都缺乏系统性的研究。直到2011年, 我们的研究团队发展了一种新的纯化方法, 可以有针对性地获得3′-末端不具有poly(A)尾巴的RNA, 并开展高通量测序和计算分析[23]。出乎意料的是, 我们在人源细胞系中发现了一些分别来自于内含子(excised intron)或外显子(excised exon)、3′-末端不具有poly(A)尾巴的RNA表达信号。进而, 我们在2012年和2013年分别报导了内含子来源的特殊结构长非编码RNA——sno-lncRNA[24]和内含子环形RNA[25]的存在。利用我们的数据[23], 其他课题组也报导了外显子环形RNA在人胚胎干细胞中的大量存在[26]。随后, 不同的课题组又在多个人/鼠细胞系中证实了外显子环形RNA的广泛存在[27-29], 并在生物信息学水平揭示了一些环形RNA存在的结构/序列基础。虽然这些突破性研究结果极大地推动了对环形RNA的认识, 但是外显子环形RNA产生的具体机制不详, 更为重要的是缺乏直接的实验证据。<\/span>

互补序列介导的外显子环化和可变环化<\/strong>
为了深入研究外显子环化产生环形RNA的具体分子机制, 我们通过特殊核酸外切酶(RNase R)在3′-末端不具有poly(A)尾巴的RNA组分中对环形RNA进行富集, 并开发了全新的计算分析流程CIRCexplorer对环形RNA进行系统的预测分析, 在计算和实验水平确证了互补序列介导的外显子环化, 并揭示了基因组内互补序列的选择配对及其动态调控导致的可变环化现象(alternative circularization)[30]。<\/span>

通过对高表达环形RNA进行的系统分析, 我们发现了一系列环形RNA生成的基因组结构特征。首先, 绝大多数形成环形RNA的外显子位于基因的中间位置, 而只有很少的外显子位于基因的两端, 这提示环形RNA的产生与RNA的剪接密切相关。因此, 我们在构建重组表达载体时充分考虑到了这一位置特征, 将产生环形RNA的序列加入到报告基因的中间区域来模拟环形RNA产生的天然条件。其次, 虽然大多数的环形RNA包含了两个及两个以上的外显子序列, 单一外显子序列形成的环形RNA只占到很少的一部分, 但是, 单一外显子形成的环形RNA其外显子长度相比于其他环形RNA的外显子更长, 这提示外显子反向剪接导致的环化需要一定的空间距离才能发生。最后, 我们也发现形成环形RNA外显子的上下游内含子序列显著地偏长, 并且富含同源重复Alu序列, 这与之前的报导一致[27]。但是进一步的分析发现, 这些Alu序列在环形RNA外显子上下游的长内含子中反向联排, 理论上可以通过反向互补Alu序列形成RNA分子内的折叠配对(IRAlu), 进而拉近反向剪接位点之间的距离, 促进外显子环化的发生。<\/span>

我们进一步利用重组表达载体, 对反向互补Alu序列对于环形RNA产生的重要性开展实验验证和机制研究。由于形成环形RNA外显子的上下游内含子序列普遍偏长, 我们挑选了一个具有较短上下游内含子序列的环形RNA形成区域开展研究。其位于POLR2A基因内, 在上游内含子内有一个负向的Alu序列, 在下游内含子内有两个正向的Alu序列, 理论上可以形成两种不同组合的IRAlu配对。在进行的一系列Alu元件突变表达载体中, 当至少有一个IRAlu配对存在时(不论是IRAlu完全配对还是IRAlu部分配对), 我们都可以检测到重组环形RNA的存在。相应的, 当突变完全破坏所有的IRAlu配对时, 环形RNA的产生则很难被检测到。但是, 当我们将来源于不同基因上的IRAlu配对序列重新导入失活表达载体后, 尽管重组的效率可能有所差距, 环形RNA又可以重新产生。有意思的是, 我们构建了一个含有非重复互补配对序列的环形RNA高表达重组质粒, 表明环形RNA的形成需要两侧内含子区域的反向互补序列配对, 而这些反向互补序列可以是像Alu一样的重复序列, 也可以是非重复序列。进而, 我们也检测到了内源存在的非重复序列互补配对介导的环形RNA产生。有意思的是, 对不同物种转录组数据分析的结果提示, 互补序列及其介导的环形RNA产生在不同的物种间存在着动态差异。<\/span>

通过大量的生物信息学分析和比较研究, 我们发现并不是所有的反向互补序列配对都可以导致环形RNA的产生, 即反向互补序列配对是环形RNA产生的必要但非充分条件。例如, 在人的ZWILCH基因中有一个环形RNA产生的潜在位点, 其上下游内含子区域间可以通过反向互补形成多个IRAlu配对, 但是我们并没有检测到ZWILCH位点环形RNA的表达; 然而在小鼠的ZWILCH基因内, 我们也预测到了相同位置上的多个反向互补配对(在小鼠中为SINE序列), 更为重要的是, 在该位点我们检测到了小鼠环形RNA的表达。那么究竟是什么原因导致了这种环形RNA表达的差异呢？我们提出了反向互补序列配对竞争导致环形RNA产生的理论。理论上来讲, 反向互补序列配对既可以发生在一个内含子内部序列中, 也可以发生在两个内含子间的序列中。当反向互补序列配对发生在一个内含子中时, 相邻外显子的剪接位点可以被拉近并通过正常的剪接产生线形RNA; 但是, 当反向互补序列配对发生在两个内含子中时, 位于两个内含子间的外显子则通过反向剪接发生环化作用, 形成环形RNA。这种反向互补序列的竞争性配对则导致了线形RNA和环形RNA形成的竞争性关系(图1A)。通过对整个人类基因组进行的系统分析发现, 反向互补序列的竞争性配对(在人中主要是IRAlu配对)不光与互补序列的绝对数目相关, 也与反向互补配对序列间的距离有关, 提示环形RNA有复杂的加工调控机制。有意思的是, 在我们工作发表的同一天, Mol Cell期刊上发表了另外一个环形RNA工作, 也从另一个角度揭示了线形RNA和环形RNA形成的竞争性关系[31]。<\/span>

在研究中我们还惊奇地发现, 同一个基因区域可以产生多个环形RNA分子(图1B)。更为重要的是, 我们通过Northern blot进一步鉴定了这些环形RNA分子的存在。我们将这种一个基因前体RNA可以产生多个环形RNA的现象称为可变环化(alternative circularization), 对应于一个基因前体RNA产生多个(线形)mRNA的可变剪接(alternative splicing)。这种可变环化的现象也在多个人源细胞系的转录组数据中得到证实。我们推测, 可变环化的产生与人类基因组内含子区域中蕴含着的大量重复互补序列(主要是Alu)密切相关, 这些互补序列的选择配对及其动态调控使得同一个基因可以产生多个环形RNA分子。我们的这一发现也揭示了位于基因组内含子区域中Alu元件的一个新功能。<\/span>

环形RNA研究展望<\/strong>
我们的此项研究成果首次证明了内含子RNA互补序列介导的外显子环化(环形RNA形成), 并提出了不同区域间互补序列的竞争性配对导致线形RNA或是环形RNA的产生; 重要的是, 这种互补序列的竞争性配对在不同物种间呈现差异的组合模式, 使得外显子来源环形RNA的表达具有物种特异性; 更为重要的是, 在人类基因组内含子区域中蕴含着大量的互补序列(如Alu等序列), 这些互补序列的选择配对及其动态调控导致了可变环化的发生[30]。这一系列的发现揭示了环形RNA这一类新型非编码RNA在体内的广泛存在, 进一步以全新的理论视角揭示了基因表达在转录/转录后水平的复杂性和多样性, 为深入研究外显子环化、可变环化以及与转录和剪接的协调作用机制奠定了坚实的分子基础。<\/span>

这些已有的环形RNA研究丰富了我们对真核生物转录组复杂性的认识, 但是还有很多疑点有待破解[32]。例如, 这种反向剪接导致的外显子环化是如何与正常剪接相区分的？又是如何和转录/剪接协同作用的？其他影响环形RNA产生的顺式元件和反式因子是什么？可变环化是否受到空间结构的限制和调节？另外, 未来对环形RNA的研究将主要集中在其功能作用方面。尽管已有的一些研究结果表明, 内含子环形RNA可以通过结合RNA聚合酶II发挥顺式的转录调控作用[25]; 而个别的外显子环形RNA可以作为miRNA的分子海绵来发挥转录后调控作用[28,33], 但是大部分环形RNA的生物学功能及其作用机制不详。因此, 对环形RNA功能作用研究的突破, 将进一步推动我们对环形RNA的了解, 也会为我们带来更多的惊喜。<\/span>

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A: 内含子内的IRAlu的配对促进线性RNA的形成(左图), 内含子之间的IRAlu配对促进了环形RNA的形成(右图); B: Alu之间不同的配对方式使得一个基因区域可以生成多个环形RNA, 称为可变环化。
A: the competition model of exon circularization. Left: the RNA pairing by IRAlus within one individual intron (red arrows) promotes normal splicing (dash lines), resulting in a linearized RNA transcript. Right: RNA pairing by IRAlus across flanking introns promotes back splicing, leading to exon circularization and a linearized RNA transcript with exon skipping. B: alternative formation of IRAlus (red arcs) across introns and the competition between them lead to widely expressed alternative circularization (black arcs).
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图1 外显子形成线性RNA和环形RNA的竞争性模型以及可变环化
Fig.1 The competition model of exon circularization and alternative circularization<\/p>


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参考文献 (References)<\/span>
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杨力, 中国科学院–德国马普学会计算生物学伙伴研究所研究员。2004年毕业于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 获理学博士学位。2004~2010年, 先后在美国耶鲁大学和康涅狄格大学健康中心进行博士后研究, 主要参与美国NIH支持的模式生物DNA功能元件研究计划(Model Organism ENCyclopedia Of DNA Elements)<\/span><\/p>","cshort2":"

杨力, 中国科学院–德国马普学会计算生物学伙伴研究所研究员。2004年毕业于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 获理学博士学位。2004~2010年, 先后在美国耶鲁大学和康涅狄格大学健康中心进行博士后研究, 主要参与美国NIH支持的模式生物DNA功能元件研究计划(Model Organism ENCyclopedia Of DNA Elements)。2011年加入中科院–德国马普学会计算生物学伙伴研究所, 任课题组长、研究员、博士生导师, 继续在组学水平对RNA的表达调控开展研究, 包括对非编码转录组RNA以及转录组水平RNA编辑修饰进行系统发掘和功能探索。开创性地建立全新转录组分析流程体系, 系统揭示了多种特殊结构新型长非编码RNA在体内的广泛存在及其功能预测(Yin et al. Mol Cell 2012; Zhang et al. Mol Cell 2013; Zhang et al. Cell 2014)。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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“工作记忆”(working memory)是一种重要的 短时程记忆, 它负责对实时信息进行短暂的储存 和运用。这个短暂储存的时间被称为记忆的“延迟 期”(delay period)[1-3]。比如在做心算时(例如17×24), 大脑需要按照运算法则对不同数位的数字进行依次 运算, 而中间结果需要在记忆延迟期内暂时存储下 来, 最后得到计算结果。又如在打电话时, 当被告知 一个陌生号码时, 我们需要在工作记忆中把这个号 码暂时存储下来, 然后将电话拨出。<\/span>

前人的研究表明, 大脑前额叶皮层(prefrontal cortex, PFC)对处理工作记忆非常重要。因为在灵 长类背外侧前额叶(dorsolateral PFC)以及啮齿类内 侧前额叶(medial PFC, mPFC)都记录到了与工作记 忆相关的延迟期神经元电活动, 而且干扰前额叶电 活动会损害工作记忆的准确性[3-10]。然而, 前额叶延 迟期电活动的具体功能还不十分清楚。这是因为 除了最有可能的对记忆的维持(memory retention)和 对注意力的控制(attentional control)这两个功能[2-3,11]之外, 前额叶还参与其他功能[3,12-13], 如抑制控制 (inhibitory control)[14]、抉择制定(decision making)[15] 和运动选择(motor selection)[16]等。在经典的延迟– 反应任务(delayed-response task)中, 抉择在延迟期之 前已经做出, 这使得“抉择”和“记忆”在行为时序上 很难分开[3,12]。因此, 使用这类任务来研究延迟期电 活动, 就不能很好地阐明其功能。与此同时, 传统 的干预手段, 比如经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation)[17]和微电流刺激(electrical stimulation)[18], 都不能实现对不同神经元类型进行“秒”级时间尺度 的操控。因此, 这类方法也不能阐明前额叶延迟期 间电活动参与工作记忆任务的具体机制。<\/span>

为了解决这些问题, 我们采用了一个在时间上可 以将记忆储存和其他功能分开的工作记忆任务[5-6,19-20], 并且通过“光遗传学”(optogenetics)手段[21], 实现了在 特定行为时相对不同类型神经元进行双向调控(激 活或抑制)的目的。<\/span>

我们训练小鼠学习一个嗅觉任务—“延迟非 匹配样本”(delayed nonmatch to sample)任务(图1A 和图1B)。在这个任务中, 平时限制饮水的小鼠会先 后闻到两个一样(match)或者不一样(nonmatch)的气味。如果气味不一样, 小鼠可以在出水口舔到水作 为奖励; 如果气味一样, 小鼠则需要抑制自己不去舔 水(即使舔也没有水)。在闻到两次气味之间, 有一段 4~5秒无气味的“延迟期”, 在这段时间里, 小鼠需要 记住第一个气味, 然后和第二个气味作比较以完成 任务。这一任务的特点和优势就在于, “延迟期”将 记忆存储和抉择行为分开, 从而可以分时段、特异 性地研究信息的存储和抉择等不同行为。<\/span>

在任务学习过程中, 小鼠的行为正确率稳步上 升。正确率的上升主要体现为气味相同时(match trials), 正确拒绝次数(correct rejection rate)的增加(也 就是抑制自己不去舔水行为的增加); 而气味不同时 (nonmatch trials)的正确命中率(hit rate)一直处于较 高水平。我们发现, 随着延迟期时间的增长, 小鼠的 行为正确率会逐渐下降, 这也符合工作记忆准确性 随时间衰减的基本特征[1,3]。<\/span>

为了证明mPFC参与上述任务, 我们在小鼠双 侧mPFC表达一种可以被特异性药物clozapine-Noxide( CNO)激活的受体蛋白hM4Di[22]。这个受体一 旦被激活, 受体所在神经元的电活动将会受到抑制。 我们发现, 通过上述方法抑制mPFC电活动可以显 著地降低小鼠任务学习的正确率。这一结果说明, mPFC的确参与了小鼠学习上述工作记忆任务的过 程。<\/span>

接下来我们使用“光遗传学”的手段, 进一步探 究了mPFC锥体神经元(pyramidal neurons)在延迟 期间的功能。我们首先在双侧mPFC抑制性神经 元(GABAergic inhibitory neurons)[23]中表达channel rhodopsin 2(ChR2, 一种可以被蓝光激活的阳离子通 道, 激活后使神经元去极化产生动作电位)[21]。在双 侧mPFC埋置光纤并进行持续蓝光(473 nm, 2 mW)照 射, 可以有效激活抑制性神经元, 从而实现对锥体神 经元的间接抑制。在小鼠训练任务时, 我们特异性 地在延迟期间给光, 发现这种操作可以显著地降低 小鼠学习的正确率和正确拒绝次数。然而出乎我们 意料的是, 一旦小鼠熟练掌握了任务(well-trained), 这种操作就不能影响行为正确率。一些研究认为, PFC更多地参与到新的和需要集中注意力的任务中, 而不是常规的、反复练习的熟练任务[2-3,12,24]。因此, 我们的研究结果和前人的观点是一致的。<\/span>

为了直接验证延迟期锥体神经元的作用, 我们 在小鼠双侧mPFC表达halo-rhodopsin(NpHR, 一种绿光激活的氯离子泵, 可以使神经元超极化, 抑制其电 活动)[21], 并在延迟期间通过双侧埋植的光纤施以持 续绿光(532 nm, 10 mW)照射。结果和上述实验是一 致的, 即在延迟期间抑制mPFC锥体神经元电活动, 可以显著地降低小鼠学习工作记忆任务的正确率; 并且这一操作不影响习得以后的行为(图1C)。<\/span>

因为在每次任务中第一个气味是不同的, 所以 每次任务延迟期的记忆储存也是不同的, 而且在不 断更新。于是, 我们设计在任务学习的某些延迟期 间对mPFC进行光遗传抑制操作, 而另一些则不抑 制。结果发现, 进行抑制的行为正确率要明显低于 不进行抑制的情况。这提示我们, mPFC延迟期间电 活动介导了不断更新的信息。与此同时, 我们选择 初级体感皮层(S1)作为对照, 发现对该区域延迟期 电活动进行抑制, 不会影响小鼠学习的正确率。<\/span>

既然抑制mPFC锥体神经元会影响学习, 那么 兴奋这些神经元会不会促进学习呢？为了回答这个 问题, 我们在双侧mPFC椎体神经元中表达ChR2, 并 在延迟期间进行持续蓝光激活(473 nm, 0.8 mW)。 结果发现, 这一操作也会导致学习正确率的下降。 这提示我们, 神经元内在的放电模式(endogenous pattern)是很重要的, 无论是同步的抑制还是同步的 激活, 都会影响到这种模式, 从而影响行为。<\/span>

为了探索mPFC在不同行为阶段的功能特异性, 我们在第二个气味出现时(即抉择行为期间)进行光 遗传抑制。结果发现, 在学习的早期, 这种操作不会 影响行为; 然而在学习的后期一直到完全习得, 抑制 mPFC则会显著地导致行为正确率的下降。这一结 果说明, mPFC在不同时段的功能的确存在差异。这 也解释了为何在前人的一些实验中, PFC也参与习 得以后工作记忆的处理: 因为其参与了抉择行为, 而 非延迟期间的记忆储存。<\/span>

为了进一步阐明mPFC在延迟期间的功能, 我 们设计了两个对照实验。在其中一个实验中, 两次 气味之间的延迟期被去掉, 在这种情况下, 并不需要 保持记忆, 但是抉择、抑制控制、运动选择等其他 功能依然需要。在另一个对照实验中, 虽然在任务 结构上保留了“延迟期”, 但是小鼠的选择只和第二 个气味有关, 因此也没有记忆保持的要求。我们发 现, 在这两种情况下, 光遗传抑制操作都不会影响小 鼠的学习正确率。这一结果提示我们, 延迟期mPFC 电活动更有可能参与了工作记忆的维持, 而不是其他功能。<\/span>

接下来, 我们在小鼠学习任务过程中, 对mPFC 神经元电活动进行了细胞外电生理记录。我们使用 自己制作的tetrodes电极可以记录和分检出符合要 求的单个神经元电活动(single unit activity)。在学习 阶段, 我们在15只小鼠上共记录到564个神经元; 在 习得以后, 我们在15只小鼠上共记录到95个神经元。 经过分析发现, 在学习期间, 延迟期间电活动较习得 之后更加明显(图1D); 神经元电活动被激活或被抑 制的程度也在学习期间更显著。<\/span>

为了在延迟期间保持第一个气味的记忆信息, 群体神经元电活动应该在不同的第一个气味之后呈 现出不同的反应模式。为了验证这个假设, 我们对 群体神经元电活动数据进行了主成分分析(principal component analysis)[25]。我们将不同记忆相关的群 体电活动在前三个主成分空间内随时间变化的轨迹画出来, 并进一步计算出轨迹之间的距离。结果发 现, 在学习期间的轨迹距离显著大于习得以后。而 且在学习期间, 行为正确时的轨迹距离要比行为错 误时更大。这提示我们, 延迟期间mPFC神经元群体 电活动很有可能参与了记忆的编码。与此同时, 在 解码分析(decoding analysis)[26]中也观察到, 在学习 期间的群体电活动比习得之后能够更有效地推测出 第一个气味是什么。<\/span>

接下来, 我们分析了神经元延迟期间气味选择 性和小鼠行为正确率之间的关系。我们发现, 来自 同一只小鼠神经元的平均气味选择性和这只小鼠的 行为正确率在学习期间有显著的正相关关系, 而一 旦小鼠习得任务, 这种相关性就不复存在了。<\/span>

综上所述, 我们的工作通过“延迟期”的设计, 使 行为中“记忆储存”和“抉择行为”相分离; 在此基础 上, 使用光遗传学的手段特异性地只在延迟期间或者抉择行为期间对mPFC神经元进行操作; 进而阐明 了延迟期mPFC电活动对任务学习期间工作记忆储 存的重要贡献。这一工作也间接提示可能有其他脑 区参与任务习得以后工作记忆的储存。<\/span>
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A: 小鼠行为训练系统; B: 工作记忆任务示意图; C: 行为学和光遗传操作结果。行为正确率=(正确命中+正确拒绝)/全部。每个点代表一组 (session)训练的成绩, 每天5组(共100次, 每组20次)。抑制工作记忆期间的神经元活动可以明显地降低学习期间的行为正确率(***P<0.001), 但 不影响习得后行为(n.s.); D: 内侧前额叶神经元在整个训练过程中群体电活动的变化。每一行代表一个神经元, 颜色代表神经元电活动的放电 频率(标准化后)。1~5秒是工作记忆的延迟期。结果显示学习中延迟期间反应更强。 A: behavioral training system; B: working memory task paradigm; C: behavioral performance and optogenetic experiment results. Each dot represents the performance correct rate of 20 trials (or 1 session). Performance=(Hit+Correct rejection)/Total number of trials. For each day, mice performed 100 trials; D: modulation of population activity, which was normalized in Z-score and averaged across all trials for each neuron. 1~5 s is the delay period.
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图1 学习工作记忆任务过程中内侧前额叶神经元电活动以及光遗传学操作记忆延迟期电活动对 行为正确率的影响(根据参考文献[27]修改, 经过Science Press许可)
Fig.1 Modulation of mPFC delay-period activity in learning the working memory task and the impaired behavior performance by suppressing mPFC delay-period activity (modified from reference [27], with permission from Science Press)<\/p>


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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-22-51-259.jpg","cshort":"

李澄宇, 中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员。1999年毕 业于北京大学, 获得学士学位; 2004年毕业于中科院上海生命科学研究院神 经科学研究所, 获得博士学位。2004~2009年在美国加州大学伯克利分校进 行博士后研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

李澄宇, 中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员。1999年毕 业于北京大学, 获得学士学位; 2004年毕业于中科院上海生命科学研究院神 经科学研究所, 获得博士学位。2004~2009年在美国加州大学伯克利分校进 行博士后研究。2009年加入中科院上海生命科学研究院神经科学研究所, 任 课题组长、研究员、博士生导师, 主要研究领域为系统神经科学, 利用光遗 传、行为学分析、在体胞外电生理、在体全细胞记录等技术手段, 研究工 作记忆这一重要脑功能的神经环路基础; 目前主要以小鼠为动物模型, 研究 以基于嗅觉的工作记忆为核心的行为范式。近期, 其课题组在Science上发表文章, 阐明内侧前额叶皮层在工作记忆 任务学习期间的功能角色(Liu D, et al. Science, 2014)。<\/span><\/p>","ctitle":"内侧前额叶在“延迟期间”电活动对工作记忆任务学习的贡献","listseq":24,"seqno":"36","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-50-53-943"},{"caddress1":"<\/sup>1中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学国家重点实验室, 上海 200031;
2<\/sup>中国科学院–德国马普学会计算生物学伙伴研究所, 中国科学院计算生物学重点实验室, 上海 200031","cauthor":"王代松1<\/sup> 蔡车国1<\/sup> 董小兵1<\/sup> 俞 清1<\/sup> 张晓鸥2<\/sup> 杨 力2<\/sup> 曾 艺1*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":22,"clong1":"

乳腺干细胞: 多潜能VS单潜能<\/strong>
乳腺是由多种不同类型的细胞构成的导管结 构。组成乳腺上皮的细胞类型主要包括基底细胞 (basal cell)和管腔细胞(luminal cell)。<\/span>

此外, 在怀孕 期, 位于乳腺导管分支末端的管腔细胞能够进一步 分化形成分泌乳汁的特殊细胞类型——腺泡状细胞 (alveolar cell)。 很多器官存在着组织特异的干细胞, 也称为成 体干细胞。通过自我更新和分化, 成体干细胞为器 官的发育和成体器官的自稳态维持提供各类型分化 细胞的来源。并且, 成体干细胞的病变也是肿瘤的 重要起源之一[1]。因而, 研究成体干细胞具有十分重 要的意义。而作为出生后发育的器官, 乳腺系统在 成体干细胞研究中具有得天独厚的优势。随着个体 进入青春期, 乳腺也会进入一个快速发育阶段, 在这 一时期, 乳腺干细胞的自我更新十分旺盛, 从而构建 形成完整的乳腺结构。乳腺的第二个快速发育阶段 是在怀孕时, 这一时期, 乳腺干细胞会被重新活化, 通过不断的自我更新, 来满足怀孕期乳腺发育对多 种细胞类型的需求[1-3]。乳腺干细胞这种活跃的自我 更新和分化, 为我们研究其特性提供了便利。<\/span>

此前的研究利用特异的细胞表面标记Lin–、 CD24+和CD29hi, 能够将基底层细胞和管腔细胞通 过流式分选区分开来。并通过移植实验, 发现了 乳腺上皮的基底细胞中存在多潜能的乳腺干细胞 (mammary stem cells, MaSCs), 能够在体内再生成为 新的器官, 包含所有乳腺分化细胞类型[4-5]。然而, 乳腺的基底细胞存在很强的异质性, 它们包括了多 种细胞类型, 例如干细胞、祖细胞(progenitor)和终 末分化的基底细胞。乳腺基底细胞的异质性在移植 实验中的表现就是虽然能够重建完整乳腺, 但乳腺重建的成功率较低。如何借助特异的细胞表面标记 在基底细胞中鉴定出真正具有高乳腺重建成功率的 多潜能干细胞此前尚未得到解决。除了借助移植实 验, 科学家也试图通过细胞谱系追踪的方法(lineage tracing)在乳腺的正常发育过程中鉴定多潜能干细胞 的类群。 此前两个实验室分别报道了他们对基底细 胞所形成的后代细胞类型进行追踪及分析的结果。 其中一方的结果发现, 基底细胞形成的后代细胞只 有基底细胞, 因而认为乳腺中并不存在多潜能的干 细胞, 只存在单潜能的干细胞[6]; 而另一方的结果却 与之截然相反[7], 提示基底细胞能够形成所有细胞类 型。除了对所有基底细胞进行谱系追踪外, 也有实 验室开展了对基底细胞的亚群Lgr5+或Axin2+细胞 进行谱系追踪[8-9]。这些工作提示, 这些细胞所形成 的后代细胞仅贡献于基底细胞, Lgr5+或Axin2+细胞 是单潜能的干细胞。位于乳腺细胞谱系最顶端的多 潜能干细胞是否存在仍是未能回答的问题。<\/span>

借助体外培养系统寻找乳腺干细胞标记<\/strong>
此前的多个研究报道了Wnt信号通路对于乳 腺的发育和干细胞特性维持的作用[10-12]。通过敲除 Wnt蛋白受体Lrp5和Lrp6的方法, 破坏Wnt信号通路, 会导致乳腺发育的迟缓[13-14]。而过表达Wnt信号通 路关键蛋白β-catenin, 持续激活Wnt信号通路, 则会 导致怀孕期乳腺发育的提早, 并诱发异常的乳腺细 胞扩增[15]。我们实验室前期的研究也发现了Wnt蛋 白成员之一Wnt4和Rspo1在体内协同促进干细胞的 自我更新[16]。更为重要的是, 实验室之前的研究工 作, 通过在体外3D培养体系中添加Wnt3A蛋白, 实 现了乳腺干细胞在体外培养条件下的传代扩增和干 细胞特性维持, 从而建立了乳腺干细胞体外培养的体系[17]。基于Wnt信号通路对乳腺干细胞干性维持 的关键作用, 借助自主建立的体外培养系统, 我们在 乳腺干细胞中的Wnt信号通路的靶基因中筛选出在 干细胞干性维持中能够发挥重要作用的基因, 并计 划在其中编码膜蛋白的靶基因中找到乳腺干细胞特 异的分子标记。<\/span>

乳腺干细胞分子标记的发现<\/strong>
借助芯片(Microarray)的方法, 我们得到了体 外培养的干细胞中响应Wnt信号而被激活的一系列 基因。我们从中筛选出了Procr(protein C receptor)。 Procr是一个单次跨膜蛋白[18], 之前对该蛋白的功能 研究主要集中在抗凝血反应、炎症反应和造血干细 胞等方面[19-22]。该基因在乳腺干细胞中的作用尚未 有报道。借助流式细胞分析技术和免疫荧光染色, 我们发现表达Procr的细胞是存在于基底细胞中的 一个小的亚群, 约有3%的基底细胞表达Procr。而另 一方面, Procr在管腔细胞中不表达。借助体外3D培 养的方法, 我们发现只有Procr+的基底细胞能够在 体外3D培养条件下形成克隆, 而Procr–的基底细胞 没有克隆形成能力。<\/span>

我们通过移植实验进一步地验证了Procr+的基 底细胞的体内再生能力。我们发现, Procr+的基底细胞能够在免疫缺陷的受体小鼠中更有效地再生成 新的器官, 与总体的基底细胞比较, Procr+的基底细 胞的乳腺重建能力提高了约6倍, 这表明Procr能够 作为特异地分子标记进一步地在基底细胞中富集乳 腺干细胞。<\/span>

多潜能乳腺干细胞的发现<\/strong>
为进一步验证Procr+细胞在正常乳腺发育中 是否具有这种多潜能性, 我们构建了ProcrCreERT-IRESTdtomato 基因敲入小鼠。在Procr+细胞中特异表达 CreER重组酶, 该重组酶需要在注射Tamoxifen的情 况下才能被条件性地激活。接着我们通过遗传实 验获得ProcrCreERT-IRES-Tdtomato、RosamTmG/+小鼠, 在注射 Tamoxifen的情况下, 未发生同源重组的细胞依然表 达mTomato, 而Procr+的细胞产生有活性的重组酶, 开始表达mGFP[23]。这种重组是不可逆的过程, 因此 Procr+的细胞的后代细胞都表达mGFP。实验证明, 我们成功地标记了小鼠正常发育状态下乳腺中表达 Procr的细胞(图1A-图1C)。进一步追踪这群被标记 细胞的后代细胞, 分析其细胞类型, 我们证明了这群 被标记的Procr+细胞在正常乳腺发育过程中能够形 成所有的乳腺细胞类型(图1D-图1F)。该发现解决 了乳腺干细胞领域长期以来对多潜能干细胞是否存在的争议。我们证明, Procr+细胞是对位于乳腺细 胞谱系的最顶端的多潜能干细胞, 在移植实验中具 有最高的再生能力, 在谱系追踪实验中能够分化为 所有分化细胞类型[24](图2)。<\/span><\/p>

<\/p>

A-C: 短期(2 d)追踪标记基底层中单个Procr+细胞; D-F: 长期追踪(3周)显示, Procr+细胞产生的后代包括了基底层细胞和管腔细胞。 A-C: short term (2 days) tracing of single Procr+ cell in basal layer; D-F: long term (3 weeks) tracing shows the progeny of Procr+ cells contribute to both basal and luminal layer.
<\/p>

图1 细胞谱系追踪: Procr能够标记多潜能的乳腺干细胞(根据参考文献[24]修改) Fig.1 Procr labels multipotent adult mammary stem cells in lineage tracing (modified from reference [24])<\/p>


多潜能乳腺干细胞VS乳腺癌干细胞<\/strong>
发现Procr标记的多潜能乳腺干细胞为我们进 一步研究乳腺干细胞的特性奠定了坚实的基础。 我们通过高通量的RNA-seq技术, 比较了基底细胞 中Procr+和Procr–细胞的转录组差异。我们发现, 这群正常乳腺来源的多潜能干细胞具有明显的上皮– 间充质相互转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)的特性。上皮–间充质相互转化在乳腺癌的发 生和转移过程中发挥十分重要的作用[25-26]。而Procr 也在CD44+富集的乳腺癌干细胞中高表达[27]。正常 乳腺干细胞表现出明显的EMT特性, 这提示我们, 可 能正常乳腺干细胞和乳腺癌干细胞之间的相似性要 远比我们之前认识的多得多。这为我们从正常乳腺 干细胞入手, 研究肿瘤干细胞的性质, 进而研究肿瘤 的发生和转移提供了新的思路。<\/span>
<\/p>

<\/p>

Procr标记的多潜能乳腺干细胞, 能够在移植实验中具有最高的乳腺重建率, 并且能在细胞谱系追踪过程中形成所有的乳腺细胞类型。 Multipotent MaSCs marked by Procr can generate all differentiated cell types, as determined by lineage tracing, and display the highest repopulation efficiency by transplantation.
<\/p>

图2 多潜能和单潜能的乳腺干细胞在乳腺上皮系统中共同存在(根据参考文献[24]修改) Fig.2 Multipotent and unipotent MaSCs coexist in the mammary epithelial cell hierarchy (modified from reference [24])<\/p>


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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-21-39-830.jpg","cshort":"

曾艺, 中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员, 博 士生导师。1997年毕业 于暨南大学生物工程学系, 2000年在该校获硕士学位。2005年毕业于加拿大 Simon Fraser大学, 获分子及细胞生物学博士学位。<\/span><\/p>","cshort2":"

曾艺, 中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员, 博士生导师。1997年毕业 于暨南大学生物工程学系, 2000年在该校获硕士学位。2005年毕业于加拿大 Simon Fraser大学, 获分子及细胞生物学博士学位。2005年至2010年在美国斯 坦福大学Howard Hughes医学院著名科学家Roel Nusse实验室从事博士后研 究, 获California Institute of Regenerative Medicine博士后奖学金。2010年10月 起任生物化学与细胞生物学研究所研究员。曾艺研究组主要以小鼠乳腺为 组织模型, 研究乳腺干细胞自我更新的调控机制及其在乳腺癌发生发展中的 变化。在Nature、 Cell Stem Cell、Genes Dev、Development等著名学术期刊 发表论文多篇。实验室近期在Nature上发表的研究成果首次发现了乳腺干细 胞特异标记分子, 进而证实乳腺干细胞具有多潜能性, 从而结束了乳腺中是 否存在“多潜能”干细胞这一争议, 在干细胞基础研究中获得重大理论突破, 对 于乳腺癌的诊断及靶向治疗具有重大意义(Wang et al. Nature 2014)。 http://www.sibcb.ac.cn/PI.asp?id=134<\/span><\/p>","ctitle":"多潜能乳腺干细胞的发现","listseq":25,"seqno":"35","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-50-10-164"},{"caddress1":"中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031","cauthor":"崔 晔 李森林 王 强 王 琛*","cintpic":"","clicktime":7,"clong1":"

固有免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的快速 响应机制, 主要包括宿主细胞识别病原微生物、诱 导干扰素等细胞因子和趋化因子分泌, 建立细胞抗 感染状态, 最终启动适应性免疫, 控制并消灭病原 微生物。宿主通过胚系基因编码的模式识别受体 (pathogen recognition receptor, PRR)识别病原微生物 的保守组分, 即病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)[1], 如核酸分子、LPS 等。病原微生物来源的核酸组分可以被模式识别受 体结合, 宿主自身核酸如果暴露在细胞质, 也可以被 识别。因此, 固有免疫反应是一把双刃剑, 既可以帮 助机体迅速清除危险, 也可能诱发自身免疫疾病, 如 系统性红斑狼疮等[2]。深入研究固有免疫系统识别 核酸的分子机制具有重要的理论价值和临床实践意义。<\/span>

模式识别受体包括Toll样受体(Toll like receptor, TLR)、RIG-I样受体(RLR)和NOD样受体等。已 有报道, 病原微生物的RNA组分可被存在于膜上的 Toll样受体和胞质中的RIG-I样受体识别[3-5]。例如, TLR家族的TLR3可以识别某些免疫细胞的内涵体 中的病毒RNA; RIG-I/MDA5可以识别胞质中的病毒 RNA。RIG-I/MDA5识别病毒RNA后, 诱导线粒体 外膜上的MAVS(也称IPS-1)形成多聚体, 激活TBK1 和IKK激酶复合物, 后者分别磷酸化IRF3或NF-κB转 录因子, 诱导相关抗病毒蛋白质的表达。<\/span>

近年来, 一系列潜在的DNA受体相继被报道[6-11], 它们的生理功能需要进一步在体内确认。有趣的是, 所有这些受体均通过STING(stimulator of interferon gene)接头蛋白质向下游传递应急信号。STING本身 还可以作为受体, 直接结合细菌分泌的重要第二信 使——环二核苷酸(cyclic dinucleotides, CDNs), 诱导 抗感染的固有免疫反应[12-16]。因此, STING是细胞 内应答DNA入侵的关键节点分子, 它的生理与病理 功能已经确立。STING如何激活TBK1-IRF3并向下 游传递信号, 是近期的研究热点。<\/span>

1 STING的发现与组织分布<\/strong>
利用cDNA库互补筛选的手段, 4家实验室先后 报道了STING可以强烈激活TBK1和IRF3抗病毒细 胞信号通路[17-20]。科研人员利用STING基因敲除小 鼠, 确立了STING是应答疱疹病毒(HSV-1)等DNA病 毒感染的关键信号分子。<\/span>

STING又称为TMEM173、MPYS、MITA或 ERIS, 是一种存在于宿主细胞内质网膜(也有报道称 在线粒体膜和其他膜相关结构)上的跨膜蛋白。人 源与鼠源的STING有81%的相似性。在其他种群的 细胞中, STING也是高度保守的。<\/span>

人源的STING由379个氨基酸组成, 其N-端 (1~137 aa)为4次跨膜结构域, C-端包含一个CTD结 构域, 伸向胞质中, 可以结合胞质中的CDNs并招募 下游信号蛋白。STING高表达于一些免疫细胞来源 的细胞系, 如THP-1、Raw264.7等, 但在HEK293T、 HeLa和Huh-7细胞中表达极低。这种细胞表达特异 性暗示STING可能在免疫系统中具有重要功能。<\/span>

2 STING上游的DNA受体<\/strong>
在pDC细胞中, TLR9可以识别CpG-DNA, 通过 MyD88向下游传递信号, 最终诱导I型干扰素和炎症 因子的表达。TLR9存在于内涵体上, 因此它无法识 别细胞质内的DNA。李斯特菌感染细胞后, 其DNA 可以通过细菌分泌系统进入胞质。在TLR9敲除的 免疫细胞中, 李斯特菌仍然可以激活TBK1-IRF3信 号通路, 诱导产生I型干扰素[21]。这暗示细胞质中存 在新颖的受体蛋白质, 可识别病原微生物的DNA。<\/span>

近年来, 一系列潜在的DNA受体相继被报道。 首先, DAI(ZBP1)在多种细胞类型中与dsDNA共定 位, 但是不包括MEFs、BMDCs和BMDMs; 在L929 细胞中敲低DAI, 可显著抑制dsDNA诱导的I型干扰 素的产生[6]。然而, DAI基因敲除的小鼠在B型DNA 刺激下, 仍能大量表达I型干扰素[22], 且较野生型小 鼠表现出同等强度的免疫反应。这暗示DAI并非dsDNA刺激下产生I型干扰素所必需。<\/span>

RNA聚合酶III特异应答富含AT的双链DNA, 通 过RIG-I介导的信号通路向下游传递信号。DDX41 在BMDCs和单核细胞中识别胞质DNA, 通过其 DEADc结构域结合poly(dA:dT)或HSV-1的病毒DNA, 然后与STING发生相互作用, 激活TBK1。IFI16属于 PYHIN家族蛋白, 包含一个pyrin结构域和两个HIN 结构域。它既可以结合单链DNA, 也可以结合双链 DNA。IFI16可以激活STING信号通路, 诱导I型干 扰素的生成, 也可通过ASC介导炎症反应。另一个 PYHIN家族蛋白AIM2, 也被认为是胞内DNA的模式 识别受体, 可激活炎症小体和caspase-1。但是, AIM2 不能在dsDNA作用下诱导表达I型干扰素[10]。<\/span>
LSm14A是LSm家族的一员, 参与RNA的加工、 成熟。LSm14A既结合poly(I:C)又结合poly(dA:dT) 和病毒DNA。敲除LSm14A后, 可显著降低SeV或诱 导IFN-β的表达, 这说明LSm14A既可以响应RNA病 毒, 也可以响应DNA病毒[23]。<\/span>

以上这些DNA受体主要存在于某些特定的细 胞类型中, 它们的抗病毒功能不具有普适性。<\/span>

最近报道了一种新的DNA受体cGAS[8,24]。鼠 源的cGAS在Raw264.7和BMDM细胞中高表达, 在永生化的MEF细胞中含量较低。在原代MEF、 BMDM和DC细胞中, cGAS是应答目前已知的胞内 DNA(包括HT-DNA、大肠杆菌DNA、poly(dA:dT)、 ISD、HAV-1和VACA)所必需的。此外, cGAS也是 应答DNA病毒(如HSV-1、MHV68和牛痘病毒)的关 键受体。<\/span>

3 第二信使分子激活STING信号通路<\/strong>
环二核苷酸(CDNs)是由两个核苷酸通过5′→3′ 方向的磷酸二酯键环化形成的, 主要包括环二鸟苷 酸(c-di-GMP)和环二腺苷酸(c-di-AMP)。CDNs是细 菌合成的重要第二信使, 调节细菌的许多生物学过 程, 例如细菌的毒性、鞭毛的运动能力以及生物膜 的形成[25-27]。Woodward实验室首先发现, 李斯特菌 感染宿主细胞后, 它的CDNs可以进入细胞质, 诱导 宿主细胞产生I型干扰素, 抵抗李斯特菌的感染[28]。 这表明宿主细胞内存在PRR, 特异识别并应答CDNs。 通过正向遗传学途径, 另一研究筛选到Goldenticket 小鼠。李斯特菌感染该小鼠时, 无法诱导I型干扰 素。基因组分析发现, 该小鼠的STING的苏氨酸突变为丙氨酸, STING不能响应CDNs[29]。体外实验证 明, STING可以直接结合c-di-AMP和c-di-GMP。因此, STING是CDNs的直接受体PRR。<\/span>

STING的C-端结构域以及C-端结构域共结晶 CDNs的结构已被解析, 这有利于更好地理解STING 与配体结合并激活的分子机理。STING以二聚体的 形式存在, 其单体C-端末尾具有较高柔性, 易于敞 开; 一旦结合CDNs后, 就形成一个“盖子”结构域, 并 与其他部分形成更加稳定的“口袋”结构, 牢固地结 合CDNs[14,30-32]。一些可以诱导宿主细胞产生I型干 扰素的化合物, 如DMXAA、CMA等, 也通过类似的 方式直接激活STING[13, 33-34]。<\/span>

最近的突破性进展阐明, cGAS可以识别胞质中 的DNA, 催化GTP和ATP形成2′3′-cGAMP。与细菌 产生的第二信使c-di-AMP和c-di-GMP类似, 胞内合 成的2′3′-cGAMP可以强烈诱导干扰素表达, 并依赖 于STING-TBK1-IRF3信号轴。因此, STING识别第 二信使的分子机制将各种DNA刺激的应答模式统 一了起来。<\/span>

4 STING激活TBK1的信号转导机制<\/strong>
双链DNA或环二核苷酸通过直接或间接的方 式, 解除STING的自抑制状态。STING随即转移到 高尔基体或核周围小体(perinuclear microsome); 该 过程伴随招募TBK1和磷酸化IRF3, 最终激活下游相 关基因的转录。STING和TBK1发生转移的调控机 制、TBK1的激活机制以及高尔基体或核周围小体 的具体功能, 是本领域研究者非常关注的科学问题。 我们最近的研究工作为解决这些疑惑提供了一些新视角。<\/span>

我们通过免疫共沉淀和质谱鉴定的方法搜寻 STING信号复合物的新调控蛋白质分子。ER应急 反应相关的E3泛素连接酶AMFR(autocrine motility factor receptor)进入了我们的视野。AMFR和 INSIG1(insulin induced gene 1)定位于内质网, 是调 控糖和脂代谢的关键蛋白质。我们的系统分析表 明, AMFR或者INSIG1缺失的细胞中, 由胞质DNA刺 激引发的、STING介导的抗病毒基因的表达显著减 少。与此一致的是, 髓样细胞中INSIG1特异性敲除 的小鼠相比于野生型的小鼠更易受HSV-1病毒的感 染。深入的分子机制研究表明, STING通过INSIG1 招募AMFR, AMFR催化STING发生K27链型的多聚泛素化修饰; 此泛素链作为分子平台招募TBK1, 将 STING和TBK1转移到核外周小体上[35]。STING与 TBK1在核外周小体通过未知的机制激活TBK1。但 在此过程中, STING和TBK1为何需要转移到核外周小 体, 目前仍然是个谜(图 1)。<\/span><\/p>

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病原微生物的DNA或RNA、环二核苷酸小分子被胞质中相应受体识别后, 通过STING-TBK1-IRF3信号通路启动I型干扰素基因的表达。RNF5 催化STING发生K48位泛素化(橙色)修饰, 促进STING被蛋白酶体降解, 抑制抗病毒反应。在胞质DNA刺激下, AMFR催化STING发生K27链型 的泛素化(绿色)修饰, 此泛素链招募TBK1, 使其转移到核外周小体上; TRIM32和TRIM56催化STING复合物中的未知组分发生K63位泛素化(蓝 色)修饰, 促进STING向下游传递信号。在病毒感染初期, RNF26催化STING发生K11位泛素化(紫色)修饰, 促进下游I型干扰素基因的表达。激 活的TBK1磷酸化STING的多个丝氨酸位点, 增强STING对IRF3的亲和性; 游离的ULK1磷酸化STING, 抑制下游IRF3的生物学功能。 Cytosolic DNA sensors bind to microbial DNAs, RNAs or cyclic di-GMP/AMP, which initiate the STING-TBK1-IRF3 signaling axis and ultimately induce the expression of type I interferons. RNF5 catalyzes the K48-linked poly-ubiquitination (orange colored) of STING and promotes its proteasome mediated degradation, thus attenuating innate antiviral responses. Cytosolic DNAs trigger the K27-linked poly-ubiquitination (green colored) of STING catalyzed by AMFR. This unique poly-ubiquitin chain serves as a platform to recruit TBK1, thus facilitating its translocation to perinuclear microsome. TRIM32 or TRIM56 catalyzes the K63-linked poly-ubiquitination (blue colored) of STING and potentiates the STING signaling. In the early phase of virus infection, RNF26 catalyzes the K11-linked poly-ubiquitination (purple colored) of STING and promotes the induction of type I interferons. Activated TBK1 could also phosphorylate STING and enhance the association between STING and IRF3. In contrast, the dissociated ULK1 phosphorylates STING and suppresses IRF3 activation.
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图1 磷酸化和泛素化修饰调控STING介导的细胞信号通路
Fig.1 Phosphorylation and ubiquitination of the STING-mediated antimicrobial signaling pathway<\/p>


5 STING的其他翻译后修饰以及相关生<\/strong>
物学效应 有报道认为, 胞质dsDNA通过STING将TBK1激 酶激活, 后者可以直接磷酸化STING的多个丝氨酸 位点(Ser358、Ser353和Ser379), 增强STING对IRF3 的亲和性, 促进TBK1磷酸化IRF3, 最终诱导IRF3二 聚化入核, 激活下游基因的转录[36]。另一报道认为, cGAS催化合成的cGAMP在激活STING的同时, 还可 以激活AMPK通路; ULK1与AMPK因此解离, 游离的 ULK1特异性地磷酸化STING(Ser366), 抑制STING 诱导下游IRF3的磷酸化, 形成负反馈调节通路[37]。<\/span>

RNF5与STING一样, 在线粒体和内质网都有分 布。病毒感染时, RNF5和STING的定位发生改变。 RNF5通过催化线粒体上STING的Lys150发生K48位 多聚泛素化, 促进STING被蛋白酶体降解, 从而终止 STING向下游传递信号, 负调控固有免疫应答反应[38]。<\/span>

Tsuchida等[39]发现, TRIM56是干扰素诱导表达 的泛素连接酶, 它能够促进STING信号转导通路的 活力。TRIM56通过结合STING, 催化后者Lys150发 生K63位连接的多聚泛素化修饰。这种修饰可促进 STING的二聚化, 有利于招募TBK1。Zhang等[40]报道, TRIM32催化STING的Lys20/150/224/236发生K63位 连接的多聚泛素化修饰, 这种修饰可促进STING与 TBK1之间的相互作用。我们无法重复以上实验结 论。我们在蛋白质变性的条件下进行免疫共沉淀, 无法检测到二者催化STING发生泛素化修饰。我们 推测, TRIM56和TRIM32可能催化STING信号复合 物的其他蛋白质发生泛素化修饰, 间接调控STING 信号通路。<\/span>

生化分析表明, STING的Lys150是一个重要 的泛素化修饰位点, 对于STING的二聚化以及招募 TBK1具有重要的功能。结构生物学的证据却并 不支持该观点: Lys150并不参与STING的二聚化以 及活化。当把Lys突变为Ala、Leu、Arg时, STING 仍然形成二聚体。而在STING缺失的MEF中回转 K150R, 在B型DNA的作用下, I型干扰素的诱导表达没有明显变化[40]。<\/span>

Qin等[41]报道, E3泛素连接酶RNF26定位在内 质网上, 催化STING发生K11链型的多聚泛素化修 饰。有趣的是, 在病毒感染早期, RNF26催化形成的 K11多聚泛素链竞争STING的K48位泛素化修饰位 点, 可以阻止RNF5引起的STING的降解, 促进I型干 扰素的表达; 但在病毒感染的晚期, RNF26通过促进 IRF3的溶酶体降解, 抑制I型干扰素的表达(图 1)。<\/span><\/p>



6 STING在自身免疫病中的潜在功能<\/strong>
虽然I型干扰素的表达可以有效抵御病原微生 物的入侵, 但是过量的I型干扰素会诱发严重的自身 免疫疾病[2,42]。正常情况下, 真核细胞的DNA分子 仅存在于细胞核和线粒体中, 无法被胞质DNA受体 识别。但是在一些严重的炎症和细胞坏死的情况 下, 这些DNA分子就会暴露在胞质内, 通过STING 信号通路激活宿主的固有免疫反应, 造成机体损伤。 DNases可以清除细胞内异常的DNA分子, 避免细胞 内积累自身的DNA。

实验表明, 清除自身DNA的机制受损, 就会激 活I型干扰素的异常表达, 最终诱发自身免疫疾病。 例如, DNase I缺失或者突变的小鼠相比于野生型小 鼠更容易患系统性红斑狼疮[43]。DNase II缺失的小 鼠, 体内积累未完全降解的DNA, 导致I型干扰素的 异常表达, 胚胎致死。如果将DNase II缺失的小鼠与 I型干扰素受体缺失的小鼠杂交, 能够获得存活的子 代小鼠, 证明过量的I型干扰素是DNase II缺失小鼠 胚胎致死的关键原因。有趣的是, 将STING缺失的 小鼠与DNase II缺失的杂合子杂交, STING/DNase II 双敲除的子代就不会患系统性红斑狼疮病症。这有 力地证实, DNase II缺失导致的自身免疫疾病以及胚 胎致死是依赖于STING信号通路的[44]。

7 前景与展望<\/strong>
STING介导宿主细胞识别胞质异常DNA的生 物学功能已经确立。一方面, STING可以直接作 为模式识别受体, 识别环二核苷酸c-di-GMP、c-di- AMP, 诱导I型干扰素的表达; 另一方面, STING作为 关键支架蛋白, 传递其他dsDNA受体的信号。被激 活的STING发生磷酸化、泛素化等修饰, 通过亚细 胞器转位的方式, 进一步向下游传递信号, 激活下游 的TBK1和IRF3, 最终促进I型干扰素的表达。

目前, 对STING信号转导通路的解析还处于萌 芽阶段。许多关键的信号转导和调节分子有待发现 及深入研究, 相关的分子作用机制和结构解析需要 进一步阐释。例如, PRRs如何将信号传递到STING, STING又是如何激活TBK1的以及STING和TBK1共 聚集在核周围区域有什么生物学效应。病原微生物 通过干扰STING逃逸天然免疫的研究才起步。对这 些问题的阐释, 将有利于解析抗病毒细胞信号通路 的分子机制, 理解病原微生物逃逸宿主天然免疫的 机制, 为有效控制和治疗感染相关的疾病提供新策 略和新思路。

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王琛, 1998年毕业于中国科学院生物化学研究所, 获理学博士学位。1998~2002年先后在University of Connecticut Health Center和University of Texas Southwestern Medical Center进行博士后研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

王琛, 1998年毕业于中国科学院生物化学研究所, 获理学博士学位。 1998~2002年先后在University of Connecticut Health Center和University of Texas Southwestern Medical Center进行博士后研究。2002年8月起, 在中科院上海生物化学与细胞生物学研究所从事固有免 疫相关的细胞信号转导研究。主持科技部“863 项目”、“973项目”、基金委“重点研究项目”, 并参与“国家重大科技专项” 等课题多项。实验室兴趣主要集中在解析宿主 与病原微生物互作过程相关的细胞信号转导通路, 力图寻找调控固有免疫 信号转导通路的新分子和新机制, 为筛选特异性抗感染药物提供新靶点和 新策略。已在Nature、Cell、Nature Immunology、Immunity、PLoS Pathogens 、Journal of Cell Biology、Molecular and Cellular Biology以及Journal of Immunology等杂志发表50余篇研究论文。该实验室近期在Immunity发表 的研究成果揭示了宿主细胞抗病毒信号通路关键枢纽分子STING如何招 募TBK1并协同转移到核周小体的精细分子机制, 为研发新型免疫佐剂和 治疗自身免疫疾病提供了新视角(Wang et al. Immunity 2014)。<\/span><\/p>","ctitle":"宿主识别与应答胞质内DNA入侵的信号转导机制","listseq":26,"seqno":"34","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-49-29-564"},{"caddress1":"清华大学医学院, 清华大学免疫学研究所, 动态免疫生物学实验室, 北京 100084","cauthor":"刘 丹 徐和平 祁 海*","cintpic":"","clicktime":7,"clong1":"

免疫系统是机体抵抗感染、维护自身健康的重 要屏障。以产生高亲和力抗体为主要效应的体液免 疫应答, 是免疫系统清除外界抗原物质的重要生理 过程。B淋巴细胞在外周淋巴组织中进行增殖和分 化, 然后进入B细胞区识别抗原, 与T淋巴细胞发生 相互作用, 从而出现增殖性原发灶, 继而形成生发中 心(germinal center, GC)[1-2]。被抗原激活的B淋巴细 胞在此发生克隆性增殖、Ig可变区基因的体细胞高 频突变、Ig类型转换、高亲和力B淋巴细胞克隆的 阳性选择以及无关或自身反应性B淋巴细胞克隆的 阴性选择, 最终生成记忆性B淋巴细胞和浆细胞[3-4]。 在这个过程中, T淋巴细胞给予B淋巴细胞的辅助信 号是筛选高亲和力抗体生成B细胞的决定性因素之 一, 而滤泡辅助T细胞(follicular T-helper cells, Tfh细 胞)则可专一地给B淋巴细胞提供帮助, 促进B淋巴 细胞免疫应答及生发中心的产生和维持的T细胞亚 群[5-6]。<\/span>

Tfh细胞选择性地高表达其特有的表面分子, 如CXCR5(C-X-C chemokine receptor type 5)、PD- 1(programmed cell death protein-1)、SAP(SLAMassociated protein)、IL-21(interleukin-21)、SLAM 家族成员CD84、CD40L和ICOS(inducible costimulatory molecule)以及低表达Blimp-1(Blymphocyte- induced maturation protein-1)[7-8]。这个特 有的表达谱反映了Tfh细胞两大关键特点: 独特的解 剖定位和通过接触性互作为抗原特异性B淋巴细胞 提供帮助。在免疫反应过程中, B淋巴细胞上表达的 CXCR5使其对CXCL13(C-X-C motif chemokine 13) 产生响应并运动到一定区域从而形成滤泡区。继而, 表达CXCR5的CD4+ T淋巴细胞也能对CXCL13产生 响应并定位到B淋巴细胞形成的滤泡区, 成为Tfh细 胞[9-10]。这种T淋巴细胞与B淋巴细胞共定位的关系 对于T-B细胞之间的相互作用以及TCR与MHC之间 的结合都起到了非常关键的作用, 直接影响T淋巴细 胞在这一过程中对抗原特异性B淋巴细胞的帮助。<\/span>

比如, SAP的缺失或突变会导致T淋巴细胞与B淋巴 细胞之间无法形成紧密的长时间的相互作用, 从而 影响生发中心和Tfh细胞的生成, 进而影响高亲和力 抗体的形成, 造成X-连锁淋巴细胞增生症等疾病的 发生[11-13]。之所以Tfh-B细胞间抗原特异的长时程 接触性作用很重要, 是因为B细胞所需的重要辅助 因子多是膜表面分子。比如, Tfh细胞表达的CD40L 结合B细胞表面CD40受体, 从而刺激B细胞增殖及 分化。CD40或者CD40L的缺失均会导致生发中心 及Tfh细胞的缺失, 并且当用抗体来封闭CD40L的活 性时, 已发育成熟的GC会也迅速萎缩[14]。有趣的是, 尽管Tfh细胞与抗原特异性的B淋巴细胞在滤泡区 进行长时程的相互作用, 它们在生发中心里往往以 很快的速度穿梭, 两者间的相互作用大部分是短暂 的(一般小于5 min)[4,13]。那么, 在这些短暂的相互作 用过程中, Tfh细胞是如何来调节生发中心反应并筛 选高亲和力B细胞的？这是我们一直希望回答的问题。<\/span>

协同刺激分子ICOS及其配体ICOSL均对GC的 形成与发育起到重要作用。在小鼠模型中, ICOS 或者ICOSL的缺失均会导致生发中心和Tfh细胞的 缺失[15-17], 而在ICOS的抑制基因Roquin突变情况下, ICOS的持续表达会增加Tfh细胞的比例, 从而引发自 身免疫疾病狼疮[18]。临床研究也发现, 在ICOS突变的 情况下, 人类会出现IgG、IgM和浆细胞缺失的免疫缺 陷病, 并且这些病人易被细菌和病毒感染[19-21]。在细 胞水平上, ICOS和ICOSL这对分子至少有两方面重 要作用: 一方面, T细胞能够从树突状细胞的ICOSL 上获得ICOS的信号刺激来维持并促进其分化成Tfh 细胞, 同时ICOS缺陷的T细胞不能上调CXCR5的 表达, 从而缺失了迁徙进入滤泡区的能力[17]; 另一 方面, 最新的研究表明, 独立于协同刺激信号以外, ICOS信号可以通过PI3K通路来诱导T淋巴细胞伪足 的产生, 直接控制T淋巴细胞在体内迁移运动能力, 从而决定其在滤泡区组织中的迁移和分布[22]。在这个过程中, 抗原非特异的滤泡旁观B淋巴细胞表面 表达的ICOSL至关重要。然而, 抗原激活的B细胞以 及GC B细胞都表达ICOSL, ICOS-ICOSL在抗原特 异GC B-Tfh细胞互作中起何种作用并不明确。我们 猜测, ICOS-ICOSL信号或许参与调控了那种短暂的 GC B-Tfh细胞间互作, 进而影响生发中心反应。<\/span>

为了检验ICOS-ICOSL信号是否调控生发中心 反应, 我们使用50%的ICOSL+/+骨髓细胞和50%的 ICOSL–/–骨髓细胞构建了混合骨髓重建模型, 在免 疫反应的不同时间点检测两种B细胞在生发中心及 浆细胞中所占据的比例。我们发现, 在这种竞争条 件下, ICOSL–/– B细胞在维持生发中心反应以及发 育成浆细胞方面存在缺陷。这些结果说明, ICOSICOSL 信号确实会调控生发中心反应。那么, 这是 否是通过调控GC B细胞与T细胞之间的互作而实现 的呢？对此, 我们利用了双光子显微成像技术来观 测ICOSL+/+与ICOSL–/– B淋巴细胞与T淋巴细胞生发 中心附近相互运动。我们发现, ICOSL–/– B淋巴细 胞与T细胞的接触多是“擦肩”而过的形式, 即两种 细胞相互接触的面积很小; 而ICOSL+/+ B淋巴细胞 却更加倾向于与T淋巴细胞以“交互纠缠”模式进行 相互作用, 两者接触表面积很大很充分。另外, 实 验发现, T淋巴细胞分别与抗原非特异性的ICOSL+/+ 和ICOSL–/– B淋巴细胞的相互作用形式没有区别, 均倾向于“擦肩”模式。由此可见, 抗原特异性ICOSICOSL 的信号能够促进T-B细胞的胞膜接触面积, 使 得T细胞能够通过这个接触面更好、更迅速地向B 淋巴细胞传递B细胞生存增殖分化所需要的辅助信 号, 并且这种“纠缠”般的接触是T细胞受体刺激产生的。<\/span>

那么, 这种“纠缠”般的T-B细胞间的互作形式 对于生发中心反应的发生具体有什么功能性的作用 呢？已有的研究结果表明, 与抗原特异性B淋巴细 胞相互作用时, T细胞能够产生钙信号[23], 所以我们 构建了体内基于FRET(fluorescence resonance energy transfer)的钙信号报告系统[24-25], 能够实时监测T淋 巴细胞产生的钙信号。我们发现, T-B细胞间短暂而 频繁地“纠缠”般的相互作用能够促使T细胞产生大 量的钙信号, 而即使在这种充分地T-B细胞接触下, ICOSL–/– B淋巴细胞依然不能刺激T细胞产生钙响 应。同时我们还关注到, 当共刺激T细胞受体和ICOS 时, T细胞能够产生更多的钙响应。<\/span>

CD40信号是B淋巴细胞生存增殖所必需的, 活化的T淋巴细胞内有 着大量的CD40L, 但T细胞膜表面的CD40L量是被严 格控制的, 其主要是通过外排的过程表达到细胞膜 上, 从而跟B细胞接触来给予CD40信号刺激[26-28]。通 过共刺激ICOS增强钙信号, T细胞就可以在与B细 胞纠缠互作过程中通过胞吐过程给B淋巴细胞传递 的更多的CD40信号。而更加有趣的是, 接收了更多 CD40信号的B淋巴细胞会进一步上调其ICOSL的表 达量, 从而能够更加容易与T淋巴细胞进行“纠缠”互 作, 产生更多的钙信号, 进而得到更多的辅助信号, 这就形成了一个正反馈调节。于是我们猜想, T-B细 胞之间的这种正反馈调节可能会在生发中心B细胞 群相互竞争中构成一种“马太效应”: 高亲和力B细 胞将通过更有优势的抗原受体获取更多的抗原, 从 而能与Tfh细胞更好地“纠缠”互作; 这会导致B细胞 获得更多的CD40L辅助信号进而表达更多ICOSL; ICOSL升高会促进这些B细胞更有效地与T细胞“纠 缠”互作, 从而在竞争T细胞帮助的过程中更容易获 胜。如此, 正反馈调节可能是高亲和力B细胞能从生 发中心被有效选择出来的一个重要保证。<\/span>

为了进一步验证上述我们的假说, 我们从B细 胞定位分化及亲和力成熟两方面进行了实验。获得 足够T细胞帮助的B细胞会离开生发中心而分化成 浆细胞。所以, 我们将ICOSL+/+和ICOSL–/– B细胞与 T细胞共同回输到小鼠体内并免疫, 利用双光子活体 成像显微技术来观测两种B细胞与T细胞的分布及 运动。结果发现, ICOSL+/+ B细胞与Tfh细胞在主要 由ICOSL+/+ B细胞构成的生发中心里均匀分布, 而当 生发中心主要是由ICOSL–/– B细胞构成时, Tfh细胞 与ICOSL+/+ B细胞共定位在生发中心的外周边缘。 边缘分布显示, 这些ICOSL+/+ B细胞可能即将离开生 发中心, 而少量ICOSL+/+ B细胞在与多数ICOSL–/– B 细胞竞争时仍能“纠缠”住Tfh细胞, 暗示正反馈循环 的存在使得ICOSL+/+ B细胞更受Tfh细胞的“青睐”。<\/span>

选择高亲和力B细胞是生发中心反应的主要功 能。为了直接检验B细胞亲和力成熟的过程, 我们 使用了NP(4-hydroxy-3-nitrophenyl hapten)半抗原系 统, 由此我们可以通过克隆结合NP的B细胞受体然 后测序来检测亲和力谱[29-31]。实验结果显示, 在GC B细胞群里高表达ICOSL的细胞多为高亲和力B细 胞; 在ICOSL+/+:ICOS–/–骨髓嵌合小鼠中, 无论是在 GC B细胞还是骨髓浆细胞中, ICOSL–/– GC B细胞都有更高的相对抗原亲和力, 说明ICOSL分子缺失导 致的竞争缺陷需要由更高亲和力的B细胞受体来弥 补; 当我们选择性地从GC B细胞上去掉ICOSL从而 打破这种正反馈循环时, 生发中心的形成不受影响, B细胞受体随机突变频率不变, B细胞间对抗原和T 细胞的竞争也仍然存在, 唯一改变的是这种生发中 心不能再有效地选择出高亲和力B细胞。由此可见, ICOSL驱动的正反馈循环对生发中心里亲和力B细 胞的选择及分化至关重要。<\/span>

总结起来, 我们的研究显示, 在生发中心T-B细 胞间短暂而反复的互作中, ICOSL能够促进T-B细 胞以更大的胞膜接触面积进行相互作用, 通过刺激 ICOS促进T细胞钙响应, 从而进一步增大“纠缠”互 作及传递辅助信号给B细胞; 而获得更多辅助信号 的B细胞会进一步上调ICOSL, 更容易与T细胞“纠 缠”互作, 从而获得更多的T细胞帮助。这种ICOSL 分子驱动的T-B细胞间正反馈调节是机体免疫应答 中有效提高抗体亲和力的新机制, 是看似随机、混 乱的细胞间竞争过程的内在调节规律。更重要的是, 过去我们几乎不可能人为地在疫苗诱导保护性抗 体过程中对亲和力进行干预, 而这项研究为改善抗 体疫苗的研发提供了一个可操控的重要靶点, 为开 发更有效的抗病毒中和抗体疫苗指明了潜在的新方向。<\/span>

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祁海, 清华大学医学院教授、博士生导师。2003年毕业于德克萨斯州加尔维斯顿医学院, 获病理学博士学位, 主要从事免疫寄生虫学研究。2003年6月至2009年4月在美国国立卫生研究院从事博士后研究, 参与完善了基于双光子显微镜的在体免疫组织动态成像技术, 主要关注体液免疫调节、多细胞在体交互作用机制、细胞与组织动态对免疫反应及记忆的影响。<\/span><\/p>","cshort2":"

祁海, 清华大学医学院教授、博士生导师。2003年毕业于德克萨斯州加尔 维斯顿医学院, 获病理学博士学位, 主要从事免疫寄生虫学研究。2003年6 月至2009年4月在美国国立卫生研究院从事博士后研究, 参与完善了基于双 光子显微镜的在体免疫组织动态成像技术, 主要关注体液免疫调节、多细 胞在体交互作用机制、细胞与组织动态对免疫反应及记忆的影响。对该 领域的主要贡献包括: 2006年, 在《Science》上证明B细胞在体内受树突状 细胞活化的过程; 2008年, 在《Nature》上揭示SAP分子调控T-B细胞相互作 用; 2013年, 在《Nature》上鉴定ICOS分子调控滤泡辅助T细胞运动能力的 新机制; 2014年, 在《Nature》上揭示生发中心B细胞亲和力成熟筛选的新 机制。祁海教授曾获得《科学新闻》与Elsevier “Scopus未来科学之星”金奖, 是Nature、Science、 Journal of Experimental Medicine的审稿人, 也是Scientific Reports编委。<\/span><\/p>","ctitle":"协同刺激分子配体ICOSL参与高亲和力抗体 筛选生成的新机制","listseq":27,"seqno":"33","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-47-32-775"},{"caddress1":"(复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室, 上海 200032)","cauthor":"王 天 沙红英*<\/sup> 纪冬梅 张海伦 陈大尉 曹云霞 朱剑虹","cintpic":"","clicktime":5,"clong1":"

遗传性线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)疾病通过母亲遗传给下一代, 引起破坏性的临床结果。因无有效的治疗方法, 故预防该疾病向子代传递成为首选。在患者卵子与健康者的卵子之间进行核置换, 可阻止突变mtDNA向子代传递, 这一技术称为线粒体捐赠。该研究成果发表前, 线粒体捐赠技术包括原核移植和纺锤体移植, 但这两种手段都不能彻底阻止疾病线粒体向子代传递。结果发现: 极体中线粒体含量极少并与卵子拥有相同的基因组物质, 故有望成为线粒体捐赠的首选核供体。基于此, 利用小鼠模型比较了四种不同的生殖细胞基因组(纺锤体–染色体复合物、原核、第一极体、第二极体)移植的特点和有效性。研究结果显示, 重构卵/胚胎支持正常受精、发育及诞生后代。遗传分析证实: 相对于纺锤体–染色体和原核移植, 极体移植产生的F1代体内携带的核供体来源的mtDNA量极少, 其中第一极体移植(first polar body transfer, PB1T)子代中未检测到核供体来源的线粒体。更重要的是, mtDNA基因型在极体移植后的子二代中仍保持稳定, 提示极体基因组移植有望阻止遗传性线粒体疾病向子代的遗传。<\/p>

1 遗传性线粒体疾病与线粒体捐赠<\/strong>
发生在卵子中的线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)突变引起母系家族性疾病[1], 即遗传性线粒体疾病, 目前尚无有效治疗手段。据不完全统计, 在发生线粒体疾病致肌无力患者中, 每200名妇女就有1名将线粒体肌无力遗传给下一代[2-3]。另一方面, 人体重要器官(能量需求高的部位如脑、心、肾、骨骼肌和内分泌腺等)更易受突变影响。疾病的临床表型非常广泛, 包括线粒体脑肌病、线粒体肌病、胃肠综合征、肌张力障碍、糖尿病、心肌病、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈病、痴呆以及耳聋等[4-8]。绝大多数线粒体疾病影响到多器官系统的正常功能, 患者只能靠药物短期缓解症状, 生活质量无法保证。同时, 因mtDNA是通过卵胞质以母源性遗传的方式进入下一代, 故患者不建议生育, 这给无数家庭带来痛苦和不幸。
卵子/胚胎显微操作技术的发展为遗传性线粒体疾病治疗带来了希望。线粒体遗传物质呈母源性遗传方式, 即由母亲遗传给下一代, 因此可利用卵子/胚胎显微操作技术对患线粒体疾病的母亲卵子进行线粒体置换(mitochondria replacement, MR), 将其核移植到去核的健康女性胞质中, 使患者获得功能正常的线粒体, 又称为线粒体捐赠(mitochondria donation, MD)。截至本研究成果公开发表前, MD技术包括中期纺锤体–染色体复合物移植(spinlde-chromosome transfer, ST)—将患者卵子的核转移到去核的健康卵子胞质内, 以及原核移植(pronucleus transfer, PNT)—将患者夫妇受精卵的原核转移到去除原核的健康受精卵胞质内。<\/p>

2 线粒体捐赠研究与临床应用现状<\/strong>
近年来, 在动物(小鼠、灵长类)研究中, 利用这两种MD技术手段都已获得线粒体置换后产生的后代[9-10]。因此, 从2011年开始, 英国人类受精与胚胎管理局(human fertilisation and embryology authority, HFEA)便已着手总结近年线粒体置换调研结果, 酝酿相应政策, 有趋势鼓励进一步临床试验研究。在漫长的科学和伦理评估以及公共咨询之后, 2014年6月, 英国当局公布了新的草案, 拟允许HFEA批准医院进行线粒体置换的临床试验[11]。同时, 今年2月份, 美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)也开始讨论和关注线粒体置换问题[12]。但美国FDA和英国HFEA评估小组最终总结认为, 在将线粒体置换用于临床前, 还需要就一些问题进行深入研究, 其中关键的问题之一是子代mtDNA混杂现象的存在。无论原核还是纺锤体–染色体复合物, 因为能量的需要, 其周围总是包裹着大量的线粒体, 当母亲的缺陷型mtDNA意外与核DNA一同转移到新的卵胞质中, 会出现子代mtDNA混杂的现象。然而, 目前人们对mtDNA混杂这一问题会引起什么后果还不清楚。更重要的是, 缺陷型mtDNA与核DNA一同转移, 使置换后的重构卵中仍含有一定量的突变mtDNA, 这些mtDNA有可能通过“遗传瓶颈”(图1)[13-17], 在子代中复制和扩增, 积累到一定的阈值, 仍会导致子代发病[18-20]。已有研究证实, 原核移植产生的MR小鼠虽然未出现被置换线粒体的表型, 但其体内仍存在线粒体异质性, 且这种异质性可以传递给子代[9]。纺锤体移植产生的MR灵长类体内亦存在约3%的线粒体异质性[10]。在采用人类胚胎的研究报道中, 虽然2010年Craven等[21]报道原核置换所获重构胚胎中仅检测到极低的被置换线粒体; 2013年, Tachibana等[22]与Paull等[23]两个研究团队分别报道采用ST方法获得的重构卵所衍生的胚胎干细胞中未检测到被置换的线粒体DNA, 但在早期胚胎及干细胞水平上的分析结果无法反映活体水平上置换后mtDNA遗传全景。因此, 虽然近年来英国政府多次召开相关讨论会征求各界意见, 最终仍未允许线粒体捐赠技术用于临床治疗。<\/p>


图1 突变线粒体向子代遗传的随机性
Fig.1 Random transmission of mutant mitochondria<\/p>

3 减数分裂过程中形成的极体基因组特点使其能攻克线粒体捐赠技术瓶颈问题<\/strong>
雌性生殖细胞形成过程中经过两次减数分裂, 形成一个大的单倍体即卵细胞和2~3个小的细胞, 这些小的细胞称为极体。当第一次减数分裂时, 形成一个大的次级卵母细胞和一个小的第一极体(first polar body, PB1); 第二次减数分裂时, 同样产生一个小的第二极体(second polar body, PB2)。无论第一还是第二极体, 均具备以下几个特点: (1)虽然极体的体积远远小于卵细胞, 但其所获得的核遗传物质与卵细胞质中的雌性核遗传物质是相等的[24-29]; (2)极体内细胞质(主要是线粒体)极少, 保证大量胞质储存于卵子内, 以供早期胚胎发育的需要[30]。极体的这两个特点提示, 极体可成为线粒体置换治疗的首选母方遗传物质供体。基于此, 我们课题组利用两种不同线粒体遗传背景的小鼠(NZW小鼠模拟线粒体疾病女性提供核基因组, BDF1小鼠模拟健康女性提供含健康线粒体的胞质), 设计两组对比实验, 第一组: 采用NZW小鼠卵子的第一极体置换BDF1小鼠的中期染色体(PB1 transfer, PB1T)、NZW小鼠卵子的中期纺锤体–染色体复合物置换BDF1小鼠的中期纺锤体–染色体复合物(spindle-chromosome transfer, ST), 构建两种线粒体置换后的重构卵, 体外受精后移植假孕母鼠体内诞生PB1T、ST线粒体置换小鼠; 第二组: NZW小鼠(♀)与BDF1小鼠(♂)受精卵的第二极体置换BDF1小鼠(♀)与BDF1小鼠(♂)受精卵的雌原核(PB2 transfer, PB2T)、NZW小鼠(♀)与BDF1小鼠(♂)受精卵的雌雄双原核置换BDF1小鼠(♀)与BDF1小鼠(♂)受精卵的雌雄双原核(pronuclei transfer, PNT), 构建两种线粒体置换后的重构胚, 并移植假孕小鼠体内诞生PB2T、PNT线粒体置换小鼠。获得各组个体及其子二代后, 采用焦磷酸测序的方法检测NZW、BDF1两种线粒体在这些个体体内的异质性比例。研究结果发现, PB1、PB2具备用于母源性线粒体疾病治疗的基础和优势: (1)相对于纺锤体和原核, PB1、PB2携带极少的线粒体; (2)PB1与纺锤体–染色体复合物、PB2与雌原核遗传与表观遗传学特征一致; (3)PB1、PB2基因组移植诞生线粒体置换后代效率与ST、PNT及IVF胚胎无显著差异性; (4)PB1T、PB2T线粒体置换小鼠体内核供体来源的线粒体比例分别显著低于ST、PNT置换小鼠体内核供体来源的线粒体比例。更重要的是, PB1T线粒体置换小鼠及其诞生的子代仅含有胞质供体即健康卵胞质供者的线粒体, 提示PB1T有望彻底阻断线粒体疾病向子代的遗传。考虑到物种之间的差异性, 我们对人的极体基因组是否仍保持完整性进行了初步的检测, 比较基因组学检测结果显示, 人类PB1与纺锤体–染色体复合物、PB2与雌原核遗传特征一致, 提示极体基因组移植技术有望应用于临床。<\/p>

4 极体基因组推动线粒体捐赠技术早日转化成临床应用, 造福线粒体疾病患者<\/strong>
该项工作不仅使我国成为国际上第三个从事该领域研究的国家, 也使我国在该领域占据国际领先地位。研究结果在《Cell》杂志公开发表后, 引起国内外广泛的关注和重视。文章发表后数日内, 已经有《Nature Review Genetic》、《Nature》、《Cell Metabolism》、《Biology of Reproduction》等杂志以及F-1000网站发文, 高度评价该研究的创新性及未来潜在的临床应用价值[31-34]。日本科学院在网上评价该研究成果, 并称“该项研究标志中国胚胎学研究工作领先全世界”[35]。英国HFEA组织及政策制定机构尤其重视这一突破: 2014年8月31日, 英国HFEA的负责人之一Hannah Verdin女士发来邮件, 向我们征询人线粒体置换研究结果, 希望能为英国国会9月底即将召开的讨论会提供有力的数据, 用以修改这项技术应用于临床的相关法律政策。在文章发表后, 我们已经启动对这项研究的临床探索, 并取得了预期的结果。为了使患者早日得到有效治疗, 我们将已获得的前期结果毫无保留地提供给了Hannah Verdin女士, 供他们讨论和制定相关政策参考。随后, 英国HFEA组织进一步邀请沙红英博士通过电话参加HFEA的专家组会议, 就线粒体捐赠技术的临床应用的有效性、安全性以及伦理等问题进行了热烈的讨论和交流。英国HFEA就该次电话会议以及我们的前期研究成果在HFEA官方网站撰文50页[36-37], 评价极体基因组移植为线粒体捐赠技术带来的突破性进展。2014年10月, 英国政策调节委员会邀请沙红英博士, 作为其他国家在该领域的专家之一向英国政府撰文呼吁, 尽快解禁这项技术在临床的应用限制。在各国专家的强力建议下, 英国政府已经于2015年2月4日通过了线粒体捐赠技术用于临床治疗的草案[38]。这些事实有力地显示了该项的研究成果在国际上所处的地位以及对人类社会的作用, 有望促进该线粒体置换技术尽早转化成临床应用, 造福患者及其家庭。<\/p>

参考文献 (References)<\/strong><\/p>

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38 http://edition.cnn.com/2015/02/03/health/uk-ivf-3-person-babies/index.html<\/p>


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沙红英, 复旦大学基础医学院医学神经生物学国家重点实验室, 讲师。1987年9月至1991年6月, 就读于华东师范大学生物学系, 大学毕业后进入江苏联环药业集团工作十年, 2001年返回华东师范大学生命科学学院攻读硕士学位, 2004年进入同济大学生命科学与技术学院攻读博士学位。2007年, 进入复旦大学临床医学博士后流动站从事核移植与体细胞重编程研究, 2009年出站留校工作至今。<\/span><\/p>","cshort2":"

沙红英, 复旦大学基础医学院医学神经生物学国家重点实验室, 讲师。1987年9月至1991年6月, 就读于华东师范大学生物学系, 大学毕业后进入江苏联环药业集团工作十年, 2001年返回华东师范大学生命科学学院攻读硕士学位, 2004年进入同济大学生命科学与技术学院攻读博士学位。2007年, 进入复旦大学临床医学博士后流动站从事核移植与体细胞重编程研究, 2009年出站留校工作至今。中国解剖学会医学发育生物学分会青年委员, 《Stem Cell》、《Cell Death and Differentiation》、《Human Molecular Genetics》等杂志审稿人。目前主要研究方向包括: (1)线粒体置换治疗母源性线粒体疾病; (2)卵子重编程患者体细胞为胚胎干细胞及其向神经细胞的诱导分化, 围绕上述研究方向以第一或通讯作者发表SCI论文6篇, 包括《Cell》、《RNA Biology》、《Cloning and Stem Cells》等高影响力期刊。在没有科研团队及充足经费的条件下, 自主选题、自组攻关小组、自筹经费完成的研究论文《Polar Body Genome Transfer for Preventing the Transmission of Inherited Mitochondrial Diseases》(第一作者并第一通讯责任作者), 于2014年6月20日在《Cell》杂志发表。该项研究首次提出极体基因组移植治疗遗传性线粒体疾病新理论、发明治疗该疾病的新技术。该工作具有潜在的临床应用价值, 有力地推动了线粒体捐赠技术的临床应用步伐, 获得国际同行的高度评价。<\/span><\/p>","ctitle":"线粒体捐赠—极体基因组移植治疗遗传性线粒体疾病","listseq":28,"seqno":"32","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-46-48-109"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 细胞生物学国家重点实验室, 上海 200031)","cauthor":"王 超 张文翔 殷梦昕 张 雷*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":4,"clong1":"

Hippo信号通路是近年来发现在进化上高度保守的肿瘤抑制信号通路, 能通过协调细胞增殖与凋亡来控制组织、器官发育的大小, 并在干细胞的自我更新及组织稳态维持中发挥着极其重要的作用。Hippo信号通路关键成员的活性异常可以导致包括癌症在内的多种疾病的发生。因此, Hippo信号通路成员的蛋白稳定性调控是Hippo信号通路研究的重点之一。果蝇中的研究表明, Hippo信号通路上游成员Pez的蛋白稳定性受NEDD4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)家族泛素连接酶Su(dx)及Kibra的共同调节, 进一步的研究揭示了该调控过程的具体分子机制。该调控在维持果蝇中肠干细胞(intestinal stem cell, ISC)稳态平衡中发挥了重要作用。在哺乳动物细胞中的研究则提示该调控机制存在进化上的保守性。这些研究成果不仅加深了我们对Hippo信号通路调控果蝇肠稳态功能的认识, 还为我们研究相关肿瘤发生发展的机制和发掘潜在的肿瘤治疗靶点提供了新的思路。<\/p>

1 Hippo信号通路与器官大小调控<\/strong>
器官发育大小的决定是发育生物学的基础问题之一。细胞生长、增殖、分化和凋亡相互协调保证了生物体器官发育的正常进行, 过度增殖或过度凋亡的发生都会导致机体功能的异常。组织器官通过感知外部环境并整合自身信号来调控其正常发育是一个非常复杂的过程。近些年, 研究人员才逐渐揭示, TSC-TOR和Hippo信号转导通路主要通过调控细胞的大小和细胞的数目从而在器官发育大小调控中发挥关键的作用[1]。
Hippo信号通路是近年来在果蝇中首先被发现和命名的并且在进化上高度保守的肿瘤抑制信号通路。这条信号通路的上游核心为由激酶Hippo(Hpo)、Warts(Wts)和相应的支架蛋白Salvador(Sav)、Mats共同组成的激酶级联复合体[2-5]。该激酶复合体活化后, 可以通过磷酸化抑制Hippo通路下游主要效应子Yorkie(Yki)的活性[6]。Yki作为转录辅因子, 与转录因子Scalloped(Sd)协同作用调控Hippo通路下游靶基因的表达(如: diap1、cyclinE、bantam microRNA等)[7-9], 通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖, 从而维持组织生长的稳态平衡。Hippo通路中的主要成员在哺乳动物里都能够找到同源物, 如Hpo的同源物为STK4/3(serine/threonine kinase 4/3, 也称为MST1/2)、Sav的同源物为Sav1(salvador family WW domain containing protein 1, 也称为WW45)、Wts的同源物为Lats1/2、Yki的同源物为YAP(Yesassociated protein)/TAZ(neurofibromin 2)[10-11], 这些哺乳动物同源物具有与果蝇同源基因类似的功能与调控方式。
已有的研究表明, Hippo信号通路与多种肿瘤的发生密切相关[10,12-13]。例如, 遗传型缺失NF2基因能显著增加神经纤维瘤的发病概率[14], 多种肿瘤细胞内都发现了Mats蛋白的缺失突变[15]; 同时, 人的肾癌细胞系中发现了Sav的突变[16], 人乳腺癌及肝癌样本中均有YAP基因的表达扩增[17]。因此, 研究Hippo通路的调控机制和功能, 能够揭示Hippo通路异常导致相关肿瘤发生发展的分子机理, 为疾病的诊断和治疗提供策略和靶标。<\/p>

2 Hippo信号通路在果蝇中肠稳态维持中的功能<\/strong>
干细胞潜在的应用前景使得干细胞生物学研究成为近些年的研究热点, 而成体干细胞研究是干细胞生物学的重要命题之一。成体干细胞具备自我更新及多向分化潜能, 在维持组织稳态平衡及损伤修复中发挥着重要作用, 是保持器官正常功能的重要保障。近年来的研究表明, Hippo信号通路在组织稳态维持和成体干细胞的自我更新等生命活动过程中, 发挥着极其重要的作用[18-19]。
果蝇中肠组织的稳态维持的机理与哺乳动物肠道较为相似。中肠干细胞(intestinal stem cell, ISC)具备分化为成熟的中肠细胞[吸收功能的肠上皮细胞(enterocyte, EC)和分泌功能的肠内分泌细胞(enteroendocrine cell, ee cell)]的能力[20], 保证了肠组织的自我更新和损伤修复, 从而维持其正常的形状、大小和生理功能。因此, 利用果蝇中肠作为研究模型, 揭示其干细胞稳态维持的调控机制, 有助于进一步理解高等哺乳动物成体干细胞的发育机制, 为进一步探索这些过程的异常与癌症等疾病发生的关系提供依据。ISC的维持、更新和分化受到一些信号通路的严格调控, 如Wnt和Hippo等信号转导通路。近年来的一些研究揭示了Hippo信号通路通过细胞自主(cell-autonomous)和非自主(non-cell-autonomous)两种方式调控ISC的增殖与分化[21], 并参与了细胞命运决定[22]。我们实验室在以果蝇ISC系统为模型的前期研究中, 发现表观遗传因子Brahma染色质重塑复合物介导Hippo信号在ISC的增殖及分化过程中发挥重要的功能[23], 并且揭示Hippo信号通路通过特异性地调节其靶基因bantam microRNA的表达来调控果蝇ISC的增殖[24]。至此, Hippo信号通路下游转录复合物及其调控的靶基因在ISC稳态维持中的作用和机制得以深入阐明, 但Hippo信号通路上游成员在果蝇中肠稳态维持中的具体机制尚待进一步研究。<\/p>

3 Hippo信号通路上游成员Pez蛋白稳定性的调控机制的发现<\/strong>
经过十几年的研究, Hippo通路的信号调控网络已日趋完善, 但作为一条相对比较新的信号通路, 其调控机制的研究还存在许多悬而未决的问题。其中, Hippo信号通路成员蛋白稳定性的调控是关键问题之一。基于此, 我们收集了果蝇中的泛素连接酶(E3), 针对Hippo信号通路中已知的各个成员, 通过生化方法在果蝇的S2细胞中进行了蛋白稳定性的筛选工作。研究发现, Hippo信号通路上游成员Pez可以被NEDD4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)家族泛素连接酶Su(dx)特异性降解。Pez属于酪氨酸蛋白磷酸酶(protein-tyrosine phosphatase, PTP), 此类磷酸酶在多种细胞生命过程中发挥重要作用, 如细胞代谢、生长及分化。在果蝇中, Pez在维持成虫ISC稳态中发挥重要作用, 其功能缺失会引起果蝇中肠干细胞的过度增殖[25]。
我们进一步通过生化实验确认, 过表达的Su(dx)可以显著降低Pez的蛋白水平, 而RNA干扰Su(dx)能使Pez的蛋白稳定性增强, 且抑制泛素–蛋白酶体途径能够阻碍Su(dx)介导的Pez蛋白的降解。同时, 利用果蝇的中肠研究体系, 我们发现, Su(dx)对内源Pez蛋白的稳定性调控对肠组织的稳态平衡至关重要。肠上皮细胞内Su(dx)蛋白水平的上调能下调内源Pez的蛋白水平, 导致ISC过度增殖并最终导致果蝇肠壁增生。<\/p>

4 Su(dx)调控Pez蛋白稳定性分子机制的阐明<\/strong>
为进一步阐明Su(dx)降解Pez蛋白的分子机制, 我们进行了系列的生化分析。体内和体外泛素化实验表明, Su(dx)促进了Pez蛋白的多聚泛素化并引起Pez蛋白通过蛋白酶体途径降解。利用免疫共沉淀的方法, 我们发现, Su(dx)和Pez蛋白之间存在相互作用。在这个过程中, Pez蛋白Pro-rich序列和Su(dx)蛋白WW结构域引起我们的注意。Pro-rich序列及WW结构域是常见的介导蛋白相互作用的结构[26]。而存在于Pez和Su(dx)中的这两种结构域从果蝇到哺乳动物均极为保守。通过进一步的生化鉴定并结合体内的功能验证, 我们最终发现, Pez蛋白中PY/PPxY序列及Su(dx)蛋白中的WW结构域特异介导了二者的相互作用并且是Pez蛋白泛素化降解所必需的。在果蝇中肠中, PY/PPxY位点突变的Pez蛋白更稳定且能有效地抑制Su(dx)蛋白水平上升所引起的果蝇中肠组织增生。
有意思的是, Kibra是已知的与Pez相互结合的蛋白, 但其对Pez的调控机制尚不清楚[25]。我们通过进一步的生化实验发现, Kibra蛋白同样利用其WW结构域, 通过与Pez蛋白中PY/PPxY序列结合, 拮抗Su(dx)对Pez蛋白的降解。因此, Pez的蛋白稳定性是受Su(dx)和Kibra共同调节的(图1)。<\/p>

5 意义、前景及展望<\/strong>
Hippo通路在细胞的增殖、凋亡、干细胞的自我更新以及组织稳态维持等生物体的生命活动过程中发挥着极其重要的作用, 其活性异常已被证实可以导致多种癌症及疾病的发生, 研究Hippo信号通路成员的稳定性调控将进一步揭示该通路活性调控机制及其与疾病发生的相互关系。我们在果蝇中的研究发现了Su(dx)泛素化降解Pez, 并利用果蝇ISC研究模型, 证明Su(dx)对Pez蛋白稳定性的调节对肠组织的稳态维持至关重要。而Pez是一个进化上十分保守的蛋白, Pez与其哺乳动物同源物PTPN14(protein tyrosine phosphatase, nonreceptor type 14)之间的关键结构域相似性在45%以上[28]。我们在哺乳动物细胞中的初步研究结果显示, Su(dx)及其同源物WWP1(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1)均能结合PTPN14, 且二者过表达均能降低PTPN14蛋白水平。PTPN14在人体内分布广泛, 如乳腺、肾脏、骨骼肌、肺脏及胎盘等, 其功能缺失与乳腺癌和大肠癌的发生密切相关[29-30], 而在人类乳腺癌和前列腺癌的细胞中, WWP1基因被过度扩增且其蛋白水平显著升高[31-32], 但其致病的机理尚不清晰。Su(dx)降解调控Pez机制的阐明可能为相关癌症的治疗提供新的思路和潜在的靶点。<\/p>


A: WW结构域和PY/PPPY序列介导Su(dx)和Pez相互作用; B: Su(dx)促进Pez蛋白泛素化并通过蛋白酶体途径降解, Kibra能够抑制Su(dx)降解Pez; C: Hippo信号调控果蝇中肠干细胞(ISC)增殖。
图1 Su(dx)调控Pez蛋白降解并维系果蝇中肠稳态及Hippo信号通路调控果蝇中肠干细胞增殖(根据参考文献[23-24,27]修改)<\/p>

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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-15-46-717.jpg","cshort":"

张雷, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员, 博士生导师, 上海科技大学特聘教授。2001年毕业于中国科学院遗传与发育生物学研究所, 获得发育生物学博士学位; 2001年至2009年在美国西南医学中心先后为博士后、助理讲师。<\/span><\/p>","cshort2":"

张雷, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员, 博士生导师, 上海科技大学特聘教授。2001年毕业于中国科学院遗传与发育生物学研究所, 获得发育生物学博士学位; 2001年至2009年在美国西南医学中心先后为博士后、助理讲师。张雷博士长期从事Hippo等信号转导通路异常与疾病发生的遗传与分子机理研究, 课题组主要利用果蝇遗传学模型, 并结合哺乳动物细胞系与疾病小鼠模型, 研究Hippo信号通路调控干细胞增殖与分化、组织发育和器官生长的分子遗传机制, 通过揭示Hippo通路异常导致相关疾病发生发展的分子机理, 为疾病的诊断和治疗提供策略和靶标。已在Dev Cell、PLoS Biol、eLife、Nat Commun、Cancer Cell、Cell Res等学术期刊发表论文40余篇。现任《中国细胞生物学学报》、《Acta Biochim Bbiophys Sin》、《遗传》等杂志的编委。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"Hippo信号调控果蝇中肠稳态维持的机制研究","listseq":29,"seqno":"31","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-46-11-389"},{"caddress1":"(1河南农业大学牧医工程学院, 郑州 450002; 2武汉大学生命科学学院, 武汉 430072)","cauthor":"褚贝贝1<\/sup> 宋保亮2*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":9,"clong1":"

胆固醇是真核细胞中含量非常丰富的一类脂质小分子, 其主要生物学功能是掺入到磷脂双分子层中, 调节膜的性质。胆固醇在细胞内不同膜上的分布极不均匀而且高度动态运输, 这对维持细胞的正常生命活动至关重要。然而, 细胞内胆固醇运输的机制一直不清楚。针对这一胆固醇代谢领域的重要问题, 同时也是一个基本的细胞生物学问题, 通过巧妙设计、全基因组筛选, 鉴定出341个参与细胞内胆固醇转运的候选基因, 其中, 过氧化物酶体相关基因被显著富集。进而发现溶酶体通过和过氧化物酶体相互接触, 将胆固醇转移给后者。而介导该接触的分子分别是溶酶体上的SynaptotagminVII(Syt7)和过氧化物酶体膜上的PI(4,5)P2磷脂。将这种新发现的溶酶体–过氧化物酶体膜接触命名为LPMC(lysosome-peroxisome membrane contacts)。过氧化物酶体功能缺失会导致一大类相关疾病—过氧化物酶体紊乱疾病, 表现为发育和神经系统功能障碍, 目前还没有有效的治疗手段。该工作第一次揭示在这些病人和小鼠模型的细胞中有大量胆固醇堆积, 且该现象的出现大大早于神经症状, 提示胆固醇堆积是过氧化物酶体紊乱疾病的发病原因之一。这项研究工作的意义在于: (1)发现了细胞内胆固醇运输的新途径; (2)揭示了过氧化物酶体这一细胞器的新功能; (3)证明胆固醇运输异常是导致过氧化物酶体紊乱疾病的病因之一, 为治疗该类疾病提供了全新的思路。<\/p>

细胞内胆固醇转运研究背景<\/strong>
胆固醇是真核细胞必不可少的脂质小分子, 其基本功能是掺入到膜的磷脂双分子层中, 调节膜的流动性与相变。另外, 胆固醇在其他许多生物学过程中也发挥重要作用, 如: 合成胆汁酸及甾体激素、影响神经突触形成、参与许多重要的信号传导途径等。
细胞内胆固醇含量非常丰富, 最高可达细胞总脂质的30%~40%, 它在细胞内被动态运输至各细胞器并呈现不均匀分布。内质网是胆固醇的合成场所, 但其胆固醇含量仅占细胞总胆固醇的0.5%~1%[1]; 高尔基体胆固醇含量较高, 而细胞膜是胆固醇含量最丰富的区域, 高达60%~80%[2]。胆固醇在不同细胞器中也执行不同的功能: 在内质网中, 甾醇通过抑制SREBP(sterol regulatory element binding protein)的转运及促进HMGCR(HMG-CoA reductase)的降解来调控胆固醇的从头合成[3]; 游离胆固醇在内质网中被酯化后以脂滴的形式储存或形成可分泌的脂蛋白[4-5]; 在线粒体和过氧化物酶体中, 胆固醇经过不同的氧化方式生成甾体激素和胆汁酸[6]。因此, 胞内胆固醇通过动态运输到达目的区域是细胞行使正常功能的关键。
低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)介导低密度脂蛋白(LDL)的吸收是大多数细胞的主要胆固醇来源[7]。LDL结合质膜上的LDLR后内吞进入早期内吞体, 通过一系列的膜泡运输最终到达溶酶体, 在这里LDL中的胆固醇酯被酸性酯酶水解成为游离胆固醇。游离胆固醇再被运送到细胞膜和其他细胞器供细胞利用[8]。目前为止, 大部分关于胆固醇离开溶酶体到达其他细胞器的机制来自于对遗传性溶酶体堆积型Niemann-Pick type C(NPC)疾病的研究。该疾病的致病原因是由于编码NPC1或NPC2的基因发生了突变, 这些突变会导致胆固醇在病人组织中大量堆积[9-10]。在细胞内, NPC1定位在晚期内吞体和溶酶体的膜上, 而可溶的NPC2蛋白则位于溶酶体腔中。当胆固醇酯在溶酶体中被水解后, NPC2首先结合胆固醇的烷基侧链部分, 暴露在外的3号位OH基和母核接着被NPC1的N端结构域识别并结合, 在NPC1的帮助下胆固醇穿过糖萼并被运送到溶酶体膜上。在NPC1和NPC2突变细胞中, 胆固醇不能被正常转运而堆积在溶酶体腔内[11]。然而, 这只解释了游离胆固醇如何到达溶酶体膜, 对于胆固醇怎样离开溶酶体膜并转运到其他细胞器的分子机制仍然所知甚少。胆固醇运输研究的难点在于胆固醇难以进行标记和追踪, 虽然也有一些荧光标记的胆固醇, 但都不能模拟真正的胆固醇行为。<\/p>

全基因组RNAi筛选胆固醇转运缺陷(cholesterol trafficking defective, CTD)细胞<\/strong>
两性霉素B是一种多烯抗真菌药物, 能够和细胞膜上的胆固醇结合, 改变细胞通透性使内容物外泄, 造成细胞死亡[12]。基于此特性, 我们利用针对人全基因组的慢病毒shRNA文库, 设计了一种高效的可以特异性富集胞内胆固醇运输缺陷细胞的筛选策略, 原理和过程如图1所示。首先, 将稳定表达shRNA的突变细胞库培养在含有洛伐他汀、LDL和U18666A的培养液中。因为洛伐他汀抑制细胞自身胆固醇的合成, 故细胞所需胆固醇只能依靠对LDL来源胆固醇的吸收, 由于U18666A这种能特异性抑制胆固醇转运药物的存在[13], 使得溶酶体中聚集了大量的胆固醇; 然后, 利用环化糊精能够吸附胆固醇的特性短时间处理细胞, 只除去细胞膜上的胆固醇[14-15]; 再将细胞培养在不含U18666A的培基中, 聚集在溶酶体的胆固醇会逐渐转运到质膜或其他细胞器上; 最后, 两性霉素B的使用会杀死高质膜胆固醇的细胞。而CTD细胞与正常细胞相比, 其转运速率及质膜胆固醇水平都低, 因此, CTD细胞能够存活下来[16]。
以抗两性霉素B的CTD细胞基因组DNA为模板, PCR扩增shRNA特异的插入序列, 并利用Illumina Genome Analyzer II测序仪对纯化后的PCR产物进行高通量测序。将所得数据进行显著性分析, 我们共计获得341个候选基因, 其中每个基因都由2个以上独立的shRNA序列筛选获得, 排除了shRNA的脱靶效应。Gene Ontology富集和KEGG通路分析候选基因, 发现脂质代谢相关和参与细胞内转运的基因被显著富集。此外, 胆固醇转运的关键基因如NPC1、调节LDLR合成及内吞的基因(如: SREBP2、SCAP[17]、LDLR[7]和AAK1[18])也出现在候选名单中, 更证实了此筛选方法的高效、可靠。<\/p>


A: 筛选策略; B: U18666A结构; C: 羟丙基-β-环化糊精(HPCD)结构; D: 两性霉素B结构。
A: screen strategy; B: the structure of U18666A; C: the structure of hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD); D: the structure of Amphotericin B (AmB).
图1 筛选胆固醇转运缺陷(CTD)细胞(根据参考文献[16]修改)
Fig.1 Schematic representation of the screen strategy for isolating CTD cells (modified from reference [16])<\/p>

过氧化物酶体在胆固醇转运过程中发挥重要功能<\/strong>
有意思的是, 过氧化物酶体相关的基因在统计学上也被显著富集。我们发现, 沉默ABCD1(ATPbinding cassette sub-family D member 1)、BAAT(bile acid CoA:amino acid N-acyltransferase)、ACOT8(acyl-CoA thioesterase 8)、PEX1(peroxisomal biogenesis factor 1)、PEX3、PEX6或PEX10基因的表达都会导致细胞内胆固醇转运的缺陷, 并且这些胆固醇堆积在溶酶体而非过氧化物酶体中。
为了回答过氧化物酶体蛋白功能障碍反而会导致胆固醇堆积在溶酶体中这一问题, 我们选择ABCD1基因做进一步研究, 因为它编码一个过氧化物酶体膜蛋白, 同时又是过氧化物酶体基因类别中被最显著富集的。免疫荧光结果显示, 溶酶体–过氧化物酶体约有20%的接触, 我们将这种新发现的溶酶体–过氧化物酶体膜接触命名为LPMC(lysosomeperoxisome membrane contacts)。这个结果是真实存在的还是由于ABCD1偶然分布到溶酶体造成的呢？由于之前国内外研究从未报道过此类接触, 为了进一步验证溶酶体和过氧化物酶体的关系, 我们进行了超高分辨率显微成像(SR-SIM)、PerkinElmer UltraVIEWVoX三维系统成像、透射电子显微成像、活体细胞延时成像、细胞器免疫共沉淀实验和体外重构等实验。以上结果均证实了LPMC的存在。此外, 我们还发现, 干扰NPC1或ABCD1的表达, 该接触会显著降低, 且LPMC依赖于细胞胆固醇水平, LDL来源胆固醇能够增强这种动态接触。
为了进一步揭示溶酶体–过氧化物酶体的接触机制, 我们进行了多组蛋白质组学实验来分析溶酶体膜蛋白、过氧化物酶体蛋白、与NPC1相互作用蛋白中可能介导接触的蛋白质, 并从合并后的蛋白列表中选择参与囊泡融合及细胞器动态运输的因子作为候选蛋白。其中, 突触结合蛋白VII (Syt7)引起了我们的兴趣: 作为溶酶体的膜蛋白, Syt7的基因沉默不仅会导致溶酶体内胆固醇的堆积, 而且过氧化物酶体与溶酶体间的接触也明显降低; 体外结合实验也证明Syt7对溶酶体–过氧化物酶体的接触至关重要。这些发现表明, Syt7是LPMC形成所需的溶酶体蛋白。
因此, 下一步工作的重心就转移到寻找过氧化物酶体上与Syt7结合的因子上。我们首先便想到了SNARE蛋白, 因为它们在膜接触和融合过程中起核心作用。然而, 到目前为止, 尚未发现过氧化物酶上存在SNARE蛋白[19], 这也与我们的蛋白质组结果一致。当研究陷入困境时, 我们发现有文献报道Syt7除了结合SNARE外, 与磷脂也有相互作用[20]。所以我们推测, Syt7可能通过与磷脂的相互作用介导LPMC。为了验证这一观点, 我们重组表达了Syt7-C2AB蛋白, 进行了它与多种不同磷脂结合的PIP-strip筛选实验以及脂质体漂浮实验, 发现Syt7-C2AB与PI(4,5)P2磷脂有显著的相互作用。进一步的rapamycin招募系统和体外结合实验也表明, PI(4,5)P2就是我们要找的过氧化物酶体膜上帮助LPMC形成所需的因子。
但溶酶体与过氧化物酶体之间的接触, 是否影响细胞内的胆固醇转运？为了回答这一问题, 我们在体外模拟细胞质环境, 检测溶酶体中的3H-胆固醇是否能够向过氧化物酶体转运。经过不同孵育时间, 我们发现, 过氧化物酶体从溶酶体中得到了3H-胆固醇; 在LPMC形成被阻断时, 这一转运便不能发生。结果证实了LPMC的形成具有促进胆固醇从溶酶体向过氧化物酶体转运的功能(图2)。
结合其他研究结果, 我们绘制了胆固醇从溶酶体转运到过氧化物酶体的模式图(图2)。即: LDL被内吞途径运送至溶酶体中, 由酸性酯酶水解为游离胆固醇。在溶酶体腔里, NPC2首先结合胆固醇的烷基侧链端, 暴露在外的OH基和母核接着被NPC1蛋白的N端结构域识别并结合, 胆固醇在NPC1的帮助下穿过糖萼并到达溶酶体的膜上。随后, 溶酶体上的Syt7结合过氧化物酶体膜上的PI(4,5)P2形成紧密的LPMC, 从而实现胆固醇向过氧化物酶体的转移。<\/p>


图2 LDL来源胆固醇转运出溶酶体的分子机制(根据参考文献[16]修改)
Fig.2 A working mechanism of LDL-derived cholesterol transport out of lysosome (modified from reference [16])<\/p>

过氧化物酶体紊乱疾病与胆固醇堆积<\/strong>
过氧化物酶体功能缺失会导致一大类相关疾病—过氧化物酶体紊乱疾病, 表现为发育和神经系统功能障碍, 目前没有有效的治疗手段[21-22]。我们的研究工作第一次揭示在这些病人细胞、斑马鱼和小鼠模型中有大量胆固醇堆积, 且该现象的出现远早于神经症状, 提示胆固醇堆积是过氧化物酶体紊乱疾病的发病原因之一。这项研究工作的意义在于: (1)发现了细胞内胆固醇运输的新途径; (2)揭示了过氧化物酶体这一细胞器的新功能; (3)揭示了胆固醇运输异常是导致过氧化物酶体紊乱疾病的病因之一, 为治疗该类疾病提供了全新的思路。<\/p>

未来研究方向<\/strong>
细胞内胆固醇运输的机制是长期困扰该领域的一大难题, 我们发现过氧化物酶体通过和溶酶体形成膜接触而实现胆固醇的转运, 解释了胆固醇如何离开溶酶体膜这一关键步骤。但仍有许多问题有待解决, 如: 胆固醇到达过氧化物酶体后, 如何转运到其他细胞器？ LPMC的形成有哪些调控机制？LPMC形成后, 胆固醇是如何转移过去的？如何利用发现的机制诊断和治疗过氧化物酶体紊乱疾病？将来针对这些问题的探索, 将有助于深入了解细胞内胆固醇转运的机制, 开辟胆固醇代谢研究的新方向。<\/p>

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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-14-26-256.jpg","cshort":"

宋保亮, 武汉大学生命科学学院教授、院长。2002年毕业于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 2002年至2006年在美国西南医学中心从事博士后研究。长期从事胆固醇代谢研究, 取得了国际同行公认的成果。胆固醇合成途径的一个关键负反馈调控通路以及小肠胆固醇吸收的分子机制均主要由宋保亮实验室揭示; 另外, 该实验室2015年发表于《Cell》的工作开辟了细胞内胆固醇运输这一新的研究方向。他的系统性工作推动了胆固醇研究领域的发展。<\/span><\/p>","cshort2":"

宋保亮, 武汉大学生命科学学院教授、院长。2002年毕业于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 2002年至2006年在美国西南医学中心从事博士后研究。长期从事胆固醇代谢研究, 取得了国际同行公认的成果。胆固醇合成途径的一个关键负反馈调控通路以及小肠胆固醇吸收的分子机制均主要由宋保亮实验室揭示; 另外, 该实验室2015年发表于《Cell》的工作开辟了细胞内胆固醇运输这一新的研究方向。他的系统性工作推动了胆固醇研究领域的发展。已在国际学术期刊上发表研究论文30余篇, 其中作为通讯作者发表《Cell》1篇、《Nat Med》1篇、《Cell Metab》4篇和《Proc Natl Acad Sci USA》1篇。曾获得首届陈嘉庚青年科学奖和中国青年科技奖等奖项, 并担任J Biol Chem杂志的Editorial Board Member、J Mol Cell Biol副主编、国际脂质协会(ICBL)筹划委员。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"溶酶体与过氧化物酶体形成膜接触介导胆固醇转运","listseq":30,"seqno":"30","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-10-48-22-520"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 系统生物学重点实验室, 上海 200031)","cauthor":"李福明 韩向琨 李 飞 季红斌*","cintpic":"","clicktime":23,"clong1":"

肺癌是全球范围内具有较高发病率和致死率 的原发性恶性肿瘤之一, 患者的5年存活率大约为 15%。根据病理学分类, 肺癌大致可分为小细胞肺 癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌约占肺癌的85%, 具有显著的遗传多样性和病理组织异质性, 又包括 腺癌(adenocarcinoma, ADC)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)、腺鳞癌(adeno-squamous cell carcinoma)和大细胞癌[1]。不同的非小细胞亚型如 肺腺癌和肺鳞癌具有不同的发病过程和病理学特 征, 而且对某些药物或治疗手段也有着不同的响应 效果[2-3]。<\/p>

基于大规模的临床样本分析和基因组学研究, 目前已经发现多个参与非小细胞肺癌发病的驱动基 因(driver gene)突变, 包括KRAS(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 或EGFR(epidermal growth factor receptor)的功能激活型突变, 以及TP53(tumor protein 53)或LKB1(liver kinase B1)的功能失活型突 变等[4-5]。这些突变有的已经作为药物靶点被成功地 用于分子靶向治疗(molecular targeted therapy)。例如, 携带EGFR突变的肺癌患者可以使用针对EGFR的小 分子药物(如Gefitinib或Erlotinib)或单克隆抗体药物 (如Cetuximab)进行靶向治疗。然而, 超过20%的非 小细胞肺癌患者携带LKB1的功能失活型突变, 且目 前对这类患者尚无针对性的治疗策略[3]。

经基因工程改造的肺癌小鼠模型, 如KrasG12D (KRAS)、KrasG12D;Trp53lox/lox(KP)和KrasG12D;Lkb1lox/lox (KL)模型等, 不仅能模拟人类肺癌的起始、恶性进 展以及转移等阶段, 还可用于临床前试验(preclinical trials)以评估某些药物或治疗策略的有效性和安全 性[6-7]。研究人员在前期工作中比较了KRAS、KP 和KL小鼠模型, 发现化疗药物Docetaxel和靶向MEK的小分子抑制剂Selumetinib(AZD6244)联合用药对 KRAS和KP肺癌有一定的治疗效果, 对KL肺癌却无 疗效[8]。目前普遍认为, LKB1可作为鉴定和/或影响 非小细胞肺癌细胞响应药物作用的分子标志物, 但 其作用机制尚不清楚。<\/p>

LKB1是经典的抑癌基因。作为丝氨酸/苏氨 酸激酶, LKB1通过磷酸化激活包括AMPK(AMPactivated protein kinase)在内的多个底物并抑制 mTOR(mechanistic target of rapamycin)等调控细胞 增殖或存活的信号通路, 而失活LKB1导致mTOR信 号通路持续激活并促进细胞增殖或存活[9]。同时, LKB1在细胞的能量感应和代谢稳态的维持方面发 挥重要调节作用。例如, 处于静息期的造血干细胞 一旦缺失LKB1就会快速进入细胞周期并伴随线粒 体功能障碍和细胞能量代谢异常[10-12]。体外研究表 明, 当细胞面对代谢应激(metabolic stress), 如营养匮 乏或胞外基质减少时, 会激活AMPK并通过调控还 原力NADPH的稳态来维持细胞存活; 缺失LKB1的 细胞由于不能及时激活AMPK, 会对这些应激条件 更为敏感并发生凋亡[13]。由此可见, 失活LKB1一方 面加速细胞增殖, 另一方面又使细胞缺乏对代谢应 激的适应能力。这种“双刃剑”功能带来一个科学问 题: 缺失LKB1的肺癌细胞如何在体内协调肿瘤进程 和代谢应激这一矛盾？<\/span>

我们发现, 在KL小鼠模型中敲除LKB1不仅显 著地加速肺腺癌的发生和进展, 还特异地导致了肿 瘤异质性, 即肺腺癌、肺鳞癌和肺腺鳞癌的出现, 而 KRAS和KP小鼠模型只产生肺腺癌[6]。此外, 过表达 激活型KRAS并下调LKB1的人支气管上皮细胞接种 至裸鼠皮下也会导致肺癌异质性[14]。我们近期的研 究表明, KL小鼠的这种肺癌异质性源于LKB1失活引起的肿瘤可塑性(tumor plasticity), 即肺腺癌经由 腺鳞癌转分化为肺鳞癌[15-16]。我们把这种转变过程 叫做腺鳞癌转分化(adenocarcinoma to squamous cell carcinoma transdifferentiation, AST)。基于上述发现, 我们推测, AST可能是LKB1失活的肺腺癌在恶性进 展过程中适应代谢应激(metabolic adaptation)而发生 的重要事件。<\/span>

在本研究中, 我们利用cDNA microarray比较了 KL小鼠肺腺癌和肺鳞癌的基因表达谱, 并对该数据 进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA), 发现KL肺鳞癌显著富集参与谷胱甘肽 (glutathione, GSH)代谢的基因集。GSH可以有效地 清除细胞内过多的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS), 而细胞缺乏GSH会累积ROS并导致氧化应激 (oxidative stress)[17]。我们通过定量PCR(Q-PCR)和 免疫组织化学染色(immunohistochemical staining, IHC)比较了GSH合成(Gclm、Gsta4、Gstya1和Gsto1 等)或抗氧化相关特征基因(Nrf2和Nqo1等)在KL肺 腺癌和肺鳞癌中的差异, 发现它们在肺鳞癌中具有 更高的水平, 而肺腺癌却含有更多的DNA氧化性修 饰产物8-oxo-dGuo。采用液相层析串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LCMS)分 析, 我们进一步发现, KL肺鳞癌含有更多的GSH和 ATP, 而KL肺腺癌具有更高的葡萄糖含量和更低的 乳酸含量。这些结果暗示, KL肺腺癌和肺鳞癌具有 不同的氧化还原水平和代谢水平。由于Trp53缺失 会加速KRAS肺腺癌的进展却不会导致其转分化为 肺鳞癌, 我们就ROS相关特征基因对KP肺腺癌和KL 肺腺癌进行比较, 结果发现, KP肺腺癌富集了GSH 代谢的基因集, 且KP肺腺癌不仅具有更低的ROS水 平, 还表达更高水平的NRF2(nuclear factor, erythroid derived 2, like 2) 和NQO1[NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1]。这表明, ROS相对特异地在KL肺腺癌中 出现异常积累。<\/span>

我们对含有162例人肺腺癌样本的组织芯片 (tissue microarray, TMA)进行免疫组化统计分析, 发 现LKB1的表达水平跟ROS水平呈显著负相关, 约 40%(65/162)的样本不表达LKB1, 同时表现出较高 的ROS水平。在这65例肺腺癌样本中, 我们还发现 有8例样本表达肺鳞癌的特征基因(p63、K5和K14); 同时, 携带LKB1突变的6例人肺腺癌样本中有2例也 表达肺鳞癌特征基因。通过免疫组化, 进一步发现人肺腺鳞癌样本呈现不同的ROS水平和LKB1表达 水平, 且二者在腺鳞癌的腺癌部分具有负相关性, 而 在鳞癌部分却无相关性。此外, 19例样本中有6例不 表达LKB1, 且5例样本的腺癌部分跟鳞癌部分相比 具有更高的ROS水平和更低的NQO1表达水平; 其 中2例样本的腺癌细胞同时表达腺癌特征基因TTF1 和鳞癌特征基因p63, 而鳞癌细胞亦同时表达p63和 TTF1。最后, 我们对154例肺鳞癌样本进行免疫组 化统计分析, 发现约97.4%的样本只表达p63, 37.6% 样本不表达LKB1, 其中有4例样本同时表达p63和 TTF1。基于这些临床样本分析的结果并结合KL小 鼠模型中的发现, 我们推测LKB1缺失引起的肿瘤可 塑性(AST)可能跟ROS积累相关。<\/span>

接下来, 我们通过两个实验探讨了ROS对于 AST的影响。首先, 我们采用抗氧化剂N-乙酰半胱 氨酸(N-acetylcycteine, NAC)对KL小鼠进行处理并观 察其对AST的影响。结果显示, NAC处理显著地降 低了肺鳞癌的发生率(SCC incidence)和数目, 却增加 了肺腺癌的数目。其次, 我们利用慢病毒介导的基 因表达系统在KL小鼠肺上皮细胞中过表达抗氧化转 录因子NRF2。结果发现, 过表达NRF2不仅降低了 KL肿瘤中的ROS水平、肺鳞癌的发生率以及数目, 还增加了肺腺癌的数目。上述结果表明, 降低KL小 鼠肺腺癌中的ROS水平可以抑制其转分化为鳞癌。<\/span>

实体肿瘤恶性进展中肿瘤微环境的改变, 包 括营养匮乏或细胞外基质减少等会引起代谢应 激和ROS积累。戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway, PPP)负责产生细胞内大约60%的NADPH, 后者用于去除ROS来维持氧化还原态的平衡。PPP 还负责生成核糖-5-磷酸, 为细胞分裂和合成代谢中 的核苷酸合成提供原料[18]。基于GSEA结果, 我们发 现KL肺鳞癌富集与嘌呤代谢和嘧啶代谢相关的基 因集。此外, PPP的关键限速酶在KL鳞癌中具有更 高的mRNA水平和蛋白水平。其中, 葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)作 为PPP的第一个限速酶, 在KL肺鳞癌中具有更高的 酶活性和蛋白水平。上述结果暗示, PPP下调可能是 导致KL肺腺癌异常积累ROS的一个原因。于是, 我 们通过改变KL肿瘤中G6PD的表达水平来研究PPP 是否影响AST。一方面, 过表达G6P显著地降低肺腺 癌的ROS水平、肺鳞癌的发生率和数目, 增加肺腺 癌的数目; 另一方面, G6pd基因的沉默虽然会增加肺腺癌的ROS水平并降低其数目, 却增加了肺鳞癌 的数目和发生率。综合以上实验结果, 我们认为PPP 确实可以影响AST。<\/span>

细胞内氧化还原态的维持依赖于ROS生成和清 除通路之间的动态平衡。上述结果表明, PPP失调促 进ROS生成, 但我们不确定清除ROS的通路是否也 出现异常从而导致ROS的进一步异常累积。AMPK 作为LKB1下游底物, 是已知的并被广泛研究的细 胞能量感应器, 在细胞能量稳态维持过程中具有不 可或缺的作用[19]。基于AMPK磷酸化(pAMPK)水 平的检测结果, 我们发现KL肿瘤中AMPK处于失活 状态, 这就使得AMPK不能发挥能量感应器的功能。 由此我们推测, 在KL肿瘤中重新激活AMPK可能会 缓解ROS的异常累积并抑制AST。我们利用慢病毒 系统在KL肿瘤中表达组成型激活的AMPK突变体 caAMPK(constitutively active AMPK), 结果显示, 无 论是肺鳞癌的发生率还是平均数目都发生明显的下 降, 而肺腺癌的数目则无显著变化。<\/span>


当PPP被抑制时, 细胞可以动用受AMPK-ACC 信号激活的脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO) 通路来产生包括NADH在内的还原力以维持氧化 还原态[13]。我们发现, KL肿瘤中的AMPK-ACC 信号通路处于失活状态, 而表达caAMPK可以激 活AMPK-ACC通路; 与肺鳞癌相比, KL肺腺癌具 有更低的FAO限速酶酶活性, 包括Cpt1(carnitine palmitoytransfearase 1)和ACS(acyl-coenzyme A synthase)等。此外, KL肺腺癌中FAO特征基因的 mRNA水平和蛋白水平比KL肺鳞癌低, 而且KL肺 腺癌含有更多的脂滴。这些证据表明, KL肺腺癌 和肺鳞癌的FAO通路具有不同的活性水平, 并暗 示AMPK-ACC信号失活可能导致FAO受影响后不 能清除ROS, 从而导致ROS的进一步累积并最终 促进AST的发生。由于过表达CPTA可以增强FAO 活性并降低ROS水平, 我们在KL小鼠模型中表达 CPT1A(carnitine palmitoyltransferase 1a), 发现其与 caAMPK一样可以降低肺鳞癌的数目和发生率, 并 增加肺腺癌的数目。结合PPP失调的数据, 上述实验 结果揭示了KL肺腺癌异常累积ROS的原因: 一方面, 肿瘤的恶性进展会伴随PPP的失调, 从而导致ROS的 过度生成; 另一方面, LKB1失活会导致下游AMPKACC 信号轴失活无法发挥功能, 从而使得FAO通路 不能被激活, 故而不能有效清除ROS, 这两方面的失调最终导致ROS的进一步累积最终促成了氧化还原 态的失衡(redox imbalance)。<\/span>

利用临床样本, 我们比较性地分析了肺腺癌中 LKB1表达水平、AMPK磷酸化水平和ACC磷酸化 水平。统计结果显示, 三者中两两相比均具有显著 的正相关性。其次, 无论是在8例不表达LKB1的肺 腺癌样本中, 还是在2例携带LKB1突变的腺癌样本 中, 我们都没有检测到pAMPK和pACC水平。这些 结果支持LKB1失活引起AMPK-ACC信号轴失活的 结论。有趣的是, 在这2例携带LKB1突变的样本中, p63阳性的细胞与邻近TTF1阳性的细胞相比, 具有 更高的G6PD和CPT1A蛋白水平。同样, 在4例不表 达LKB1的肺腺鳞癌样本中, 尽管腺癌部分和鳞癌部 分都不表达pAMPK和pACC, 鳞癌部分的细胞却表 达更高的G6PD和CPT1A蛋白水平。这些现象跟KL 小鼠的结果一致, 表明PPP和FAO的差异很可能与氧 化还原态的异质性相关。<\/span>

由于ROS诱导剂可用于抗肿瘤治疗[20], 且KL 肿瘤呈现异常的氧化还原态, 我们利用ROS诱导剂 荜茇酰胺(Piperlonguine)在KL小鼠模型上进行临床 前试验以评价其疗效。组织学统计分析结果表明, Piperlonguine可以有效地降低肺腺癌的数目, 但肺鳞 癌的数目和发生率都明显上升。进一步分析发现, Piperlonguine会抑制腺癌细胞增殖, 并促进其凋亡, 而鳞癌细胞却并无明显的变化。有趣的是, 我们在 Piperlonguine处理组中发现一些腺癌会同时表达鳞 癌的标记物p63和腺癌的标记物TTF1, 提示这些肿 瘤可能代表了转分化的中间态肿瘤。<\/span>

近期研究发现, 抗糖尿病药物Phenformin对 KL肺腺癌具有一定的疗效, Phenformin单一用药 虽可导致KL肺腺癌消退, 却使其最终获得了耐药 性[21]。我们推测, Phenformin处理可能导致AST, 于是用Phenformin对KL小鼠进行处理以验证此假 说。研究结果显示, 与KL肺鳞癌相比, KL肺腺癌对 Phenformin更加敏感; Phenformin处理虽然加剧肺腺 癌细胞的凋亡并导致肺腺癌数目的下降, 却显著地 增加了肺鳞癌的数目和发生率。<\/span>

因此, 靶向肿瘤代谢的临床前药物包括 Piperlonguine和Phenformin虽然能够有效地抑制KL 肺腺癌的恶性进展, 却会促使一部分KL肺腺癌转分 化为肺鳞癌, 而后者对该Piperlonguine或Phenformin 并不敏感, 因此肿瘤呈现出耐药性。<\/span><\/p>


图1 LKB1在非小细胞肺癌恶性进展中的“双刃剑”功能(根据参考文献[22-24]修改)
Fig.1 “Double-edged sword” function of LKB1 in non-small cell lung cancer progression (modified from references [22-24])

图2 KL肺腺癌通过转分化为肺鳞癌从而产生对Piperlongumine和Phenformin的耐药性
Fig.2 KL lung adenocarcinoma acquires drug resistance to Piperlongumine and Phenformin treatments through
squamous transdifferentiation<\/p>

综合以上研究结果和我们前期的工作[22-24], 我 们提出LKB1在非小细胞肺癌恶性进展过程中的“双 刃剑”功能模型。在肺腺癌发生发展的早期阶段, LKB1作为抑癌基因, 其缺失会激活mTOR-HIF1a- LOX以及SIK2-CRTC1-NEDD9信号轴, 从而促进肺 腺癌的恶性进展; 而在肺腺癌恶性进展的后期阶段, LKB1作为氧化还原/代谢稳态的调控因子, 其缺失 会使AMPK-ACC信号轴以及下游FAO通路无法激 活, 从而导致细胞无法有效地清除因PPP通路失调 引起的ROS累积并最终导致氧化还原态的失衡。在 这种应激条件下, KL肺腺癌最终发生肺腺鳞癌转分 化(图1)。此外, 值得关注的是, 尽管一些靶向细胞 代谢的临床前药物如Piperlongumine和Phenformin能 通过ROS的异常积累来促进细胞凋亡和KL肺腺癌 的消退, 却会带来的一个不好的结果, 即促使一部分 KL肺腺癌通过转分化为肺鳞癌从而获得耐药性(图 2)。这提示, 临床上LKB1失活的肺腺癌有可能通过 转分化为肺鳞癌来逃脱某些靶向肿瘤代谢的药物治疗。当然, 这只是一个假说, 还需要大量后续临床数 据的证明。终上所述, 该研究不仅为认识人类肺癌 的发病机理提供了新的视角和思路, 而且有可能对 肺癌的临床治疗提供一定的指导。<\/p>

参考文献 (References)<\/strong><\/p>

1 Seena A, Philip AA, Hisao A, Marie CA, Banks PM, Marttia B et al. World Health Organization Classification of Tumours: Pathology and Genetics of Tumors of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. International Agency for Cancer Research (IARC) Press 2004.<\/p>

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季红斌, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员。 1995年毕业于吉林大学生物化学系, 2000年获中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所博士学位, 2000~2007年在美国哈佛医学院从事博士后工作, 2007年晋升为讲师。2007年加入生物化学与细胞生物学研究所; 2013年获上海市科技进步二等奖(第二完成人)。<\/span><\/p>","cshort2":"

季红斌, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员。 1995年毕业于吉林大学生物化学系, 2000年获中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所博士学位, 2000~2007年在美国哈佛医学院从事博士后工作, 2007年晋升为讲师。2007年加入生物化学与细胞 生物学研究所; 2013年获上海市科技进步二等奖(第二 完成人); 长期从事肺癌发病分子机理研究, 在肺癌关键致病基因的鉴定及其功能和机理研究方面取得一系列原创性的科研成果。他的课题组发现, LKB1功能性缺失突变在人非小细胞肺癌中普遍高发, 并揭示其在肺癌转移中的重要作用及分子机制; 利用动物模型证实肺腺癌向肺鳞癌的转分化, 为后续肺腺鳞癌转分化的机制研究奠定了基础; 发现新的肺癌驱动基因RET融合, 为临床肺癌“个体化”分子靶向治疗提供理论指导。近五年来发表研究论文58 篇, 其中作为通讯或共同通讯作者在Cancer Cell、Nat Commun、Proc Natl Acad Sci USA、J Clin Oncol、Cell Res<\/em>等期刊发表研究论文共29篇, 专业综述3篇; 申请发明专利3项, 获授权1项。<\/span><\/p>","ctitle":"LKB1在非小细胞肺癌可塑性及耐药反应中的重要作用及机制","listseq":31,"seqno":"29","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-21-47-420"},{"caddress1":"(中国科学院生物物理研究所, 生物大分子国家重点实验室, 北京 100101)","cauthor":"张维绮 刘光慧*","cintpic":"","clicktime":5,"clong1":"

1 研究人类衰老的新思路<\/strong>
最近, 衰老的九大分子特征被归纳为: 基因组 的不稳定性、端粒的损耗、表观遗传学的改变、蛋 白质稳态的失衡、营养感受失调、线粒体异常、细 胞衰老、干细胞耗竭和细胞间通讯改变[1]。这些因 素相互交织影响着衰老进程。人类的衰老漫长而复 杂, 目前尚无有效的研究手段。另一方面, 由于种 属差异, 实验室中基于模式生物的研究尚不能直接 用于临床转化。刘光慧课题组率先提出利用多能 干细胞技术研究和治疗人类衰老相关疾病的新思 路。实验室相继建立儿童早衰症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome, HGPS)、帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、镰刀形细胞贫血症、范可尼贫血 症(Fanconi Anemia, FA)和成年早衰症(Werner syndrome, WS)等一系列人类干细胞疾病模型; 在基 因组靶向矫正方面, 率先突破了人类致病基因靶向 矫正的技术瓶颈, 迄今已在不同种疾病干细胞中修 复6种致病基因突变, 并首次证明了HDAdV(helperdependent adenovirus vector) 和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)基因靶向矫正工具 的安全性, 同时发展出高效安全的基因矫正载体 telHDAdV。

2 基于多能干细胞技术的人类衰老相关 疾病模型和药物筛选系统

2.1 利用诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技术揭示儿童早衰症患者发生 血管病变的分子机理
<\/strong>儿童早衰症是一种非常罕见的人类早老性 疾病, 由Lamin A基因在G608位点发生单点突变所 致。该突变导致其剪切突变体progerin在细胞核内 发生异常聚集, 引起衰老相关的细胞改变。该疾病 表现出许多正常衰老所伴随的组织和细胞学特征。 HGPS病人几乎毫无例外地于十余岁死于血管动脉 粥样硬化, 这种动脉粥样硬化的病理特征同生理性 衰老相关的动脉粥样硬化非常类似[2]。针对HGPS 发病机制的深入研究无疑会对人类衰老所伴随的血 管病变的研究提供重要的线索。然而, 生物学家们 无法利用如此罕见的人体样品(如血管细胞)进行人 类衰老机制的研究。
2011年, 刘光慧等[3]成功将HGPS病人的皮肤成 纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(HGPS-iPSCs)。
令人兴奋的是, 重编程有效地将细胞衰老的时钟拨 回至发育的原点, 重设了HGPS体细胞中缺陷的核膜 结构、表观遗传参数和基因表达谱。HGPS-iPSCs 在形态和功能上与野生型iPSC并无显著差别, 其主 要原因是在HGPS-iPSCs中Lamin A基因发生转录 沉默。将HGPS-iPSCs定向诱导分化为血管平滑肌 细胞(简称为HGPS-VSMC)后, Lamin A得到重新激 活, 继而重新产生其突变产物progerin。更为重要的 是, HGPS-VSMC随着体外培养出现加速老化的特 征, 因此揭示了HGPS病人过早发生动脉粥样硬化 的细胞学基础, 即血管平滑肌细胞加速老化。此外, 利用MudPIT(multidimensional protein identification technology)蛋白组学技术鉴定出DNA修复相关蛋 白激酶DNAPKcs是progerin的新型结合蛋白, 并发 现DNAPKcs的表达同progerin的含量呈负相关。与 HGPS-VSMC类似, 在野生型VSMC中敲低DNAPKcs 也能诱导细胞发生早衰性状, 同时DNAPKcs在正常 衰老组织中其表达量也出现下调[3]。这些研究不仅 明确了血管衰老是动脉粥样硬化的重要诱因, 更重 要的是, 为血管衰老和动脉粥样硬化的防治提供了 重要的药物筛选和评价体系。

2.2 利用多能干细胞技术揭示帕金森病(PD)患者 的神经干细胞病理并探索其新型干预方式<\/strong>
PD是一类与衰老密切相关的人类神经系统退 行性疾病。即使对于家族遗传性PD而言, 其发病也 是进入中老年之后才出现。该疾病不仅表现为运动 神经系统的受损, 还表现出抑郁、嗅觉丧失、认知 功能下降等非运动神经系统表型。由于小鼠和人在 衰老和神经生物学方面具有较大的差异, 因此, 目前 的小鼠模型尚不能很好地重现人类PD的疾病表型。 建立PD的人类疾病模型、探索衰老因素在疾病发 生发展中的作用、寻找干预PD的分子靶标将极大 地促进帕金森病的早期诊断、预防与治疗。
刘光慧团队[4]2012年的研究发现, 携带LRRK2 (G2019S)基因突变的PD患者iPSC或胚胎干细胞 (embryonic stem cell, ESC)所衍生的神经干细胞在 体外培养过程中会出现B型Lamin蛋白在核膜局部 缺失以及细胞干性渐进性消失的现象。MudPIT蛋 白质组学分析发现, 突变的LRRK2能同B型Lamin相 互作用, 并使得后者的磷酸化增强。Lamin B2在野 生型神经干细胞中的敲减可以重现PD神经干细胞 的表型。从PD病脑的组织学分析也可以发现海马神经干细胞富集区的异常细胞核膜表型。此工作为 PD患者认知功能衰退等非运动神经系统临床表征 提供了有效的解释。更为重要的是, 此工作首次利 用iPSC疾病模型揭示了LRRK2小分子抑制剂(IN-1) 对PD特定表型的“治疗”作用, 并提示通过靶向修复 PD患者神经前体细胞致病突变从而实现细胞移植 治疗的可能性。

2.3 阐明范可尼贫血症的新型干细胞病理<\/strong>
范可尼贫血症属于先天再生障碍性贫血, 是一 种严重的常染色体隐性遗传疾病, 由一系列DNA修 复蛋白的编码基因突变所致, 其临床表现为骨髓造 血功能衰竭、多发性先天畸形以及肿瘤易感性增 加。该疾病虽不表现出系统性机体衰老的特征, 但 基因组稳定性的降低可能是造成骨髓造血细胞过早 衰竭的原因。刘光慧团队[5]最早利用非基因组整合 技术实现了FA成纤维细胞的表观遗传重编程, 获得 了FA-iPSC。同时, 还突破了DNA同源重组效率低 下的技术障碍, 在FA-iPSC中成功实现了对致病基因 FANCA的靶向矫正。研究还揭示了FA患者发生严 重再生障碍性贫血的根源, 即不仅归因于造血干细 胞的过早衰竭, 还与骨髓造血微环境间充质干细胞 的加速衰老密切相关。此研究不仅在人类组织干细 胞水平揭示了FA的新型病因学基础, 而且为FA的干预和治疗提供了全新的研究平台和解决方案。实验 结果显示, 靶向矫正FANCA基因突变可以从根本上 逆转FA的病理表型。这样, 经遗传修复的造血干细 胞可能在将来被应用于自体移植, 以治疗FA患者的 骨髓衰竭和再障性贫血。更为重要的是, 此研究利 用人类疾病模型成功地筛选到可抑制FA干细胞加 速衰老或衰竭的新型小分子化合物。药理学实验显 示, 这些化合物具有抑制FA细胞表达炎性因子和促 凋亡因子的活性。

3 发现表观遗传改变是人类细胞衰老的<\/strong>
关键驱动力 成年早衰症是一种罕见的常染色体隐性遗传 病, 由WRN基因突变引起。WS患者自青春期开始便 提前启动衰老程序, 迅速呈现出许多衰老表型并伴 随有大多数老年性疾病(如骨质疏松和动脉粥样硬 化等)。因此, 针对成年早衰症机理的研究对于探索 人类自然衰老的机理及实现衰老相关疾病的干预有 着不寻常的指导意义。

刘光慧团队[6]首先提出“组织干细胞的加速衰 老可能是WS病因”这一科学假设, 并通过基因组靶 向编辑技术使得人类间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)中的WRN基因发生缺失突变, 在实验室创建了人类早衰症特异的MSC。通过对一系 列衰老相关参数的分析发现, 早衰症MSC不仅表现 出生长速度迟缓、DNA损伤反应加剧和分泌大量 炎性因子等细胞衰老的特征, 而且表现出内层核膜 蛋白以及核周异染色质的加速缺失。通过对组蛋 白修饰、DNA甲基化和基因表达谱进行全基因组 扫描, 发现早衰症干细胞的异染色质发生了显著的 结构退行(disorganization), 主要表现为端粒和着丝 粒附近H3K9me3“山脉(mountains)”的缺失。进一步 研究发现, WRN蛋白同内层核膜蛋白LAP2β、异染 色质蛋白SUV39H1和HP1α共存于一个蛋白复合物 中, 该复合物对于维持MSC核膜和异染色质的稳定 性以及阻止细胞衰老具有重要的作用。WRN的缺 失导致SUV39H1和HP1α水平的降低, 进而诱发MSC 的衰老。通过比较健康老年人和年轻人体内分离的 MSC, 也可见WRN水平的下调以及核膜和异染色质 结构的异常, 提示异染色质的退行也可能是正常干 细胞衰老的驱动力。最后, 研究发现, 过表达异染色 质蛋白HP1α能有效地抑制早衰症细胞的加速衰老, 因此, 为未来干预人类干细胞的衰老提供了可能的 分子靶标(图1)。

4 未来研究方向<\/strong>
机体、组织及细胞衰老是一个复杂的过程。对 人类细胞衰老表观遗传基础的发现暗示了衰老过程 具有可调控性。如何减缓机体及器官衰老进程, 并 在早期预防和治疗衰老相关疾病是目前和未来生物 医学研究领域中的热点之一。最近的研究发现, 将 年轻小鼠和年老小鼠的循环系统连接起来, 年老小 鼠骨骼肌和肝脏前体细胞得到明显改善, 大脑中的 海马体的新生细胞也显著增加[7]。此外, 将年轻小鼠 的血清注射给老年小鼠, 老年小鼠的大脑海马神经细胞就会发生同样的变化, 衰老小鼠心肌肥厚的症 状也有所缓解。虽然何种因子起关键作用还存在较 大的争议[8], 但是这些现象提示, 在年轻个体的血液 中存在着促进细胞新生的活性因子, 为后续延缓衰 老的研究提供了可能性。刘光慧团队综合利用干细 胞、模式生物、基因编辑、基因组范围筛选和多层 次组学(如基因组学、表观遗传学、蛋白质组学和 代谢组学)揭示衰老发生发展的关键信号调控网络, 发现和鉴定未知的延缓衰老进程的分子靶标, 致力 于推动衰老的基础和转化医学研究领域的发展。<\/p>


图1 WRN缺失导致细胞异染色体的异常(修改自参考文献[6])
Fig.1 Deficiencies of WRN leads to loss of heterochromatin in human mesenchymal stem cell (modified from reference [6])

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参考文献 (References)
<\/strong>1 Lopez-Otin C, Blasco MA, Partridge L, Serrano M, Kroemer G. The hallmarks of aging. Cell 2013; 153(6): 1194-217.

2 Kudlow BA, Kennedy BK, Monnat RJ Jr. Werner and Hutchinson-Gilford progeria syndromes: Mechanistic basis of human progeroid diseases. Nat Rev Mol Cell Biol 2007; 8(5): 394-404.

3 Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, et al. Recapitulation of premature ageing with iPSCs from Hutchinson- Gilford progeria syndrome. Nature 2011; 472(7342): 221-5.

4 Liu GH, Qu J, Suzuki K, Nivet E, Li M, Montserrat N, et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature 2012; 491(7425): 603-7.

5 Liu GH, Suzuki K, Li M, Qu J, Montserrat N, Tarantino C, et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nat Commun 2014; 5: 4330.

6 Zhang W, Li J, Suzuki K, Qu J, Wang P, Zhou J, et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science 2015; 348(6239): 1160-3.

7 Katsimpardi L, Litterman NK, Schein PA, Miller CM, Loffredo FS, Wojtkiewicz GR, et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science 2014; 344(6184): 630-4.

8 Brun CE, Rudnicki MA. GDF11 and the mythical fountain of youth. Cell Metab 2015; 22(1): 54-6.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-10-11-52-387.jpg","cshort":"

刘光慧, 中国科学院生物物理研究所研究员。2002年本科毕业于北京大学医学部; 2007年毕业于中国科学院生物物理研究所, 获得理学博士学位; 2007~2011年分别在美国斯科利普斯(Scripps)研究所和索尔克(Salk)生物学研 究所从事博士后研究;<\/span><\/p>","cshort2":"

刘光慧, 中国科学院生物物理研究所研究员。2002年本科毕业于北京大学医学部; 2007年毕业于中国科学院生物物理研究所, 获得理学博士学位; 2007~2011年分别在美国斯科利普斯(Scripps)研究所和索尔克(Salk)生物学研 究所从事博士后研究; 2011年回国, 在中国科学院生物物理研究所任研究员。 主要研究领域是基于多能干 细胞的人类疾病模型和精准治疗体系以及人类健康衰老(healthy aging)的分子 遗传学基础。迄今已在Nature、Science、Cell、Cell Stem Cell、Cell Metab<\/em>等刊物发表论文(包括研究论文或综述)65篇, 其中, 通讯(包括并列通讯)作者文 章45篇, 研究工作多次受到Nature、Science、Cell、<\/em>F1000等权威杂志的积极评价。申请发明专利(第一发明人)6项, 现已授权2项。多次应邀在国际学术会议上做大会报告。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"人类衰老的遗传和表观遗传信息解码","listseq":32,"seqno":"28","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-20-14-113"},{"caddress1":"(1清华大学生命科学学院, 清华大学–北京大学生命科学联合中心, 教育部生物信息学重点实验室, 北京 100084; 2清华大学生命科学学院, 生物医学测试中心, 北京 100084)","cauthor":"韩锦铂1＃<\/sup> 李二伟1＃<\/sup> 陈力群1<\/sup> 张元元1<\/sup> 魏方超1<\/sup> 刘洁媛2<\/sup> 邓海腾2<\/sup> 王一国1*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":5,"clong1":"

1 SREBP1与脂稳态<\/strong>
脂合成是脂肪酸合成以及甘油三酯形成的过 程[1], 脂合成的增强可以导致甘油三酯在肝脏中的 异常积累, 进而引起非酒精性脂肪肝和胰岛素耐 受[2-3]。固醇调控元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1, SREBP1)是调控脂合成 的重要转录调控因子, 它是一个以非活性前体形式 存在于内质网的跨膜蛋白[4-5]。在胰岛素信号通路 被激活后或者在响应低固醇水平信号时, SREBP1 以依赖于外壳蛋白复合物II(coat protein complex II, COPII)的方式从内质网被转运到高尔基体, 通过蛋 白酶剪切, 成熟后的SREBP1进入细胞核促进脂生 成有关基因的表达[6-8]。在肥胖、二型糖尿病以及 脂肪肝模型小鼠体内SREBP1的活性显著增强[9], 然 而这一现象的分子机制并不清楚。尽管最近的研究 表明, SREBP1的活性依赖于mTOR[10-13], 但具体的调 控机制仍不清楚。

2 CRTC2与糖代谢
<\/strong>CREB转录激活因子2(coactivator 2, CRTC2)是 一个可以在细胞质和细胞核之间穿梭的蛋白, 目前 关于CRTC2的研究主要集中于它在细胞核内的功 能[14]。在基础状态下, CRTC2处于磷酸化状态并通 过结合14-3-3蛋白定位于细胞质; 当受到胞内的钙 离子和环腺苷酸信号调控时, CRTC2被钙调磷酸酶 去磷酸化, 去磷酸化的CRTC2进入细胞核促进其靶 基因的转录[14-15]。在细胞核内, CRTC2作为一个转 录激活子通过结合不同的转录因子在糖异生和内 质网应激过程中发挥重要作用[14-16], 但至今我们对 CRTC2在细胞质内的功能知之甚少。尽管目前关于 CRTC家族成员的研究主要集中在它们在糖代谢中所发挥的作用[14], 但也有一些研究显示, CRTC家族 在脂代谢中可能起着重要作用[17-19]。这些发现让我 们对CRTC2是否在肝脏脂代谢中发挥重要作用产生 了极大的兴趣。<\/p>

3 CRTC2调控脂代谢
<\/strong>我们利用Crtc2敲除小鼠进行研究, 发现无论在 正常食物喂养条件下还是在高脂食物喂养条件下, Crtc2敲除小鼠肝脏中甘油三酯含量与野生型小鼠 相比均有显著增加[20]。进一步的研究发现, 甘油三 酯含量的增加与SREBP1活性的增强以及CRTC2细 胞质的功能密切相关(图1)[20]。我们之前的研究表明, CRTC2在细胞质中富集于内质网周围[15-16]。这些结 果提示, CRTC2可能参与了SREBP1转运过程的调 控。通过对内质网组分的亚细胞分离及相互作用蛋 白质的分析, 我们发现, CRTC2和COPII复合物中的 一个亚基Sec31A存在相互作用[20]。同时, 研究结果 表明, CRTC2上Trp143这个位点对CRTC2与Sec31A 之间的相互作用很重要[20]。Sec31A的C-端不仅结合 CRTC2, 而且也是其与Sec23A相互作用的区域, 于 是我们推测, CRTC2可能阻碍了Sec31A与Sec23A的 相互作用, 体内外的实验结果证实了这一推测[20]。 因此, 这些结果表明, CRTC2通过和Sec23A竞争性 结合Sec31A来调控SREBP1的转运和加工成熟过程。<\/span><\/p>


<\/p>

<\/p>

胰岛素信号和营养信号可以调控SREBP1的成 熟过程及其转录因子活性[7-8,21], 我们推测CRTC2和 Sec31A的相互作用可能受到激素和营养物质的调 控, 进而调控了SREBP1的激活。实验证明, 胰岛素 和氨基酸均可以减弱CRTC2和Sec31A的相互作用 并增强Sec23A和Sec31A的相互作用[20]。同时, 我们通过体内和体外实验发现, mTOR可以在Ser136这个 位点直接磷酸化CRTC2, CRTC2的磷酸化缺陷突变 体CRTC2(S136A)减弱了胰岛素对Sec23A:Sec31A之 间相互作用的调节[20]。<\/span>
那么, mTOR-CRTC2-SREBP1调控机制在代谢 性疾病中发生了什么变化呢？我们利用肥胖和糖 尿病模型小鼠分析了CRTC2的磷酸化及其调控作 用。研究结果表明, 在肥胖和糖尿病模型小鼠中, mTOR对CRTC2 Ser136的磷酸化显著增强, CRTC2 和Sec31A的相互作用减弱; 同时, Sec31A和Sec23A 的相互作用增强[20]。另外, 通过表达磷酸化缺陷的 CRTC2突变体CRTC2(ΔTAD/S136A)可以降低高脂 食物喂养的小鼠肝脏中SREBP1的活性和甘油三酯 的含量、增强小鼠的胰岛素敏感性[20]。这些结果显 示, 在肥胖和糖尿病患者体内, CRTC2 Ser136磷酸化 的增强是导致SREBP1活性升高和肝脏脂生成增加 的重要原因之一。<\/span>
综上所述, 我们发现, CRTC2介导了mTOR信 号通路对SREBP1活性和脂合成代谢的调节, 揭示 了代谢性疾病中肝脏脂代谢紊乱的重要分子机制。 这项工作的重要意义在于: (1)发现CRTC2除了入核 调控糖代谢之外, 定位于细胞质的CRTC2发挥着调 控脂代谢的重要功能; (2)阐明了mTOR信号通路对 SREBP1活性调控的一种分子机制; (3)解释了在肥胖、糖尿病和脂肪肝患者体内SREBP1活性增强的 分子机理, 为这类疾病的治疗提供了新的思路。<\/span>

4 未来研究方向<\/strong>
我们的工作揭示了定位于细胞质中的CRTC2 介导了mTOR对SREBP1的加工成熟和对脂合成过 程的调控作用, 阐明了在肥胖、糖尿病和脂肪肝患 者体内SREBP1活性增强的分子机理。但仍有很 多问题有待解决, 例如: 在禁食饥饿时, CRTC2穿 梭到细胞核[14], 从而失去了对SREBP1的抑制作用, SREBP1活性应该增强, 但实际上SREBP1的活性在 禁食饥饿时是减弱的[22-24], 具体的机制还不清楚。 另外, 我们的结果显示, CRTC2对SREBP1的成熟过 程有抑制作用, 但对SREBP2的成熟没有影响, 因此, CRTC2对COPII膜泡运输调控的选择性和特异性问 题还有待进一步研究。对这些问题的深入研究, 将 有助于我们更好地理解膜泡运输过程中膜泡对运载 蛋白的选择机制以及相关代谢性疾病的发病机理。<\/span>
<\/p>

参考文献 (References)
<\/strong>1 Lodhi IJ, Wei X, Semenkovich CF. Lipoexpediency: de novo lipogenesis as a metabolic signal transmitter. Trends Endocrinol Metab 2011; 22(1): 1-8.

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5 Wang X, Sato R, Brown MS, Hua X, Goldstein JL. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell 1994; 77(1): 53-62.

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9 Shimomura I, Matsuda M, Hammer RE, Bashmakov Y, Brown MS, Goldstein JL. Decreased IRS-2 and increased SREBP- 1c lead to mixed insulin resistance and sensitivity in livers of lipodystrophic and ob/ob mice. Mol Cell 2000; 6(1): 77-86.

10 Duvel K, Yecies JL, Menon S, Raman P, Lipovsky AI, Souza AL, et al. Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1. Mol Cell 2010; 39(2): 171-83.

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13 Yecies JL, Zhang HH, Menon S, Liu S, Yecies D, Lipovsky AI, et al. Akt stimulates hepatic SREBP1c and lipogenesis through parallel mTORC1-dependent and independent pathways. Cell Metab 2011; 14(1): 21-32.

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16 Wang Y, Vera L, Fischer WH, Montminy M. The CREB coactivator CRTC2 links hepatic ER stress and fasting gluconeogenesis. Nature 2009; 460(7254): 534-7.

17 Altarejos JY, Goebel N, Conkright MD, Inoue H, Xie J, Arias CM, et al. The Creb1 coactivator Crtc1 is required for energy balance and fertility. Nat Med 2008; 14(10): 1112-7.

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19 Wang Y, Inoue H, Ravnskjaer K, Viste K, Miller N, Liu Y, et al. Targeted disruption of the CREB coactivator Crtc2 increases insulin sensitivity. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107(7): 3087- 92.

20 Han J, Li E, Chen L, Zhang Y, Wei F, Liu J, et al. The CREB coactivator CRTC2 controls hepatic lipid metabolism by regulating SREBP1. Nature 2015; 524(7564): 243-6.

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22 Gosmain Y, Dif N, Berbe V, Loizon E, Rieusset J, Vidal H, et al. Regulation of SREBP-1 expression and transcriptional action on HKII and FAS genes during fasting and refeeding in rat tissues. Journal of lipid research 2005; 46(4): 697-705.

23 Horton JD, Bashmakov Y, Shimomura I, Shimano H. Regulation of sterol regulatory element binding proteins in livers of fasted and refed mice. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95(11): 5987-92.

24 Kim JB, Sarraf P, Wright M, Yao KM, Mueller E, Solanes G, et al. Nutritional and insulin regulation of fatty acid synthetase and leptin gene expression through ADD1/SREBP1. J Clin Invest 1998; 101(1): 1-9.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-48-03-110.jpg","cshort":"

王一国, 清华大学生命科学学院研究员, 博士生导师。2001年毕业于曲阜师范大学, 获学士学位。2007年在中国科学院上海生命科学研究院生物化学与 细胞生物学研究所获博士学位, 导师陈正军研究员。2007年至2012年在 美国Salk Institute著名科学家Marc Montminy实验室从事博士后研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

王一国, 清华大学生命科学学院研究员, 博士生导师。2001年毕业于曲阜师范大 学, 获学士学位。2007年在中国科学院上海生命科学研究院生物化学与 细胞生物学研究所获博士学位, 导师陈正军研究员。2007年至2012年在 美国Salk Institute著名科学家Marc Montminy实验室从事博士后研究。主要研究方向为激素、营养和应激信号在能量稳态平衡中的调控机制及其 与相关代谢性疾病之间的联系。课题组近期在Nature<\/em>上发表论文, 报道了 CRTC2调控脂代谢的信号通路, 揭示了代谢性疾病中肝脏脂代谢紊乱的 重要分子机制(Han et al. Nature<\/em> 2015)。<\/span><\/p>","ctitle":"CRTC2在肝脏脂内稳态中的作用","listseq":33,"seqno":"27","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-19-20-168"},{"caddress1":"(中国科学院生物物理研究所, 生物大分子国家重点实验室, 北京 100101)","cauthor":"朱 平*","cintpic":"","clicktime":2,"clong1":"

DNA是遗传信息的载体, DNA双螺旋结构模 型[1] 的建立确立了生命体遗传信息传递的分子机 制, 并开创了现代分子生物学的时代。但是, 任何 有关DNA的生命活动(包括基因转录及DNA复制、 修复、重组等)都是在由DNA与其所缠绕的组蛋白 组装形成的核小体及染色质这个结构平台上进行 的。人类基因组计划完成后的一个重要生物学问 题是: 人体内200多种具有相同基因组, 但形态和功 能各异的细胞的命运是如何决定和分化的？这其 中, 由染色体的基本单元—核小体经多次折叠后 形成的染色质起了重要的作用。在高等生物个体 的发育和分化过程中, 生命体通过各种表观遗传机 制调控染色质高级结构(特别是30 nm染色质纤维) 的动态变化, 进而调控基因的开放、关闭和转录水 平, 从而决定细胞的组织特异性和细胞命运。因此, 染色质的高级结构、动态变化及其调控机制对于 理解生命过程的本质具有重要的意义, 也是现代分 子生物学的基本问题之一。<\/span>

DNA是遗传信息的载体, DNA双螺旋结构模 型[1] 的建立确立了生命体遗传信息传递的分子机 制, 并开创了现代分子生物学的时代。但是, 任何 有关DNA的生命活动(包括基因转录及DNA复制、 修复、重组等)都是在由DNA与其所缠绕的组蛋白 组装形成的核小体及染色质这个结构平台上进行 的。人类基因组计划完成后的一个重要生物学问 题是: 人体内200多种具有相同基因组, 但形态和功 能各异的细胞的命运是如何决定和分化的？这其 中, 由染色体的基本单元—核小体经多次折叠后 形成的染色质起了重要的作用。在高等生物个体 的发育和分化过程中, 生命体通过各种表观遗传机 制调控染色质高级结构(特别是30 nm染色质纤维) 的动态变化, 进而调控基因的开放、关闭和转录水 平, 从而决定细胞的组织特异性和细胞命运。因此, 染色质的高级结构、动态变化及其调控机制对于 理解生命过程的本质具有重要的意义, 也是现代分 子生物学的基本问题之一。<\/span>

1 冷冻电镜三维重构技术的发展<\/strong>
冷冻电镜三维重构技术和X射线晶体学技术、 核磁波谱共振技术一起被称为结构生物学三大主要 研究手段。利用冷冻电镜技术进行三维结构解析的 主要方法有: 单颗粒分析方法、电子断层成像方法 和电子晶体学方法。虽然电镜三维重构的方法和 技术体系在三十多年前即已基本建立, 但长期以来 冷冻电镜三维重构分辨率都只局限在纳米级范围或 更低, 虽然可以看到病毒、核糖体等生物大分子机 器的总体构象, 但是看不清分子之间组装和相互作 用的细节。因此, 电镜三维重构技术也常常被称为 “Blob-ology”。<\/span>

但是, 这种情况正在改变。近年来, 随着电子显 微镜设备硬件的提升及软件的发展, 特别是直接电 子探测器在低温透射电镜上的应用, 冷冻电镜三维 重构技术在生物大分子及其复合物的结构解析中发 展迅速, 正在向近原子分辨率取得重要突破, 也引起 了研究者的极大关注[2] 。其中, 一个标志性的工作是 利用冷冻电镜单颗粒方法解析了在疼痛和热知觉感 知中起重要作用的离子通道膜蛋白TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1)的3.4 ?分辨率结构[3] ; 对于其他一些超大分子复 合体, 如核糖体等的冷冻电镜三维重构分辨率也在 迅速提高, 局部分辨率达到了3.2 ?[4] 。在这种分辨 率下, 研究者可以完全依赖于重构的电镜三维密度 图独立构建这些生物大分子复合体的空间结构原子模型。<\/span>

以这些标志性工作为代表的高分辨率冷冻电 镜三维重构研究绕过了目前在结构生物学领域占主 导地位的X射线晶体学中蛋白结晶这个瓶颈, 开启了 直接利用冷冻电镜技术解析膜蛋白、超大分子复合 体等精细结构的大门。在此基础上, 很多研究者期 盼已久, 但却难以利用传统的X射线晶体学方法获得 的重要生物大分子及复合物的结构得以解析, 从较 小分子量(170 kDa)的阿尔茨海默症相关膜蛋白γ分泌酶复合物(γ-secretase) [5-6] , 到由23个亚基组成的动 力肌动蛋白(dynactin)复合体[7] 以及37个亚基组成的 酵母剪切体(spliceosome)等超大分子复合体[8] 等。<\/span>

目前, 冷冻电镜单颗粒三维重构分辨率的最高 重构精度达到了2.2 ?[9] , 从分辨率上已经具备了和X 射线晶体学竞争的能力。同时, 由于冷冻电镜三维重 构技术不需要结晶, 所用的样品量相对较少, 为研究 在生命过程中起重要作用但又难以获得晶体的染色 质等超大分子复合物的结构提供了一种极好的工具。<\/span>

2 DNA基因组的逐级折叠<\/strong>
DNA分子呈双螺旋结构[1] 。有意思的是, 人体 内一个细胞的DNA长度加起来约有2 m, 这么长的基 因组DNA分子是如何组装、紧密压缩到10~20 μm的 细胞核空间内去的呢？一般认为, 这个过程是通过 基因组DNA的逐级折叠方式分四步完成的。这些折 叠过程分别对应着基因组的四级结构: 第一级结构 是核小体, 它是DNA双螺旋“绳子”缠绕在组蛋白上 而形成的; 第二级结构是核小体进一步折叠形成直 径在30 nm左右的纤维, 即30 nm染色质纤维; 第三级 结构是由30 nm染色质纤维再进一步折叠成为直径 为0.4 μm的筒状体, 也称为超螺旋体; 第四级结构就 是可以在光学显微镜下看到的染色体, 它是由超螺 旋体进一步折叠盘绕成的。通过以上四步, DNA的 长度被凝缩了8 400倍左右。这种逐级折叠的方式 对于遗传信息的表达及调控非常关键。DNA是遗传 信息的载体, 然而某一种基因是否表达或者在哪些 细胞中表达, 染色质的空间结构及动态变化则起到 了非常重要的作用。<\/span>

3 核小体与染色质<\/strong>
核小体是染色质结构的基本单元, 由147 bp DNA缠绕组蛋白八聚体(由4种组蛋白H2A、H2B、 H3和H4各2个分子组成的扁球状八聚体)1.75圈组 成, 其高精度精细结构于1997年被Richmond研究组 解析[10] 。<\/span>

虽然染色质的概念早在1879年就被提出, 但是 直到一百年后的1974年, 研究者才利用生物化学和电 镜成像技术发现染色质的一级结构, 即由DNA串联 的11 nm核小体串珠结构[11] 。在此基础上, 染色质一 级结构在连接组蛋白的帮助下折叠形成直径约30 nm 的染色质二级结构, 即“30 nm染色质纤维”[12-13] 。 染色质二级结构再进一步折叠形成更为复杂的染色质 高级结构, 从而实现将长达2 m的基因序列有规律的 归集在微米级的细胞核中。在这些折叠形式中, 染 色质的一级及二级结构, 即核小体和30 nm染色质纤 维的动态变化在基因的转录及表观遗传调控中起了 关键作用。<\/span>

在过去的三十多年里, 人们一直试图获得由核 小体在连接组蛋白帮助下折叠形成的染色质二级结 构的高分辨率信息。但是, 由于缺乏合适的手段和 体系, 30 nm染色质纤维的精细结构一直没有被解 析。利用电子显微镜、X射线及中子散射法、沉降 分析法和X射线晶体学等研究手段, 研究者提出了 一系列关于30 nm染色质纤维结构的模型, 其中有两 种最具代表性[14-15] : 单螺旋的solenoid模型和双螺旋 的Zig-Zag模型, 目前教科书上普遍采用的30 nm染 色质纤维模型是核小体串珠结构在连接组蛋白的帮 助下经螺旋化形成每一周包含6个核小体的螺旋管 线状体。但是, 由于30 nm染色质纤维的精细结构一 直没有被解析, 30 nm染色质的高级结构仍存在重大 争议, 没有形成共识。<\/span>

长期以来, 对多个核小体以何种方式装配形成 30 nm染色质高级结构以及该结构受什么因素调控 一直是研究者十分关注, 对生命信息的传承和调控 至关重要的信息。这个问题一直困扰了研究者30余 年, 其困难性主要来源于两个方面: 第一, 细胞核内 的染色质结构高度变化, 受多种因素的影响, 难以获 得适合高分辨率结构研究、具有高度均一性的染色 质样品; 第二, 30 nm染色质是一个典型的超大分子 复合体, 对这种超大分子复合体的高分辨率研究缺 乏一个系统性的、合适的研究手段和体系, 具有很 大的技术难度和挑战性。对于第一个方面的困难, 研究者通过多年的努力, 发现利用体外表达一种具 有特殊性质的601 DNA[16] 和组蛋白八聚体, 可以获 得适合高分辨率研究的核小体和染色质; 对于第二 方面的困难, 近年来在结构生物学领域蓬勃发展, 在 近原子分辨率三维结构重构等多方面取得重要突破 的冷冻电镜三维重构方法[2] 为研究30 nm染色质的 高级结构提供了一个最为合适的工具。<\/span>

4 体外重组30 nm染色质结构研究<\/strong>
由于DNA序列、组蛋白成分、组蛋白翻译后 修饰的不同以及核小体之间相对取向的不规则性, 使得天然染色质具有高度的异质性和可变性, 从而 导致利用三维电镜等结构生物学手段无法获得高 分辨率的二级结构模型。为了获得尽量均一的研 究材料, 人们建立了一套体外重构组装的体系, 即 将体外表达的组蛋白八聚体与一种人工设计的601 DNA(含有wisdom 601 nucleosome positioning序列, 对组蛋白八聚体有很强的亲和力) [16] 按一定比例混 合, 经过透析形成串珠状结构, 之后加入二价阳离子 (一般是Mg2+ )或连接组蛋白H1/H5, 形成染色质纤维 二级结构。同时, 在组装过程中, 可以通过改变不同 的组蛋白修饰、组蛋白变体、不同的连接DNA长度 等多种条件获得不同状态的纤维结构, 对各种影响 染色质结构及动态变化的表观遗传调控因素在体外 进行相关研究, 探究表观遗传调控过程中染色质的 动态变化机制。<\/span>

通过体外组装和电镜观察, 研究者提出了30 nm 染色质的不同模型。Richmond团队[17] 在电镜下观察 发现, 体外组装的48×177 bp DNA染色质纤维宽度 大多数都在25~30 nm之间, 呈现等长的双排平行结构, 看上去与two-start模型相符。之后, 他们在染色 质样品的组装过程中按照核小体与连接组蛋白1:1 的比例加入H1, 结果在电镜下也看到平行的双排核 小体。由此他们认为, 连接组蛋白的结合不会影响 染色质纤维二级结构是one-start还是two-start。与此 对照, Rhodes团队[18] 为了研究连接DNA长度对纤维 的影响, 在体外构建了一系列不同DNA长度的染色 质纤维, 并在染色质折叠过程中加入连接组蛋白H5 和1.6 mmol/L的MgCl2, 利用电子显微镜观察并测量 纤维直径后发现, 染色质纤维的直径没有随着连接 DNA长度的增加而呈线性增长, 与two-start模型相 悖。他们提出了一种左手one-start交叉螺线管模型, 并推测连接组蛋白会通过改变连接DNA的轨迹从 而决定相邻核小体之间的相对位置以及相互作用模 式, 最终决定核小体串珠结构折叠成染色质时形成 的形状。<\/span>

冷冻电镜三维重构技术的迅速发展为研究 30 nm染色质的精细高级结构及其调控机制带来了 契机。中国科学院生物物理研究所几个具有不同研究特长的研究组发挥各自优势, 对30 nm染色质高级 结构这一问题进行了长期的合作研究并于近期获得 了较为重要的进展(图1) [19] 。李国红研究组依据多年 来在30 nm染色质和表观遗传学研究方面的积累, 建 立了一套染色质体外重建和结构分析平台, 获得了 适合高分辨率研究的高度均一的30 nm染色质样品; 朱平研究组依靠在冷冻电镜高分辨率结构解析方面 的长期积累, 利用冷冻电镜单颗粒三维重构方法(图 1A)获得了由12个和24个核小体组成的30 nm染色质 纤维的高分辨率三维重构结果(图1B和图1C)。我们 解析的结构显示, 30 nm染色质纤维以四个核小体为 基本结构单元(图1B); 结构单元的形成和单元之间 的扭转由不同方式的作用力介导; 结构单元之间通 过相互扭曲折叠形成一个左手双螺旋高级结构(图 1C和图1D); 四聚核小体结构单元之间的空隙可能 是组蛋白修饰、染色质重塑等重要表观遗传现象发 生的调控控制区域。同时, 我们的研究还发现, 连接 组蛋白H1在单个核小体内部及核小体单元之间的 不对称分布及相互作用促成30 nm高级结构的形成, 首次明确了连接组蛋白H1在30 nm染色质纤维形成 过程中的重要作用。<\/span>

5 体内的30 nm染色质结构研究<\/strong>
30 nm染色质纤维在体内结构如何, 甚至体内是 否存在30 nm染色质一直是一个有争论的问题[20-21] 。 近年来, 随着电镜技术的应用, 尤其冷冻电子断层成 像三维重构技术的应用, 对于体内30 nm染色质纤维 的结构模型研究也有了一些更深入的研究进展。<\/span>

体内的30 nm染色质纤维研究可以大致分为以 下两类: (1)从细胞核提取的染色质纤维研究; (2)细 胞核内染色质的原位观察。<\/span>

早期, 人们借助电子显微镜从各种不同的生物 体细胞(如海参细胞、鸡血红细胞、美洲蝾螈血红 细胞、鼠肝细胞等)中提取出染色质纤维进行观察 研究。1976年, Finch等[12] 从鼠肝细胞核中提取出天 然11 nm核小体串珠状结构, 并向其中加入连接组蛋 白H1或Mg2+ , 在电镜下观察到了30 nm染色质纤维 结构, 这也是最早观察到的30 nm染色质纤维。根 据电镜结果, 他们提出了one-start的螺线管模型。 Woodcock等[22] 从鸡血红细胞中提取出染色质纤维, 分别在不同的盐浓度下透析, 利用透射电镜和扫描 电镜进行观察分析, 发现染色质随着盐离子浓度的提高, 凝聚程度变大, 结构也变得更加紧密。通过对 电镜数据进行整理分析, 他们认为, 染色质纤维符合 two-start的螺旋桨(helical-ribbon)模型。之后, 他们进 一步提出染色质纤维是不规则的3D zig-zag模型[23] 。 Langmore等[24] 用海参精子细胞和蝾螈红细胞作为实 验材料提取染色质, 在冷冻状态下观察, 提出染色质 呈现two-start的交叉连接(crossed-linker)模型, 双螺 旋纤维组成的核小体呈现“face to face”的排列方式, 两列核小体相互平行且平行于染色质纤维螺旋轴。 他们还发现, 随着离子浓度的升高, zig-zag结构会变 得更加紧密, 这与Woodcock等的结论相同。最近, Frangakis团队[25] 利用冷冻电子断层成像技术, 对从 鸡血红细胞中提取的染色质纤维进行冷冻观察, 发 现在紧实的染色质纤维中, 核小体主要是以“face to face”的方式堆叠排布, 他们推测核小体的堆积叠加 是体内染色质高级结构形成的重要机制。<\/span>

提高, 凝聚程度变大, 结构也变得更加紧密。通过对 电镜数据进行整理分析, 他们认为, 染色质纤维符合 two-start的螺旋桨(helical-ribbon)模型。之后, 他们进 一步提出染色质纤维是不规则的3D zig-zag模型[23] 。 Langmore等[24] 用海参精子细胞和蝾螈红细胞作为实 验材料提取染色质, 在冷冻状态下观察, 提出染色质 呈现two-start的交叉连接(crossed-linker)模型, 双螺 旋纤维组成的核小体呈现“face to face”的排列方式, 两列核小体相互平行且平行于染色质纤维螺旋轴。 他们还发现, 随着离子浓度的升高, zig-zag结构会变 得更加紧密, 这与Woodcock等的结论相同。最近, Frangakis团队[25] 利用冷冻电子断层成像技术, 对从 鸡血红细胞中提取的染色质纤维进行冷冻观察, 发 现在紧实的染色质纤维中, 核小体主要是以“face to face”的方式堆叠排布, 他们推测核小体的堆积叠加 是体内染色质高级结构形成的重要机制。<\/span>

但是, 在以上这些精子细胞及鸡血红细胞等以 外的其他细胞中, 30 nm染色质却并没有被广泛观察 到。Dubochet团队[20,30] 对中国仓鼠卵巢细胞和Hela 细胞冷冻切片进行观察, 发现细胞核内染色质呈现 出均一, 有颗粒状的纹理, 但是并没有观察到高级的规律性结构。他们发现, 在有丝分裂染色体中, 染 色质纤维处在高度无序, 相间错杂的状态, 并且随 着溶液中镁离子的减少, 染色质会发生膨胀, 从而 抑制30 nm染色质纤维紧密结构的形成[20] 。由此, 他 们认为, 有丝分裂染色体中没有发现30 nm染色质纤 维存在。之后, Maeshima等[31] 也提出在有丝分裂期 染色体中可能并不存在30 nm染色质结构, 并提出一 种熔融模型(melting model)的假说, 即体内的染色体 是处于一种高度无序、相间交错的状态, 类似于多 聚体熔融的动态移动。<\/span>

6 染色质结构与表观遗传调控<\/strong>
<\/p>


A: 体外组装由12个核小体形成的30 nm染色质纤维冷冻电镜图像; B: 12个核小体的冷冻电镜三维重构结果及示意图, 其中4个核小体为一个基
本结构单元, 以不同颜色表示; C: 24个核小体的冷冻电镜三维重构结果, 左手双螺旋结构特征明显; D: 30 nm染色质纤维的左手双螺旋高级结
构模型。A: cryo-EM micrograph of 30 nm chromatin fiber reconstituted in vitro with 12 nucleosomes; B: cryo-EM reconstruction and diagram of the reconstituted 30 nm chromatin with 12 nucleosomes, which is composed of 3 tetra-nucleosome units shown in different colors; C: cryo-EM reconstruction of chromatin fiber with 24 nucleosomes with obvious shape of left-handed double helix; D: the higher order left-handed double helical structure model of 30 nm chromatin fiber.
图1 30 nm染色质冷冻电镜三维重构及左手双螺旋高级结构模型(根据参考文献[15,19]修改)
Fig.1 The 3-D cryo-EM reconstruction and left-handed double helical model of 30 nm chromatin ?ber (modi?ed from references [15,19])<\/p>

编码某一种蛋白的遗传信息, 是由DNA中碱基 排列序列所决定的。然而, 某一种基因是否表达或 者在那些细胞中表达, 表观遗传(epigenetics)因素主 导的染色质空间结构变化则起到了非常重要的作用。<\/span>

表观遗传调控机制是生命现象中的一种普遍 存在的调控方式, 涉及生命现象的方方面面。表观 遗传及其调控机制的研究主要集中在染色质DNA 甲基化和组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化等修饰以 及核小体和染色质重塑等方面。表观遗传信息建立 后, 通常认为是通过影响染色质高级结构或者在效 应蛋白的帮助下影响染色质高级结构的动态变化, 来实现对基因表达的调控。由于染色质本身的高级 结构并未得以解析, 表观遗传信息究竟怎样影响染 色质的高级结构, 长期以来却知之甚少, 以至于在众 多文献中研究者们常常把不能解释的一些事件归咎 为“该因子以某种方式改变了染色质的高级结构”, 因而染色质的高级结构变化也就成了科学界的一个 “黑箱”。我们解析的在体外组装的30 nm染色质纤 维的左手双螺旋高级结构模型[19] , 为继续研究表观 遗传信息对30 nm染色质结构的影响提供了较好的 基础, 使得研究者有望回答染色质修饰(包括DNA甲 基化和组蛋白修饰)、染色质变体组成等一系列表 观遗传信息对30 nm染色质纤维的结构影响, 明确其 结构动态变化在基因转录调控中的作用机理。<\/span>

细胞核中染色质的整体组织形式除了受到细 胞周期调控以外, 其局部结构也是高度动态变化 的, 会受到各种表观遗传因素(如组蛋白变体、DNA 和组蛋白化学修饰等)的调控, 需要进行进一步的 深入研究。尽管如此, 我们在体外、低盐条件、依赖于连接组蛋白H1组装形成的30 nm染色质左手 双螺旋高级结构主要是由于DNA和组蛋白的内 在物理和化学性质决定的, 其基本原则对体内染 色质也可能适用。随着冷冻电镜及电子断层成像 (electron tomography, ET)三维重构、冷冻电镜?高 分辨率光学显微镜关联成像(correlative light electron microscopy, CLEM)等技术的快速发展和应用, 可以 预计细胞体内的染色质高级结构研究也将有一个大 的发展, 对于细胞核内的染色质结构及调控机制会 有更明确的结论。<\/span>
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参考文献 (References)<\/strong>
1 Watson JD, Crick FHC. Molecular structure of nucleic acids. Nature 1953; 171(4356): 737-8.

2 Zhu HT, Zhu P. No longer ‘blob-ology’: Cryo-EM is getting into molecular details. Sci China Life Sci 2015; doi: 10.1007/s11427- 015-4942-0.

3 Liao M, Cao E, Julius D, Cheng Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature 2013; 504(7478): 107-12.

4 Amunts A, Brown A, Bai X, Llácer JL, Hussain T, Emsley P, et al. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science 2014; 343(6178): 1485-9.

5 Lu P, Bai X, Ma D, Xie T, Yan C, Sun L, et al. Three-dimensional structure of human γ-secretase. Nature 2014; 512(7513): 166-70.

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9 Bartesaghi A, Merk A, Banerjee S, Matthies D, Wu X, Milne JL, et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of beta-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science 2015; 348(6239): 1147-51.

10 Luger K, Mäder AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature 1997; 389(6648): 251-60.

11 Kornberg RD. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science 1974; 184(4139): 868-71.

12 Finch J T, Klug A. Solenoidal model for superstructure in chromatin. Proc Natl Acad Sci USA 1976; 73(6): 1897-901.

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15 Li G, Zhu P. Structure and organization of chromatin fiber in the nucleus. FEBS Lett 2015; doi: 10.1016/j.febslet.2015.04.023.

16 Lowary PT, Widom J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol 1998; 276(1): 19-42.

17 Dorigo B, Schalch T, Kulangara A, Duda S, Schroeder RR, Richmond TJ. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science 2004; 306(5701): 1571-3.

18 Robinson PJ, Fairall L, Huynh VA, Rhodes D. EM measurements define the dimensions of the “30-nm” chromatin fiber: Evidence for a compact, interdigitated structure. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(17): 6506-11.

19 Robinson PJ, Fairall L, Huynh VA, Rhodes D. EM measurements define the dimensions of the “30-nm” chromatin fiber: Evidence for a compact, interdigitated structure. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(17): 6506-11.

20 Eltsov M, MacLellan KM, Maeshima K, Frangakis AS, Dubochet J. Analysis of cryo-electron microscopy images does not support the existence of 30-nm chromatin fibers in mitotic chromosomes in situ. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105(50): 19732-7.

21 Scheffer MP, Eltsov M, Frangakis AS. Evidence for short-range helical order in the 30-nm chromatin fibers of erythrocyte nuclei. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108(41): 16992-7.

22 Woodcock CL, Frado LL, Rattner J B. The higher-order structure of chromatin: Evidence for a helical ribbon arrangement. J Cell Biol 1984; 99(1 Pt 1): 42-52.

23 Horowitz R A, Koster A J, Walz J, Wookcock CL. Automated electron microscope tomography of frozen-hydrated chromatin: the irregular three-dimensional zigzag architecture persists in compact, isolated fibers. J Struct Biol 1997; 120(3): 353-62.

24 Langmore JP, Paulson JR. Low angle x-ray diffraction studies of chromatin structure in vivo and in isolated nuclei and metaphase chromosomes. J Cell Biol 1983; 96(4): 1120-31.

25 Scheffer MP, Eltsov M, Bednar J, Frangakis AS. Nucleosomes stacked with aligned dyad axes are found in native compact chromatin in vitro. J Struct Biol 2012; 178(2): 207-14.

26 Everid AC, Small JV, Davies HG. Electron-microscope observations on the structure of condensed chromatin: Evidence for orderly arrays of unit threads on the surface of chicken erythrocyte nuclei. J Cell Sci 1970; 7(1): 35-48.

27 Davies HG, Murray AB, Walmsley ME. Electron-microscope observations on the organization of the nucleus in chicken erythrocytes and a superunit thread hypothesis for chromosome structure. J Cell Sci 1974; 16(2): 261-99.

28 Woodcock CL. Chromatin fibers observed in situ in frozen hydrated sections. Native fiber diameter is not correlated with nucleosome repeat length. J Cell Biol 1994; 125(1): 11-9.

29 Horowitz RA, Agard DA, Sedat JW, Woodcock CL. The three-dimensional architecture of chromatin in situ: Electron tomography reveals fibers composed of a continuously variable zig-zag nucleosomal ribbon. J Cell Biol 1994; 125(1): 1-10.

30 Mcdowall AW, Smith JM, Dubochet J. Cryo-electron microscopy of vitrified chromosomes in situ. EMBO J 1986; 5(6): 1395-402.

31 Maeshima K, Hihara S, Eltsov M. Chromatin structure: Does the 30-nm fibre exist in vivo? Curr Opin Cell Biol 2010; 22(3): 291-7.<\/p>


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朱平, 中国科学院生物物理研究所, 生物大分子国家重点实验室研究员。 1990年本科毕业于浙江大学, 1993年于西安交通大学获硕士学位, 1997年于清华大学获博士学位, 后留校任教。1999年赴美国佛罗里达州立大学 生物系从事博士后研究, 历任博士后研究助理、助理研究员、副研究员。 2008年起回国, 进入中国科学院生物物理研究所工作, 任研究组长、博士生导师。<\/span><\/p>","cshort2":"

朱平, 中国科学院生物物理研究所, 生物大分子国家重点实验室研究员。 1990年本科毕业于浙江大学, 1993年于西安交通大学获硕士学位, 1997年于清华大学获博士学位, 后留校任教。1999年赴美国佛罗里达州立大学生物系从事博士后研究, 历任博士后研究助理、助理研究员、副研究员。 2008年起回国, 进入中国科学院生物物理研究所工作, 任研究组长、博士生导师。朱平研究员以冷冻电镜(Cryo-EM)技术为主要手段进行病毒、染色质等生物大分子及其复合物的结构和功能研究。研究工作主要集中于以下两个方向: (1)病毒的组装、 感染与复制机制; (2)染色质的高级结构与表观遗传调控的分子机制。朱平研究组和李国红研究组合作, 利用冷冻电镜单颗粒分析技术解析了30 nm 染色质的高分辨率结构(Science<\/em> 2014), 揭示了30 nm染色质纤维的左手双 螺旋高级结构模型, 在染色质的高级结构组装及调控机制研究上取得了 较为重要的进展。近年来, 朱平研究员在包括Nature、Science、Proc Natl Acad Sci USA、elife、PLoS Pathog<\/em>等知名期刊上发表论文30余篇, 其中, 以通讯作者或共同通讯作者在Science、Proc Natl Acad Sci USA、elife、J Virol、Virology<\/em>等期刊上发表论文10余篇, 在本领域内产生了较大影响。<\/span><\/p>","ctitle":"冷冻电镜技术的发展推动染色质高级结构的研究","listseq":34,"seqno":"26","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-18-29-330"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所, 神经科学国家重点实验室, 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心, 上海 200031)","cauthor":"边文杰* 于 翔*","cintpic":"","clicktime":3,"clong1":"

我们的大脑中由约一千亿(1011)个神经元组成, 其中每个神经元又与其他神经元形成约一千个被称 为“突触”(synapse)的联接节点[1-3]。通过这些突触, 一个神经元可以接受来自其他神经元的信息输入 (兴奋性或抑制性), 将其整合、处理, 产生自身的输 出信息, 并通过轴突传递给其他神经元。这一千亿 个神经元通过突触彼此相互联接形成精细的神经环 路, 进而构成一个复杂而庞大的神经网络系统。作 为神经元之间相互联接和信息传递的物理基础, 突 触的总数目和单个突触强度的改变是检测神经环路 动态变化的一个直观指标。<\/span>
大脑中绝大部分的兴奋性突触(>90%)位于神 经元的树突上一种被称为“树突棘”(dendritic spine) 的棘刺状凸起结构上。这些树突棘最初是由被称 为“现代神经科学之父”的十九世纪西班牙神经解 剖学家Santiago Ramóny Cajal用手绘的方式记录与 描述[4], 被预测为神经元之间的联接节点。这一预 测在二十世纪中叶通过电镜、电生理等方法得到 了验证[5-6]。典型的树突棘形态包括一个膨大的“棘 头”(spine head)和一个收缩的“棘颈”(spine neck)。 我国神经科学先驱张香桐先生曾在上世纪50年代对树突的生理功能进行了大量开拓性的研究, 他最 早提出, 树突棘的这种独特结构可能具有重要的功 能意义, 负责了神经元兴奋性的精细调节[7]。后续 大量研究证实, 树突棘头部的大小与突触强度正相 关, 而棘头和棘颈的形态变化对突触可塑性至关重 要[8-12]。<\/span>

1 大脑可塑性与发育过程中的树突棘修剪<\/strong>
大脑具有很强的可塑性, 其结构和功能受外界 刺激的影响而发生改变。例如, 普通人经过训练, 逐 渐能够分辨出原来不能分辨的色彩、形状、气味 或材质。同样, 人也能够通过学习获得一些永久的 技能, 例如说外语、骑自行车或者弹钢琴。对这些 技能的学习往往具有一个“关键期”, 过了这个关键 期之后, 学习的效果往往明显下降, 甚至根本无法 学会。大脑的这些可塑的特性提示, 脑中神经环路 的联接状态并非一成不变, 而是不断地在来自外界 刺激的“调教”下进行修正、重塑。哺乳动物大脑中 绝大部分的神经元是维持一生的, 其主要的变化是 通过神经元之间相互联接的增多与改变[13-16], 即“神 经环路布线”(neural circuit wiring)和“神经环路精确化”(neural circuit refinement)。<\/span>
树突棘的数目和形状与兴奋性突触联接的多 少和强弱有很好的相关性。因此, 树突棘的形态分 析可作为检测兴奋性神经环路改变的重要指标。树 突棘的数目在出生后早期急速增加, 与早期发育过 程中神经元之间大量突触联接的形成相吻合[17]。有 趣的是, 在个体经由青春期逐渐进入成年期的过程 中, 树突棘的总数目显著减少, 即已形成的联接被 “修剪”, 使整个神经网络的联接更加优化和精确[17]。 这一“树突棘修剪”过程被认为是神经环路精确化的 体现, 对大脑的正常功能至关重要。在孤独症谱系 障碍、精神分裂症等发育性神经系统疾病中均发 现了树突棘修剪的异常以及突触大小和数目的改 变, 提示树突棘修剪异常可能是这些疾病的一个重 要病理改变[18]。然而, 关于什么分子机制调控了这 一修剪过程, 并在修剪过程中如何决定了树突棘的 不同命运——被修剪掉或得以存活——尚有很多未知。<\/span>

2 感觉经验依赖的协同树突棘修剪与成熟<\/strong>
小鼠的触须是一种非常发达的感觉器官。小 鼠的觅食、探索、感知危险以及其他日常活动都 有赖于其触须的感觉输入。在小鼠触须所对应 的大脑躯体感觉皮层桶状区域(barrel field of the somatosensory cortex, S1BF), 我们的研究发现, 第 2/3层锥体神经元基树突的树突棘密度在青少年期 出现逐渐下降的趋势, 同时剩余的树突棘形态趋于 成熟[19], 表示该脑区的树突棘修剪与成熟是协同发 生的。通过将小鼠长期饲养在有更多同伴、更多感 官与运动刺激的丰富环境中, 从而增加其自然感觉、 运动以及社会交往等输入[20-21], 我们发现, 丰富环境 饲养对S1BF的树突棘修剪和成熟均产生了加速的 作用, 使树突棘的修剪和成熟同时提前完成[19]。另 一方面, 我们通过剪除小鼠触须从而剥夺其触须感 觉输入, S1BF的树突棘修剪和成熟也被同时抑制 了[19]。这些结果提示, 发育过程中S1BF的树突棘修 剪和树突棘成熟是协同进行的, 并且受到来自触须 感觉经验的双向调控。我们进而推测, 树突棘的修 剪与成熟是由同一种竞争机制所介导: 相邻的树突 棘会竞争胞内的某种分子资源, 获胜的树突棘得以 存留下来并走向成熟, 而失败的一方则接受被修剪 的惩罚。<\/span>

3 Cadherin/catenin复合物介导树突棘的命运分化<\/strong>
树突棘之间竞争的分子资源到底是什么呢？ 基于对多种转基因小鼠树突棘密度随发育进程 变化的分析, 我们推测一类突触定位的细胞黏附 分子, cadherin/catenin细胞黏附复合物, 是介导这 一竞争的关键分子。Cadherin/catenin复合物定 位于突触前的递质释放区域与突触后致密带, 由 N-cadherin、β-catenin和αN-catenin三个主要成员组 成。N-cadherin是一类钙离子依赖的嗜同性单次跨 膜细胞黏附蛋白, 树突棘上的N-cadherin与轴突末 端的N-cadherin通过其胞外段的相互结合促进两者 的突触联接。在细胞膜内, N-cadherin的胞内段和 β-catenin、αN-catenin等蛋白形成复合体, 招募肌动 蛋白的聚集, 从而为树突棘的结构提供物理性的支 撑[22]。尤为重要的是, cadherin/catenin复合物能够响 应神经电活动发生上膜、内吞等变化[23-24], 并与谷 氨酸递质受体亚基GluA2直接相互作用, 从而将突 触前电活动输入的变化和突触后树突棘内细胞骨架 和递质受体的变化相互关联[25]。<\/span>
我们通过对体外培养的神经元进行活细胞成 像, 发现在单个树突棘上局部富集cadherin/catenin 复合物可以同时引起被操作树突棘的增大和相邻 树突棘的缩小或消失[19]。通过光遗传学手段激活 单个树突棘并与相邻未激活的树突棘进行比较, 发 现了类似的树突棘命运分化: 前者增大而后者被修 剪。这一过程依赖于两个树突棘之间的物理距离和 cadherin/catenin复合物在两个树突棘之间的重新分 布, 而不依赖于蛋白合成或降解。进一步说明, 两个 树突棘是对现存的cadherin/catenin分子进行竞争, 而 不是各自对其进行合成或降解[19]。<\/span>
通过结合小鼠基因操作和定点病毒注射, 在体 提高小鼠桶状皮层中部分树突棘的突触前cadherin/ catenin复合物水平, 我们发现, 在经历了正常修剪之 后, 这些树突棘更多的被保留下来, 并且形态更为成 熟, 而其邻近相对低黏附的树突棘则更多地被修剪 掉[19]。进一步的实验表明, 感觉经验对于树突棘修 剪和成熟的调控也依赖于cadherin/catenin复合物的 作用[19]。<\/span>

4 基于有限分子资源的竞争机制<\/strong>
在个体经由青春期向成年期转变的过程脑的功能趋于成熟, 神经环路的排布也经由树突棘 的修剪得到精确化。我们的研究显示, 在这一过程 中, 感觉经验带来的神经电活动输入驱使相邻的树 突棘竞争有限的cadherin/catenin复合物资源, 导致 cadherins和catenins的重新分配, 从接受较少电活动 的树突棘转移到更活跃的树突棘中, 从而同时导致 后者的成熟和前者的修剪。这一依赖于cadherin/ catenin复合物的竞争模型(图1)协同了树突棘的修剪 和成熟, 为神经环路精确化的特异性提供了亚细胞 层面和分子机制层面的解释。这一基于有限分子资 源的竞争机制印证了那条“用之或弃之”的神经科学 基本概念, 拓展了我们对于神经环路精确化和大脑 可塑性的理解, 并且很可能代表了生物系统传统的 一种普遍策略。基于树突棘修剪异常与孤独症、精 神分裂症等发育性神经系统疾病的密切关联, 我们 的研究结果为解析这些发育性神经系统疾病的发病 机理提供了新的视角。<\/span>

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A: 小鼠触须接受到的感觉刺激传入到躯体感觉皮层神经元(虚线为其传导途径); B: 躯体感觉皮层桶状区域第2/3层锥体神经元的树突棘示例; C: 躯体感觉皮层神经元树突棘数目在正常(绿色)和修剪缺陷(灰色)情况下随年龄变化的趋势; D: cadherin/catenin复合物介导树突棘修剪的竞争 模型: 由感觉经验所带来的神经电活动增强导致相邻树突棘之间相互竞争胞内的cadherin/catenin复合物, 这一竞争导致后者在树突棘之间的重 新分布, 即获得cadherin/catenin复合物较多的树突棘得以存留、成熟, 而失去该复合物的树突棘则被修剪。
A: mice receive sensory stimuli through their whiskers and send the information to neurons in the somatosensory cortex (along pathways marked by the dotted lines); B: an example image showing spines on the basal dendrites of layer 2/3 pyramidal neurons in the barrel field of the mouse somatosensory cortex; C: dynamic changes in spine number in neurons of the somatosensory cortex during normal development or in diseases with pruning defects; D: a competition-based model for cadherin/catenin-mediated spine pruning. The increase of neural activity induced by sensory experience leads to interspine competition for intracellular cadherin/catenin complexes, resulting in the redistribution of these complexes in individual spines: the winner spine getting more cadherin/catenin complexes matures, while the loser spine losing the complexes is destabilized and pruned.
图1 Cadherin/catenin复合物介导树突棘的协同修剪与成熟(根据参考文献[19]修改)
Fig.1 Cadherin/catenin complex mediates coordinated spine pruning and maturation (modified from reference [19])<\/p>


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参考文献 (References)<\/strong>
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于翔, 中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员。1995年毕 业于英国剑桥大学三一学院自然科学(生物化学)专业; 1999年获英国剑桥大学分子生物学专业博士学位; 1999–2005年, 在美国斯坦福大学医学院从事博士后研究。自2005年任中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员、研究组组长、博士生导师。<\/span><\/p>","cshort2":"

树突棘是中枢神经系统中绝大多数兴奋性突触的突触后位点。在出生后早期, 脑内 树突棘大量形成; 当个体进入青少年期, 脑内树突棘总数逐渐减少, 这一过程被称为树突棘修剪, 并 被认为是神经环路精确化的重要过程。在孤独症谱系障碍、精神分裂症等发育性神经系统疾病中 被报道存在树突棘修剪的异常。虽然树突棘修剪的现象已被广泛描述, 然而介导该过程的分子机 制尚待进一步研究。该研究组近期工作发现, 在小鼠触须所对应的感觉皮层, 树突棘的修剪与成熟 是协同发生的, 并且受感觉经验的双向调控。进一步研究发现, 神经电活动可以引起相邻树突棘对 cadherin/catenin细胞黏附复合物的竞争, 导致该复合物的重新分布, 并使这两个树突棘的命运产生 分化: 得到cadherin/catenin复合物的树突棘变得更加成熟而相邻失去这些分子的树突棘变小或被 修剪。这一cadherin/catenin复合物依赖的竞争机制为树突棘的协同成熟与修剪提供了特异性, 对于 理解介导神经环路精确化的机制至关重要。<\/span><\/p>","ctitle":"竞争机制介导树突棘的协同修剪与成熟","listseq":35,"seqno":"25","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-17-13-631"},{"caddress1":"(1中国科学院上海药物研究所, 新药研究国家重点实验室, 上海 201203; 2复旦大学生物医学研究院, 上海 200032)","cauthor":"卢俊彦1<\/sup> 胡璐璐2<\/sup> 程净东2<\/sup> 王 晨1<\/sup> 徐彦辉2*<\/sup> 罗 成1*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":4,"clong1":"

表观遗传(epigenetics)通常指在DNA序列不 发生改变的情况下, 基因表达发生了可遗传的变 化。表观遗传的主要分子机制包括: DNA修饰(DNA modification)、RNA干扰(RNA interference)、组 蛋白变体(histone variant)以及组蛋白修饰(histone modification)。其中, DNA甲基化修饰是最基本也 是目前研究最为深入的一种表观遗传修饰。DNA 甲基化修饰参与生物体多种重要的生理过程, 如胚 胎发育、X染色体沉默以及基因组印记等[1-2]。哺 乳动物体内的DNA甲基化通常发生于CpG二核苷 酸中胞嘧啶的五位碳原子上, 形成5-甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine, 5mC)。CpG二核苷酸在基因组 中呈不对称分布, 富含CpG的区域被称为CpG岛。 在人类基因组中, 大约60%的基因启动子区存在于CpG岛。基因启动子区CpG岛的甲基化, 可以使得 染色质结构变得更为紧密, 从而直接导致基因转录 活性降低。此外, 还存在一些包含甲基化CpG结合 结构域(methylation CpG binding domain, MBD)的蛋 白质, 可特异识别基因组中甲基化的DNA, 并招募 其他表观遗传修饰酶或染色质重塑因子(chromatin remodeling factors), 间接导致转录活性的降低[3]。在 真核细胞中, 特别是高等生物体内, 甲基化和非甲基 化基因的转录活性可相差达106倍。高度甲基化的 基因, 如女性两条X染色体其中一条X染色体上的基 因, 常处于失活状态; 而一直处于活性转录状态的管 家基因则始终保持低水平的甲基化[4-6]。DNA甲基 化的异常也与多种疾病(尤其是肿瘤)有着密切的联 系。抑癌基因的过度甲基化或原癌基因的甲基化不足, 可导致抑癌基因的沉默与原癌基因的激活, 从而 促进肿瘤的发生、发展[7]。<\/span>

DNA甲基化修饰主要由两大类DNA甲基转移 酶(DNA methyltransferases)负责: 维持性DNA甲基 转移酶—DMNT1(DNA methyltransferases 1)和从 头DNA甲基转移酶—DMNT3a、DMNT3b。作为 DNA甲基化修饰的逆过程(DNA的去甲基化修饰) 在相当长的时间内被认为是一种被动的过程, 即在 DNA多轮复制的过程中甲基化修饰会逐渐丢失。直 到最近几年, 一批在DNA主动去甲基化过程中扮演 关键作用的酶被相继发现, 人们才开始认识到DNA 主动去甲基化过程在表观遗传调控中发挥的重要作 用。这些酶主要包括: 活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶 (activation induced cytidine deaminase, AID)、TET 家族蛋白质以及胸腺DNA糖苷酶(thymine-DNA glycosylase, TDG)[8-11]。这其中, TET家族蛋白质是 最为年轻的一个成员, 在2009年才被发现[12]。但由 于TET家族蛋白质在胚胎发育和肿瘤生物学中扮演 的重要角色, 已经成为表观遗传领域的研究热点。<\/span>

TET家族蛋白质均属于铁酮戊二酸依赖的 双加氧酶超家族, 其主要生理功能是催化5-甲基 胞嘧啶(5mC)中甲基的氧化, 生成5-羟甲基胞嘧啶 (5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)[13-15]。有报道表 明, 小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)以及诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)中广泛存在的5hmC标记主要来源 就是TET(ten-eleven translocation)蛋白质催化5mC 的氧化[13-15]。与DNA的甲基化修饰不同, DNA的羟 甲基化修饰主要参与了基因表达激活。TET蛋白 质可以进一步以5hmC为底物, 将其连续氧化生成5- 醛基胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)和5-羧基胞嘧啶 (5-carboxylcytosine, 5caC)[15]。而这两种5hmC的氧 化产物可以被TDG特异性识别并进行剪切。在碱基 切除修复(base excision repair)的机制作用下, 最终完 成DNA主动去甲基化的过程[8]。<\/span>

尽管TET蛋白质在DNA主动去甲基化过程中 的作用已被广泛认可, 然而越来越多的证据表明, TET蛋白质催化产生的5hmC不仅仅只是一个DNA 去甲基化过程的中间产物。近年来, 多种特异性 的5hmC结合蛋白相继被发现[16-17]; 同时, 研究发现, 5hmC标记同5mC一样, 可以在长期稳定的基因组中 存在[18]。因而, 5hmC可能作为一种新的、稳定的表观遗传标记, 直接参与基因转录调控, 而无需依赖 DNA去甲基化过程。由此也可见, TET蛋白质在转 录调控中扮演的重要角色。而TET蛋白质是如何在 DNA去甲基化过程以及保持5hmC稳定之间保持平 衡的呢？根据之前的文献报道以及我们的生化实 验结果发现, 虽然TET蛋白质可以催化5mC连续氧 化生成5hmC、5fC以及5caC, 其每一步的催化效率 并不相同。人类TET1/2蛋白质、小鼠Tet2蛋白质以 及线虫中的NgTet更容易催化5mC生成5hmC, 而催 化5hmC生成5fC以及进一步催化5fC生成5caC的能 力则较弱[19-21]。这一特性可能决定了TET蛋白质在 通常情况下倾向于仅将5mC催化产生5hmC, 只有当 TET蛋白质在基因组某一区域明显富集时, 才能显 著地将5mC连续氧化为5fC和5caC, 介导DNA的去 甲基化过程。由于TET蛋白质对于底物的偏好性可 能与其生理功能有着密切的联系, 我们对TET蛋白 质底物偏好性的机制产生了兴趣。<\/span>

通过多种生物化学实验手段, 如荧光偏振 (fluorescence polarization, FP)以及表面等离子共振 (Surface plasmon resonance, SPR)等, 我们发现, TET 蛋白质与包含不同碱基(5mC、5hmC和5fC)的底物 DNA片段的结合能力并没有显著差异, 说明TET蛋 白质的底物偏好性不大可能来自于其对底物结合 能力的差异。同时, 我们还获得了TET蛋白家族的 一个重要成员TET2及其与不同底物结合的晶体结 构(图1A)。复合物晶体结构也显示, TET2与5mC、 5hmC和5fC的结合模式基本相同, 说明TET2催化 口袋也可适应不同底物碱基的结合。但是, 我们 发现, 在TET2的催化中心, 参与反应的碱基上5-位 修饰基团取向在不同的复合物结构中略有不同(图 1A~图1C)。因此, 我们猜测, TET2对于底物碱基催 化效率的差异是否来源于催化过程中底物5-位修 饰基团取向不同所导致的催化能垒的差异？由于 TET蛋白质属于铁酮戊二酸依赖的双加氧酶超家 族, 因而TET蛋白质与其他铁酮戊二酸依赖的双 加氧酶家族成员, 如负责烷基化碱基修复的AlkB蛋 白、胸腺嘧啶双加氧酶(thymine dioxygenase)以及组 蛋白去甲基化酶(jumonji domain-containing histone demethylases, JMJD)家族等, 可能具有相似的催化机 制[22]。有研究表明, TET涉及的催化机制较为复杂, 至少涉及脱羧反应(decarboxylation)、氧桥异裂(O-O heterolysis)、氢抽提(hydrogen abstraction)以及羟基再结合(hydroxyl rebind)这四步连续反应, 还涉及众 多的反应中间体(图1D)。因而, 仅采用实验方法难 以直接对每步反应的效率进行测量。<\/span>

于是, 我们从理论模拟出发, 采用了量子力学/ 分子力学(QM/MM)混合模拟的手段[23], 分别计算 了TET2催化5mC、5hmC和5fC每一步反应的能垒。 根据计算结果显示, 整个反应循环中的第三步(氢抽 提反应)所需要跨越的能垒最高, 因此认为, 氢抽提 反应是TET2催化底物氧化的限速步骤。同时我们 发现, TET2催化不同底物氧化的前两步反应的能垒 均较低且没有明显的差异, 而催化氢抽提反应的能 垒则是5mC>5hmC>5fC(图2A)。根据过渡态理论 (transition state theory), 能垒越高, 反应速率越慢[24], 因而TET2催化不同底物氢抽提反应的能垒大小与 实验测得的反应速率相一致。同时, 通过对模拟得 到的中间体结构进行分析, 我们发现, 氢抽提反应的能垒差异可能主要来源于不同底物在反应中间体时 取向不同, 即为5mC甲基上氢的朝向更适合反应, 而 5fC和5hmC上的氢更加远离反应中心, 不适合氢抽 提反应的进行。<\/span>

进一步, 我们采用生化实验手段对理论模拟结 果进行了验证。根据氢抽提反应的原理, 在反应进 行前, 需要产生一个活性的高价铁氧中间体— Fe(IV)=O。这一中间体具有很高的反应活性, 可夺 取底物上氢原子, 使底物的C-H键断裂。根据反应 机理, 我们首先将5mC上的氢原子(H1)采用其同位 素氘(H2)代替, 进行酶活性测试。根据同位素动力 学效应(kinetic isotope effect), 用H2代替H1会使氢抽 提反应的速率显著降低, 若氢抽提为反应的限速步 骤, 则5mC的催化效率也会显著降低[25]。与预测相 吻合的是, TET2催化被H2置换的5mC的效率显著降 低, 说明氢抽提这一步骤的确是整个TET2催化循环的限速步骤(图2B)。为验证TET2催化不同底物氢 抽提反应的效率是否有差异, 我们接下来采用停流 光谱法(stopped-flow spectroscopy)检测整个反应过 程中Fe(IV)=O基团存在的时间。由于Fe(IV)=O基 团在318 nm处有特异性吸收信号, 若该信号持续的 时间长, 则说明Fe(IV)=O消耗速率慢, 氢抽提反应效 率低。同样, 与预测结果相吻合的是, 5fC在318 nm 处吸收信号最强且持续的时间最长, 5hmC次之, 而 5mC的吸收信号最弱、持续时间最短, 说明氢抽提 反应的效率的确是5mC最高而5fC最低。<\/span>

这一研究首次揭示了TET蛋白质对其三种底物 的不同催化活性的分子机制, 阐明了TET蛋白质底 物偏好性原理, 为基因组中5-羟甲基胞嘧啶稳定存 在提供了分子水平的解释。此发现解决了困扰表观 遗传学领域的一个难题, 也为研究其他蛋白质逐步 催化反应的分子机制提供了新思路和新方法。该 研究论文(“Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation”, 晶体结构揭示TET蛋白 介导的氧化反应底物偏好性机制)于2015年10月29 日在线发表于国际顶级学术期刊《自然》[21]。此外,由于目前还未见TET家族蛋白质选择性小分子调控 剂的报道, 针对TET蛋白质结构和催化机制的研究, 也有助于基于结构和基于机理的TET小分子调控 剂的发现。目前, 通过结合计算机辅助药物设计和 酶活性测试, 我们已经获得了一批极具潜力的针对 TET蛋白质的小分子抑制剂。对这些小分子化合物 的进一步确证、优化和改造将有希望为TET家族蛋 白质的化学生物学研究和靶向TET家族蛋白质的药 物设计研究提供优良的工具分子和先导化合物。<\/span><\/p>


A: QM/MM计算发现, TET2催化5mC发生氢抽提反应的能垒最低而催化5fC的能垒最高; B: 同位素动力学效应实验显示, 氢抽提反应为TET2催 化循环限速步骤; C: 停流光谱实验通过检测Fe(IV)=O在318 nm处的信号, 证实5mC氢抽提反应速率最快而5fC速率最慢。
A: QM/MM calculations indicated the barrier for the hydrogen abstraction reaction of 5mC was the lowest while the barrier for 5fC was the highest; B: kinetic isotope effect suggested the hydrogen abstraction was the rate-limiting step in the catalytic cycle of TET2; C: through monitoring the signaling of absorption at 318 nm, the stopped-flow spectroscopy experiments validated that the hydrogen abstraction rate for 5mC was the highest while the abstraction rate for 5fC was the lowest.
图2 TET2底物偏好性分子机制的探索(根据参考文献[21]修改)
Fig.2 Molecular mechanism for the substrate preference for TET2 (modified from reference [21])<\/p>


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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-48-55-667.jpg","cshort":"

罗成博士, 中国科学院上海药物研究所研究员, 博士生导师。1994年本科毕业于福州大学化学系, 2001年毕业于复旦大学化学系, 获得物理化学硕士学位(主修金属表面催化与量子化学)。2004年毕业于中国科学院上海药物研究所, 获有机化学博士学位(主修药物设计与药物化学);<\/span><\/p>","cshort2":"

罗成博士, 中国科学院上海药物研究所研究员, 博士生导师。1994年本科毕业于福州大学化学系, 2001年毕业于复旦大学化学系, 获得物理化学硕士学位(主修金属表面催化与量子化学)。2004年毕业于中国科学院上海药物研 究所, 获有机化学博士学位(主修药物设计与药物化学); 2005年起赴美国宾夕法尼亚大学Wistar研究所著名表观遗传结构生物学家Ronen Marmorstein 教授实验室从事表观遗传修饰酶的化学生物学研究。2008年3月至今, 工作于中国科学院上海药物研究所。罗成研究员基于理论模拟策略, 结合药物化学、结构生物学和化学生物学等实验验证手段, 针对重大疾病或通路 (特别是表观遗传修饰酶和蛋白质蛋白质相互作用)开展创新药物靶标及 其先导化合物的发现、确证与重要功能蛋白质动态调控机理研究, 揭示了多个重要靶标的调控机制; 发现一批具有开发前景的先导化合物(五类以上 为该酶世界首次发现: 包括铜伴侣蛋白抑制剂DC-AC50、RNA去甲基化酶 FTO抑制剂、靶向核抗原EBNA1/DNA作用界面抑制剂等); 两个候选化合物进入了系统的临床前评价。共发表SCI论文120余篇, 其中近5年以通讯或 第一作者身份(含共同通讯或第一)在Nature、Nature Chem、Cell Res、Adv Mater、J Am Chem Soc、Proc Natl Acad Sci USA、Nucleic Acid Res、Cancer Res<\/em>和J Med Chem<\/em>等著名杂志发表SCI论文近60篇。已发表的研究成果曾两次作为中国科学院研究重大进展入选《中国科学院院刊》封面报道, 申请新化学实体专利16项(美国专利一项、PCT两项), 获得授权专利四项, 部分 专利已经实现转让。<\/span><\/p>","ctitle":"阐明TET家族蛋白质底物偏好性机制","listseq":36,"seqno":"24","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-16-37-281"},{"caddress1":"(1清华大学–北京大学生命科学联合中心, 清华大学生命科学学院, 结构生物学中心,教育部蛋白质科学重点实验室, 北京 100084; 2中国科学院遗传与发育生物学研究所,分子发育生物学国家重点实验室, 北京 100101; 3郑州大学化学与分子工程学学院, 郑州 450001)","cauthor":"王继纵1#<\/sup> 李红菊2#<\/sup> 韩志富1<\/sup> 张贺桥1<\/sup>王 童2<\/sup> 林光忠1<\/sup> 常俊标3<\/sup> 杨维才2*<\/sup> 柴继杰1*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":8,"clong1":"

1 植物肽类激素及其受体<\/strong>
植物经典激素都是小分子化合物并且对植物 生理活动具有广泛而重要的调控作用[1]。但最近十 几年的研究表明, 植物肽类激素同植物经典激素一 样, 调节着植物体的生长、发育、免疫和抗逆等生 理活动[2]。自从1991年番茄系统素作为第一个植物 肽类激素被发现之后[3], 很多植物肽类激素被陆续 鉴定。目前, 植物肽类激素根据其序列特点可以分 为两大类: 一类是小的带有翻译后修饰的肽类激素, 它们是前体肽激素经过翻译后剪切并加以磺酸化、 羟基化和糖基化等修饰产生的小肽段; 另一类是富 含半胱氨酸的多肽激素, 它们是含有多对分子内二 硫键、有高级结构的小蛋白[4-5]。肽类激素不能自由 跨膜运输, 因此需要位于细胞膜表面的特异性受体来进行信号转导。目前的研究表明, 植物肽类激素 受体都是受体激酶(receptor-like kinases, RLKs)或者 受体蛋白(receptor-like proteins, RLPs), 从结构域组 成看, RLKs含有一个胞外配体结合结构域、一个单 次跨膜结构域和一个胞内激酶结构域, 而RLPs缺少 胞内激酶结构域[6]。植物磺化肽激素(phytosulfokine, PSK)是1996年被发现和研究的一种含两个酪氨酸 磺化修饰的五肽激素[Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)- Thr-Gln][7]。后续的研究表明, 它在植物的生长发育、 抗逆和先天免疫等方面有广泛调控作用[8-9]。PSK发 挥活性是通过与细胞膜上的受体激酶–植物磺化肽 激素受体(phytosulfokine receptor, PSKR)结合来发挥 功能的[10-12]。但PSK如何结合受体PSKR以及后续的 PSK-PSKR识别复合物如何招募共受体成员来激活PSK信号通路的分子机制还需要阐明。<\/span>

2 PSK被受体PSKR识别的分子机制<\/strong>
根据已知的PSK-PSKR的配体–受体关系, 我 们利用结构生物学的方法成功解析受体PSKR胞外 区(PSKRLRR)结合PSK的复合物结构(图1A)。根据 结构我们清楚地看到, PSK主要与PSKR岛区(PSKR island domain, PSKRID)互作, 本来线性的多肽也因 为与受体互作而形成一个反向的β片层二级结构, 夹 在PSKRLRR内侧和PSKRID之间形成类似“三明治”结 构。PSK的两个磺酸根通过与受体PSKR的直接互 作来加强PSKR对PSK的识别。基于结构的观察, 我 们设计了PSKR结合PSK关键氨基酸位点的突变分 析实验, 进一步通过微量热泳动体外亲和力测定实 验和体内遗传互补实验, 我们验证了这些氨基酸位 点对于PSK识别的重要性, 从而具体阐释了PSK被 受体PSKR识别的分子机制。<\/span>

3 PSKR受体激活的新机制<\/strong>
虽然有关PSK生理学功能的研究已经取得相 当多的进展, 但对于PSK结合PSKR之后如何激活 PSKR受体的研究依旧处于空白。体细胞胚胎发 育受体激酶(somatic embryogenesis receptor kinase, SERK)家族成员作为共受体参与植物受体激酶的激 活已经在油菜素内酯受体1(brassinolide insensitive 1, BRI1)和鞭毛蛋白受体2(flagellin-sensitive 2, FLS2)被广泛证明[13-14], 且相关的激活复合物结构也被我 们成功地解析并报道[15-17]。基于对这些受体激酶结 构的深入分析和理解, 加上已知文献报道的PSKR同 BRI1属于同一受体激酶家族[6]和PSK能促进体细胞 胚胎发育的生理学表型[18]同SERK功能相似的事实, 我们提出SERK家族成员可能作为共受体参与PSKR 的受体激活。首先, 我们利用体外生化重组的实验 成功组装了PSK-PSKRLRR-SERKLRR三元复合物, 从 而初步证明了我们的假设。然后, 通过与中国科学 院遗传与发育研究所杨维才研究员研究组合作, 利 用植物体内生化和遗传学的方法, 最终证明了SERK 家族成员参与肽激素PSK介导的信号转导通路。这 是利用结构生物学指导发现信号转导通路新成分的 成功案例。<\/span>

之后经过大量结晶尝试, 我们成功解析了PSKPSKRLRR- SERKLRR三元激活复合物的晶体学结构(图 1B)。SERK主要通过其N-端的loop区域同PSKR的 岛区互作以及通过SERKLRR内侧β片层同PSKRLRR的 C-端内侧β片层互作来结合到PSK-PSKRLRR复合物 上形成激活复合物。但是该受体激活复合物的最突 出特点是, 配体PSK完全不参与同共受体SERK的结 合, 这似乎与“PSK介导的PSKR与SERK的互作”的 结论矛盾。为了解决这个矛盾, 我们进一步解析单 独的PSKR结构并与PSK结合的PSKR结构进行对比 分析(图1C), 发现了PSK通过诱导原本无序的受体 PSKR岛区产生与共受体SERK结合的有序新界面从而别构激活受体PSKR的新机制。<\/span><\/p>


A: PSK-PSKRLRR识别复合物结构; B: PSK-PSKRLRR-SERKLRR激活复合物结构; C: 单独的PSKRLRR和结合PSK的PSKRLRR结构比较。 A: overall structure of PSK-PSKRLRR recognition complex; B: overall structure of PSK-PSKRLRR-SERKLRR activation complex; C: structural comparison of free PSKRLRR and PSK-bound PSKRLRR.
图1 植物磺化肽激素PSK的分子作用机制(根据参考文献[19]修改)
Fig.1 The molecular mechanism of phytosulfokine (modified from reference [19])<\/p>

4 未来的研究方向和应用<\/strong>
磺酸化修饰是植物肽类激素的一种常见的翻 译后修饰, 我们的研究首次揭示磺酸化修饰对于配 体–受体结合的分子学功能。PSKR也是继BRI1之后 第二个被解析的以岛区结合配体的植物受体激酶, 印证了BRI1的岛区识别理论[20-21], 但PSK的结合对 PSKR岛区的构象改变更加剧烈并产生规则的结构 域, 且该结构域将介导后续的共受体SERK结合, 这 一点丰富了植物受体激酶岛区的功能。PSK-PSKRSERK 激活复合物是第一个植物肽类激素的激活复 合物结构, 为其他植物肽类信号的受体激酶活化提 供思路, 并进一步推广了植物受体激酶异元二聚化 的活化模式和SERK家族的信号枢纽功能, 同时也为 PSK信号通路更多下游成分的鉴定提供线索, 为其 他含有类似PSKR岛区的受体蛋白家族的激活分子 机制提供暗示[22]。我们的研究从结构角度首次揭示 配体通过别构诱导受体构象变化来介导受体与共受 体互作的受体激活模式, 区别于BRI1和FLS2通过配 体的“胶联”作用结合共受体[15-16,23]的这一类似于植 物经典激素受体活化的“分子胶”模式。另外, 基于 PSK受体结构的PSK类似物的研发可用于提高作物 产量的生长添加剂, 具有重要的实际应用意义。<\/span>


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参考文献 (References)<\/strong>
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23 Santiago J, Henzler C, Hothorn M. Molecular mechanism for plant steroid receptor activation by somatic embryogenesis coreceptor kinases. Science 2013; 341(6148): 889-92.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-42-09-665.jpg","cshort":"

柴继杰, 博士生导师, 清华大学生命科学学院教授。1997年毕业于中国协和医科大学药物研究所, 获博士学位; 1999~2004年于美国普林斯顿大学做博士后研究工作; 2004~2009年任北京生命科学研究所实验室主任; 2009年至今在清华大学生命科学学院任教授。<\/span><\/p>","cshort2":"

柴继杰, 博士生导师, 清华大学生命科学学院教授。1997年毕业于中国协和医科大学药物研究所, 获博士学位; 1999~2004年于美国普林斯顿大学做博士后研究工作; 2004~2009年任北京生命科学研究所实验室主任; 2009年至今在清华大学生命科学学院任教授。中国晶体学会理事, 中国生物化学、分子生物学会蛋白质学专业委员会成员。2004年建立独立实验室以来, 柴继杰研究组长期从事具有重要生物学意义的蛋白质晶 体结构研究, 解析了许多重要的结构, 作为通讯作者在Nature、Science、Nat Struct Mol Biol、Nat Neuro Sci、Mol Cell、Structure、Plant Cell、Cell Host Microbe、Cell Res<\/em>等国际高影响力著名学术期刊上发表学术论文23篇, 尤其在植物受体激酶的研究方面作出了出色的成绩。该实验室近几年解析了 BRI1LRR-BL-BAK1LRR、FLS2LRR-flg22-BAK1LRR、AtCERK1-chitin 等许多植物重要受体激酶复合物结构。课题组近期在Nature<\/em>上发表论文报道 了植物重要受体激酶植物磺化肽激素受体(phytosulfokine receptor, PSKR)激活复合物结构, 揭示了植物磺化肽激素(phytosulfokine, PSK)的识别和受体激 活分子机理(Wang et al. Nature<\/em> 2015)。<\/span><\/p>","ctitle":"植物肽激素受体激活的新机制","listseq":37,"seqno":"23","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-15-26-707"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所神经科学国家重点实验室,中国科学院脑科学卓越创新中心, 上海 200031)","cauthor":"李 霄 仇子龙*","cintpic":"","clicktime":9,"clong1":"

在普罗大众的印象中, 自闭症像是一种性格标 签, 可以不吝惜地贴在了那些不善社交、少与别人 交流、性情内向的人的身上。然而对于医学和神经 科学相关的专业人士而言, 自闭症却并不是一张意 如其名的标签, 能够轻易地贴出来。 自闭症的首次临床定义是在20世纪40年代由 美国医生Kanner提出的(图1A)[1], 经过几十年来的发 展, 专业领域一般认为, 自闭症(autism)是一类广泛 性的神经系统发育性疾病[2], 包括: 瑞特综合征(Rett syndrome)、阿斯伯格综合征(Asperger syndrome)、 童年瓦解性障碍等病症。由于是发育性疾病, 所以 患者从婴幼年便开始发病[3], 主要的病因则是会影 响到发育过程的遗传、免疫、孕期理化因子刺激 等因素。患者的临床表现主要在: (1)对父母不产生 依恋, 不能与同龄儿童建立伙伴关系等此类社会交 往行为的障碍[4]; (2)无法用动作表达自己意愿, 语言 运用和理解能力缺失等此类交流性障碍[5]; (3)无法 对玩具感兴趣, 重复蹦跳、重复机械性动作等此类兴趣缺失及重复刻板性行为[6], 另有少量病患出现 癫痫、智力低下、个体发育迟缓等较严重病症(图 1B)。<\/span>
<\/p>


图1 首次对自闭症做出临床定义的Kanner医生(A)及自闭症患者的临床表型(B)
Fig.1 Doctor Kanner who made clinical definition of autism for the first time (A) and clinical phenotype in autism patients (B)<\/p>

近几十年来, 随着生命科学的日新月异, 对于 自闭症的研究和理解也越来越深入, 从早期的临床 病理层面, 逐步深入到细胞以及分子的病理层面, 使得人们对于自闭症的发生、病程进展以及治疗有 了更全面和精细的了解。目前的研究结果显示, 自 闭症并不是神经系统严重的、明显的损伤, 而与神 经系统的发育过程以及功能具有相关性, 其中最重 要的则是与神经突触功能与调节息息相关[7]。对于 神经系统而言, 神经元是此系统的核心, 也是最基 本的功能单位。神经元彼此之间相互连接才能顺畅 地传递神经信号, 完成最基本的神经功能。而神经 元彼此之间的连接阵列, 构成了行使高级神经活动 的基础。在此, 神经元间相互连接的界面被称为神 经突触[8-10], 由此可以理解突触对于神经系统的重要 性。有趣的是, 神经元间的连接并不是静态的, 而 是一直处于动态变化当中, 旧的不需要的突触消失, 新的突触又形成, 在这个此消彼长的过程中, 消失 与形成却不是随机的, 而是处于精密的调控机制操 纵之下[11-15]。那些与突触这个微小却又重要的结构以及调控这个结构消亡产生相关的生命源代码—— 基因, 毫无疑问, 也与自闭症有着密切而重要的联系 (图2)。<\/span>

在这些相关的基因中, 一个名叫甲基化CpG岛 结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2, MECP2) 的基因, 以其有趣的特征吸引了研究者们的注意。 MECP2基因编码一种甲基化DNA结合蛋白, 它虽然 不直接参与到神经突的结构和功能中, 但却可以通 过结合DNA的甲基化CpG岛或是招募转录因子来操 纵与神经突触功能及调控相关基因的表达[16-19], 从 而间接地对神经功能造成影响。当MECP2基因因 突变或者缺失丧失功能时, 可导致Rett syndrome此 类自闭症[20]; 而当MECP2由于复制异常而导致拷贝 数增多时, 却又会导致另一类被称为MECP2倍增综 合征(MECP2 duplication syndrome)的自闭症[21]。由 此可见, 体内MECP2这个基因的表达量如同一座天 平, 必须保持着精妙的平衡, 无论过多或者过少, 都 会引起神经突触及神经系统功能的异常, 从而导致 自闭症(图3)。<\/span>
<\/p>


<\/p>


然而, 仅仅知道了遗传背景和分子机制, 对于 治疗自闭症还是远远不够的。如何为发病过程提供 一个观察窗口以及为治疗方案提供一个测试平台也是非常重要的。近年来, 基因编辑技术及模式动物 的发展对此提供了非常有利的条件。现有的研究结 果已经报道了MECP2基因敲除的小鼠模型, 该模型 的确展现出与瑞特综合征非常相似的表型, 为瑞特 综合征的观察和治疗提供了便利; 同时, MECP2转基 因(过表达)的小鼠模型也同样已得到建立, 该模型也 展现出明显的社交功能障碍。但自闭症毕竟涉及多 种复杂的高级神经活动, 如果要为临床研究与治疗 提供更为有力的支持, 小鼠已显得捉襟见肘, 更高级的动物模型和更复杂的神经系统是非常必要的[22-23]。<\/span>

为了解决这个问题, 中国科学院上海生命科学 研究院神经科学研究所的仇子龙研究组和苏州灵长 类平台通过使用慢病毒载体侵染带入外源基因的方 法(图4A), 成功地建立了在神经系统中特异性过表 达MECP2基因的转基因食蟹猴模型(图4B)。通过分 子生物学和生物化学方法的鉴定, 外源的MECP2基 因有效地插入了食蟹猴的基因组中(图4C), 并且能 够只在神经系统中进行表达。<\/span>

遗传学层面的操作已经成功, 种子既已种下, 会在食蟹猴这一非人灵长类动物的土壤中结出怎样 的果实呢？转基因食蟹猴相对于野生型的对照食蟹 猴又会展现出怎样的不同呢？带着这样的疑问, 研 究人员们对此模型进行了长期的体征观察和大量的 行为学测试, 结果是非常有趣的。在体征观察与记 录中, MECP2转基因食蟹猴表现出明显的体重发育 迟缓以及血浆中脂肪酸代谢的异常, 这两种表型也 见于对MECP2倍增综合症患者的临床表现的报道 中。而在行为方面, 对单只食蟹猴进行行动路线追 踪的结果显示, 转基因食蟹猴会花费更多的时间在 一种刻板的重复性路径行进上(图4D)。而当人为的 给予转基因食蟹猴威胁性刺激时[24], 相对于野生型对照, 该型食蟹猴会表现出更强烈的焦虑情绪与敌 意。在最为重要社交行为及能力方面, 研究人员发现, 无论是在社群内的社交行为(图4E)还是与另一只配 对的社交行为, 转基因食蟹猴的社交频率统计结果 均显著的低于野生型对照(图4F), 该结果对于评估 MECP2转基因食蟹猴的类自闭症表型具有重要的意 义。在此之后, 研究人员又通过威斯康星通用仪器 测试对转基因食蟹猴的学习能力进行了评估[25-26], 在 该项实验中, 转基因食蟹猴并没有表现出明显的学 习障碍, 但却出现了被认为是自闭症表征的重复刻板行为。<\/span><\/p>


A: 病毒载体中外源转基因片段的设计方案; B: 在母亲照看下的新生F0代转基因食蟹猴; C: 深度测序得到的转基因插入位点的全基因组 Mapping; D: 行动路线追踪结果示意及重复路径时间结果统计, P<0.05; E: 社群内社交行为检测的行为学范式; F: F0代配对社交行为测试的结 果; G: 新生的F1代转基因食蟹猴; H: F1代配对社交行为测试结果。 A: lentiviral expression cassette; B: image of newborn MECP2 transgenic monkey; C: gemome-wide distribution of transgenes in F0 TG monkeys; D: alterations in locomotion activity, P<0.05; E: paradigm of social test within group; F: interaction time of social test within pair of F0; G: image of newborn F1 MECP2 transgenic monkey; H: interaction time of social test within pair of F1.
图4 携带人类MECP2基因的转基因后表现类自闭症症状(根据参考文献[29]修改)
Fig.4 Transgenic monkeys carrying human MECP2 gene exhibit autism-like phenotypes (modified from reference [29])<\/p>

在自闭症中, 遗传是一项重要因素, 而作为致病 基因已明确的MECP2倍增综合征, 遗传影响的重要 性不言而喻。为了深入地研究此问题, 研究人员将转 基因食蟹猴的精巢组织移植至裸鼠皮下并使用激素 促进成熟, 成功地在短期内得到了原代转基因食蟹 猴(F0)的子代猴(F1)(图4G)[27], 经过遗传学检测, 研究 人员们发现, F0代转基因食蟹猴基因组中的外源插 入片段的位点, 通过种系传递[28], 遗传至F1代子猴的 基因组中[28], 并且F1代子猴中位点的分布与F0代比 较, 呈现出典型的孟德尔分离现象。此结果显示, F1 子代猴从亲代F0身上遗传到了神经系统中特异性过 表达MECP2的特性, 并且针对于F1的配对社交行为 检测结果也显示, 转基因食蟹猴相较于野生型对照 也展现出社交行为频率的显著下降(图4H), 该表型 与F0亲代猴以及自闭症患者的临床表型是相似的。<\/span>

综合以上的结果, 在该项目中, 仇子龙研究组 与苏州灵长类平台成功地建立了神经系统特异性 表达MECP2的转基因食蟹猴模型, 且该转基因可以 通过种系传递向子代进行遗传。无论是F0还是F1, MECP2的异常表达都导致了转基因食蟹猴出现明显 的类自闭症行为, 简而言之, 作为与人类亲缘关系很 近的猴子患上了自闭症。该项工作为观察自闭症的 病程进展提供了一扇很好的窗口, 并为之后进一步 研究自闭症的机制提供了坚实的基础, 也为自闭症 的临床治疗提供了良好的动物模型和试验平台。<\/span>
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参考文献 (References)<\/strong>
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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-39-30-902.jpg","cshort":"

仇子龙, 现任中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员、博 士生导师。1998年毕业于上海交通大学生物科学与技术系, 2003年在中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所获得博士学位, 2003至2009年在美国加州大学圣迭戈分校神经生物学系从事博士后研究, 2009年7月受聘中国科学院上海神经科学研究所研究员、课题组长。<\/span><\/p>","cshort2":"

仇子龙, 现任中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员、博士生导师。1998年毕业于上海交通大学生物科学与技术系, 2003年在中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所获得博士学位, 2003至2009年在 美国加州大学圣迭戈分校神经生物学系从事博士后研究, 2009年7月受聘中国科学院上海神经科学研究所研究员、课题组长。从事自闭症的神经生物学研究, 研究工作主 要集中在与自闭症及瑞特综合征等发育性神经系统疾病关系密切的基因 MECP2(methyl-CpG binding protein 2)上, 主要工作包括: (1)发现MECP2蛋 白直接影响核内小RNA剪切加工复合物的活性而调控神经元内小RNA的 产生, 提出了发育性神经系统疾病致病机理的新观点(Cheng et al. Dev Cell<\/em> 2014); (2)发现MECP2蛋白可被小泛肽化(SUMOylation)修饰而影响转录调控 功能与突触发育(Cheng et al. J Neurochem <\/em>2014); (3)应用TALEN基因编辑方 法得到敲除MECP2基因的食蟹猴, 建立了食蟹猴基因编辑系统, 为在非人灵 长类中建立自闭症模型、深入研究自闭症的神经机理打下重要基础(Liu et al. Neurosci Bull <\/em>2014); (4)应用慢病毒转基因方法得到慢病毒介导的转基因 方法成功获得了8只存活的携带人类MECP2基因的转基因食蟹猴, 系统性的 分析了MECP2转基因食蟹猴的行为表型, 发现MECP2转基因食蟹猴表现出 多种自闭症患者的症状, 如重复刻板行为、社交障碍及升高焦虑水平等, 系 国际首次建立精神疾病的基因工程非人灵长类动物模型, 为自闭症的病理 与转化研究提供重要动物模型(Liu et al. Nature<\/em> 2016)。<\/span><\/p>","ctitle":"当猴子患上了自闭症","listseq":38,"seqno":"22","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-13-50-312"},{"caddress1":"(1北京师范大学生命科学学院抗性基因资源与分子发育北京市重点实验室, 北京 100875; 2Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, Houston, Texas 77030, USA))","cauthor":"张舒策1<\/sup> 何 涟2<\/sup> 周育斌2<\/sup> 王友军1*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":11,"clong1":"

1 内质网–细胞质膜连接区背景介绍
真核细胞具有各种形状及功能各异的、膜包 被的细胞器, 这些细胞器膜之间的信息交流对于细 胞维持正常的形态和执行功能非常重要[1]。而其中 对内质网与细胞质膜之间的交流的研究近来进展较 快[2]。在某些细胞的边缘, 管状或片状的内质网膜 延伸至细胞膜附近, 与细胞质膜保持大约10~20 nm 的距离, 两者之间没有直接的膜融合, 这些区域被称 为内质网–细胞质膜连接区(endoplasmic reticulumplasma membrane junction, ER-PM J 或ER-PM连接 区)。而其中位于ER-PM连接区的距离质膜较近的 内质网被称为皮层内质网(cortical ER, cER)(如图1 蓝色箭头所示)。在ER-PM连接区发生着许多重要 的生理活动, 例如脂质代谢以及包括钙库操纵钙内 流(store-operated calcium entry, SOCE)在内的钙离子 稳态的维持等[1]。由于缺少适当的方法和方便的工 具对这个特化部位进行分子水平的解析一直非常困 难。

钙池操纵钙内流(SOCE)是一种发生在ER-PM 连接区的重要的生理过程[3]。经典的SOCE由位于内质网膜上的钙离子感受器蛋白STIM1(stromal interaction molecule 1)和质膜上Orai1钙离子通道共 同介导。STIM1蛋白是内质网膜上的单次跨膜的一 个钙结合蛋白, 其位于内质网腔内的N-端EF-hand结 构域可以结合钙离子。当内质网钙库中钙离子浓 度降低时, 钙离子从STIM1上解离下来, 引起STIM1 发生构象变化[4]并转位到ER-PM连接区的cER处, 并 形成众多斑块状的结构“puncta”(如图2黄色箭头所 示)。STIM1位于胞质一侧的C-末端, 与定位在细胞 质膜上的Orai1通道相互作用, 并激活Orai1通道, 胞 外的钙离子通过Orai1进入胞质, 这种钙内流即为 SOCE[5]。SOCE普遍存在于非兴奋性细胞和兴奋 性细胞中, 在分泌、基因转录、酶活调节、细胞凋 亡等过程中发挥重要的作用[6-7]。SOCE重要的下游 反应之一是导致活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells, NFAT)的激活和核转位, 并启动下 游基因的转录[8]。因而解析在ER-PM连接区参与调 控SOCE的蛋白质组并了解其作用机理有着非常重 要的意义。

尽管传统的基于免疫共沉淀的蛋白质组学的质谱鉴定方法可以同时检测数以千计的互作蛋白, 但是该方法的灵敏度和特异性均较低, 对互作蛋白 的时空分辨率较低。比如在质谱检验之前的细胞裂 解及免疫共沉淀过程中会损失掉很多蛋白, 特别是 一些弱相互作用蛋白, 从而产生假阴性结果。另外, 细胞裂解后一些本来在细胞内不同部位、没有相互 接触的蛋白也有可能发生相互作用而被鉴定为互作 蛋白, 产生假阳性结果。<\/p>

<\/p>

2 原位活体生物素蛋白标记技术

为了解决上述问题, Rhee等[9]在2013年首次建 立了基于抗坏血酸过氧化酶2(ascorbateperoxidase 2, APEX2)的原位活体蛋白标记技术。APEX2可以在 H2O2存在的情况下催化生物素–苯酚转化为生物素 酚氧自由基, 后者可以攻击附近蛋白的酪氨酸、色 氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基, 从而可以对临近的 蛋白进行原位活体生物素标记。而且由于生物素– 酚氧自由基存在的半衰期非常短(<1 ms), 因而该方法仅能标记距APEX2小于20 nm的蛋白。生物素标 记之后, 将细胞裂解, 用链霉亲和素磁珠富集这些被 生物素标记的蛋白, 最后运用质谱技术对这些蛋白 质组进行鉴定。通过这一方法, Rhee等[9]在细胞内 表达了特异性定位于线粒体基质的APEX2融合蛋 白, 原位活体标记并鉴定了线粒体基质及线粒体内 膜上面对基质的蛋白质组, 有效提高了实验结果的 时空分辨率, 并显著降低了假阳性率。

由于STIM1可以在内质网钙库清空后转位到 ER-PM连接区, 而且ER-PM连接区的空间大小正好 与这种结合原位活体生物素标记法的蛋白质组鉴 定技术的时空分辨率(<20 nm)一致。因而我们将该 技术手段运用到对ER-PM连接区内的STIM1互作 蛋白质组的鉴定上(图1)。我们首先构建了STIM1- APEX2融合蛋白, 并发现该融合蛋白的两个组分 均能正常行使功能。全内反射荧光(total internal reflection fluorescence, TIRF)显微成像结果显示, 其 STIM1部分作用跟野生型的STIM1一样, 都能在内质网钙库清空后形成典型的激活后的斑块状结构 “puncta”(图2)。而用亲和素进行免疫染色的结果显 示, 该融合蛋白的APEX2部分跟野生型的APEX2一 样, 都仅能在加入H2O2时才能对蛋白进行生物素标 记。这表明, 我们构建的融合蛋白能有效地定位到 ER-PM连接区并对其周围20 nm内的蛋白进行生物 素标记。<\/p>

<\/p>



3 运用原位活体生物素蛋白标记技术鉴 定ER-PM连接区STIM1附近蛋白质组并 发现STIMATE

借助我们构建的STIM1-APEX2融合蛋白, 在 静息或内质网钙库清空时, 我们在HEK-293活细 胞内原位标记了ER-PM连接区内距离STIM1蛋白 20 nm之内的蛋白质组。然后, 用亲和素磁珠富集 细胞裂解液中的生物素标记蛋白, 最后使用液相色 谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法对富集到的蛋白进行分析鉴定。Orai1作为已知的STIM1结合蛋白仅 在激活状态下被检测到, 这与STIM1和Orai1仅在 STIM1激活时有相互作用的实验预期相符合。同 时, 我们还检测到了其他已报导的STIM1结合蛋白, 如MAPRE1/EB1(microtubule associated protein RP/ EB family member 1)、ATP2A2/SERCA2(ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ transporting 2)等。这些结果表明, 这一新的蛋白质组鉴定方 法是有效的。包括上述蛋白在内, 我们一共找到 了73个潜在的STIM1相互作用蛋白, 其中17个在 HEK-293细胞中不论钙库充满还是清空的状态下 都被检测到。它们中大部分都是内质网或细胞 质膜的驻留蛋白、细胞骨架组分、参与胞内膜运 输和翻译后修饰的蛋白。接下来, 我们选择了其 中在钙库清空前后均能检测到的、具有钙信号功 能注释的或具有预测的跨膜区的38个蛋白, 并进 行了与STIM1的双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescence complementation, BiFc)。结果显示, TMEM110(RefSeq ID: NM_198563)在APEX和BiFc 的实验中都是一个很好的潜在STIM1互作蛋白, 我 们将它命名为STIMATE(STIM-activating enhancer)。

4 STIMATE功能初步探索
为了探究STIMATE对SOCE及其下游反应的影 响, 我们使用siRNA在HEK-293细胞中对STIMATE 进行沉默, 并分别使用钙成像技术和萤光素酶技 术检测了沉默STIMATE对SOCE和NFAT活性的影 响。与对照组相比, STIMATE沉默的细胞中SOCE 和NFAT依赖的萤光素酶活性均受到了抑制。在干 扰STIMATE的HEK-293细胞中回补STIMATE的表 达可以恢复SOCE和萤光素酶的活性。我们又使用 CRISPR/Cas9基因组编辑技术制作了两个稳定敲除 STIMATE的HEK-293细胞系, 它们的第四个外显子 被破坏, 具有提前的终止密码子。在这两个细胞系 中, 离子霉素(ionomycin)引发的内质网钙库的钙释 放没有明显的变化, 但SOCE显著地减小了。这些 结果提示, STIMATE是一个之前未被发现的可上调 SOCE的蛋白。

STIMATE在人和小鼠的组织中广泛表达, 在 HEK-293、HeLa和COS-7等细胞系中单独过表达 时定位于内质网上。在共表达STIMATE与STIM1 的细胞中, 二者共定位; 在10 nm的尺度上, CFP标记 的STIMATE与YFP标记的STIM1之间可以检测到 荧光共振能量转移(f?rsterresonance energy transfer, FRET)的信号; 在体外, STIM1和STIMATE可以免 疫共沉淀。这些结果暗示, STIMATE是STIM1的 互作蛋白。经过一些列的免疫共沉淀和FRET实 验, STIMATE与STIM1相互作用的部分被定位在 STIM1位于233~343位氨基酸的CC1(coiled-coil 1) 区, 以及STIMATE的C-末端(STIMATE-CT、214- 294位氨基酸)。应用表面等离子体共振(surface plasmonresonance, SPR)技术可以测定STIM1-CC1与 STIMATE-CT之间的解离常数为8.9±0.7 μmol/L。这 些结果表明, STIMATE是通过其C-末端与STIM1- CC1的互作来实现其调控SOCE的作用的。

为进一步探究STIMATE是如何通过与STIM1 互作来影响其介导SOCE的功能的, 我们首先进行了TIRF成像实验。结果显示, 在部分共表达STIMATE 和STIM1的细胞中, 即使在内质网钙库充满的静息 状态下, STIM1也会移动到ER-PM连接区, 形成典型 的激活时的puncta结构, 并与STIMATE共定位。钙 库清空后, 过表达STIMATE的细胞中STIM1形成的 斑块状结构面积更大, 而在STIMATE敲除的细胞中, TIRF成像所观察到的EGFP-STIM1的荧光减少了 大约70%。基于这些结果, 我们认为, STIMATE可 以调控STIM1 puncta的形成。进一步的钙及FRET 成像结果表明, 由STIMATE共表达引起的puncta状 分布的STIM1在静息时处于持续激活状态, 在钙库 充满时即结合并激活Orai1, 引发自发的持续钙内 流。并且该钙内流可以被高浓度的SOCE工具药2- 氨基乙氧基二苯硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate, 2-APB)抑制。这些结果暗示, STIMATE可能通过与 STIM1互作, 影响STIM1 puncta的形成, 进而调控由 STIM1-Orai1介导的钙内流。

由于STIM1在激活时, 首先需要进入与质膜 距离较近的层内质网(cortical ER, cER), 之后才能 与Orai1结合并引发SOCE。所以另外一种可能是, STIMATE通过调节层内质网的形成, 从而间接地调 节STIM1 puncta的产生。因而我们探究了STIMATE 的敲除对cER形成的影响。但利用高分辨率透射电 镜成像的结果表明, STIMATE的敲除没有显著影响 cER的形成。为排除该阴性结果是由于所用技术手 段分辨率不够造成的假象的可能, 我们进一步利用 cER的选择性标记蛋白“膜系外周内质网(membraneattached peripheral ER, MAPPER)”来标记cER, 或 用我们构建的光遗传工具“光诱导膜系外周内质 网(light-inducible membrane-tethered peripheral ER, LiMETER)”可逆性地标记cER, 然后进行高分辨率 成像观察STIMATE的敲除对cER形成的影响。两 种实验的结果均表明, STIMATE敲除仅减少了大约 10%的cER。STIMATE敲除后对cER的微小抑制不 能完全解释STIM1 puncta大量减少(约70%)的现象。 因而STIMATE可能是更多的通过与STIM1直接的相 互作用来影响后者的激活的。

我们之前的研究发现, 在静息时, STIM1激活 Orai1的最小功能域SOAR(STIM-Orai-activating region)/CAD[CRAC(calcium release-activated calcium channel) activation domain][10-11] 被STIM1 的 CC1区锚定在内质网附近, 阻止了其激活。在钙库 清空后, STIM1的构象变化, 使得CC1区释放SOAR/ CAD, 后者结合并激活质膜上Orai1钙离子通道, 引 发钙内流[4]。因而我们猜想, STIMATE与CC1的相互 作用可能破坏了CC1与SOAR/CAD相互作用, 解除 了静息时STIM1自抑制状态, 促进了STIM1从静息 到激活的构象变化, 从而使得SOAR/CAD从STIM1 上解离下来而激活Orai1。利用我们之前开发的可 以检测STIM1构象变化的二元FRET体系STIM11-310- CFP和YFP-SOAR[4], 我们发现, 共表达STIMATE和 钙库清空一样, 都使得二者之间的FRET信号变弱。 这说明STIMATE的确通过与STIM1-CC1的相互作 用, 竞争性地减弱了STIM1的CC1区与SOAR区的相 互作用, 从而促进了STIM1由静息到激活的构象及 定位变化。

5 总结

我们运用非破坏性的活体原位生物素蛋白标 记的方法无损地鉴定了一个ER-PM连接内STIM1蛋 白附近的蛋白质组。这一结果不仅提供了生理状态 下ER-PM连接区蛋白质组成的第一个视角, 也为未 来研究它们在信号转导和疾病发生过程中的功能提 供了一个框架。活体生物素标记技术有望揭示更多 亚细胞结构中的分子信息。特别地, 随着ER-PM连 接区调控着STIM1依赖的钙信号过程的内质网驻留 蛋白STIMATE的发现, 我们不禁要问, STIMATE是 怎样与ER-PM连接区的其他成分协同从而在钙信号 转导和其他生理过程中发挥作用的？ STIMATE本 身对ER-PM连接区的cER形成与维持的作用又是如 何实现的？ ER-PM连接区隐藏着更多的疑惑需要我们进一步探索和回答。<\/p>


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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-38-08-714.jpg","cshort":"

王友军, 北京师范大学生命科学学院教授。1997年毕业于烟台大学生化系, 获学士学位; 2000年于北京大学生命科学学院获得神经生理学专业硕士学位; 2007年于美国马里兰大学帕克分校获得神经与认知专业博士学位, 2007–2010年在美国费城天普大学生化系Gill实验室做博士后, 之后三年继续在Gill处做副科学家(Associate Scientist)。2013年起, 在北京师范大学生命科学学院抗性基因资源与分子发育北京市重点实验室工作, 并入选教育 部2013年度“新世纪人才支持计划”及第五批“青年千人计划”。<\/span><\/p>","cshort2":"

王友军, 北京师范大学生命科学学院教授。1997年毕业于烟台大学生化 系, 获学士学位; 2000年于北京大学生命科学学院获得神经生理学专业硕 士学位; 2007年于美国马里兰大学帕克分校获得神经与认知专业博士学位, 2007–2010年在美国费城天普大学生化系Gill实验室做博士后, 之后三年继 续在Gill处做副科学家(Associate Scientist)。2013年起, 在北京师范大学生命科学学院抗性基因资源与分子发育北京市重点实验室工作。王教授多年来一直从事胞内钙信号转导的相关研究, 用荧光钙成像、FRET及膜片钳 技术等手段研究STIM介导钙信号的分子机制及其生理意义。其主要工作揭示了STIM蛋白激活Orai通道的重要分子机制, 发现了STIM蛋白对Orai 及L型钙离子通道的交互控制作用, 从而说明STIM是一个细胞内决定细胞 反应类型的一个重要的选择开关。最近, 与周育斌教授合作鉴定了一个ER蛋白—STIMATE, 并初步阐明了其调控STIM1激活的分子机制。其中后两个发现均被同领域专家在同期杂志上加以评论。迄今为止, 王教授在 Science、Nat Cell Biol、Proc Natl Acid Sci USA、Nat Commun<\/em>等杂志上发 表相关论文20余篇。<\/span><\/p>","ctitle":"内质网–细胞质膜连接区蛋白质组鉴定及对其中的STIMATE的功能研究","listseq":39,"seqno":"21","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-11-44-467"},{"caddress1":"(军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京蛋白质组研究中心, 蛋白质组学国家重点实验室, 肿瘤医学协同创新中心, 北京 100850)","cauthor":"李洪昌#<\/sup> 张鹏飞#<\/sup> 袁 林 张令强*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":34,"clong1":"

1 PTEN: 生理条件下的重要抑癌蛋白
PTEN(phosphatase and tension homology, deleted in chromosome 10)是1997年在人类第10号染色体上 首次发现并克隆到的抑癌基因[1-2], 通过近20年的研 究, 发现PTEN在肿瘤的发生发展中起着至关重要 的抑制作用。PTEN基因的生殖突变与体细胞突变 与多种肿瘤的发生发展密切相关, PTEN在脑胶质 瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌[1-5]等多种肿瘤中具有 很高的突变率或低表达率, 并且在Cowden综合征[6]、 Bannayan-Zonana综合征[7]等肿瘤易感性疾病中同样 存在很高的遗传性突变率。此外, PTEN基因纯合缺 失的小鼠因细胞增殖过快、程序性死亡不足在胚胎 的9.5 d出现死亡[8], 而PTEN基因杂合缺失小鼠有半 数在一年之内死亡, 剩下的一半也自发形成乳腺癌、 淋巴癌等多种癌症[9-10]。<\/p>

PTEN具有脂质和蛋白双重磷酸酶活性, 它 在细胞质中利用其脂质磷酸酶活性将细胞质中的 磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸去磷酸化生成磷脂酰肌 醇-4,5-二磷酸, 从而抑制PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)-Akt通路, 发挥抑癌功能[11]。而在细胞 核中, PTEN还可通过以下几种方式发挥抑癌功 能: (1)PTEN通过促进P300介导的p53乙酰化响应 DNA损伤, 控制细胞增殖[12]; (2)PTEN直接结合细 胞后期促进复合物(anaphase-promoting complex or cyclosome, APC/C), 增强APC/C-CDH1复合物 的相互作用, 增强其抑癌功能[13]; (3)PTEN结合着 丝粒蛋白-C(centromeric protein-C, CENP-C), 提高 基因组稳定性[14]; (4)PTEN通过上调与DNA双链断 裂修复密切相关的关键分子RAD51维持基因组稳 定性[14]。也正是由于PTEN在维持基因组稳定性上 的重要作用, 在2007年,《 Nature Reviews Molecular Cell Biology》将PTEN称为“a new guardian of the genome”, 与p53并列为基因组稳定性的两大守护者。<\/span>

2 PTEN蛋白稳定性的泛素化调控研究<\/span>
由于PTEN在抑制肿瘤发生发展中发挥重要的 作用, 因此, 对PTEN的蛋白稳定性调控研究一直是 该领域内的研究热点。在细胞内, 泛素?蛋白酶体途 径(ubiquitin-proteasome system)是一个重要的蛋白 质降解调控系统, 通过泛素连接酶(protein ubiquitin ligase, E3)促进底物蛋白多聚泛素化进而促进蛋白 底物降解。但同时, 泛素?蛋白酶体途径也是一个受 严格调控并可逆的过程, 去泛素化酶(deubiquitylase, DUB)可介导底物蛋白去泛素化并稳定其蛋白水平。 目前, 研究发现, 能够促进PTEN泛素化(包括单泛 素化与多聚泛素化)的泛素连接酶已有5个[Nedd4- 1(Neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4-1)、XIAP(X-chromosomelinked inhibitor of apoptosis protein)、WWP2(WW domain-containing protein 2)、CHIP(C terminus of Hsc70-interacting protein)、TRIM27(tripartite motifcontaining protein 27)/RFP(ret finger protein)][15-19]。 与p53半衰期很短不同, PTEN蛋白的半衰期相对较 长, PTEN在细胞中的内源蛋白水平较高, 提示PTEN 蛋白稳定性具有重要的维持机制, 我们推测, 去泛素 化酶在其中担当了重要角色。但是, PTEN去泛素化 酶的研究却极少。在我们开展调节PTEN蛋白稳定 性的去泛素化酶的筛选与研究时, 仅有一个去泛素 化酶HAUSP(herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease, 又称为USP7, ubiquitin-specific-processing protease 7)被报道能调节PTEN的去泛素化作用。然 而, HAUSP只去除PTEN的单泛素化, 促进PTEN由 细胞核移位至细胞质, 并没有调控PTEN蛋白稳定性 的功能[20]。因此, 特异去除PTEN多聚泛素化、维持PTEN蛋白稳定性的去泛素化酶亟待鉴定。<\/span>

3 OTUD3通过去除PTEN多聚泛素化维 持其蛋白稳定性发挥抑癌功能<\/span>
我们通过对人类去泛素化酶库中的接近90个 去泛素化酶进行无偏性筛选, 发现OTU亚家族中的 OTUD3(OTU domain-containing protein 3)分子可以 显著地上调PTEN蛋白水平(图1)。OTUD3定位于人 类染色体1p36.13, 是一个迄今研究极少的基因。进 一步研究发现, OTUD3蛋白主要定位于细胞质, N- 端含OTU结构域的区域直接参与PTEN的C2结构域 的结合, 通过去除PTEN的多聚泛素化修饰、拮抗 PTEN的泛素蛋白酶体降解, 从而稳定PTEN的蛋白 水平。敲低细胞内源OTUD3的表达, PTEN的蛋白 稳定性显著下降, Akt通路被过度激活; 而在细胞中 过表达野生型OTUD3, PTEN的半衰期延长, PI3KAkt 通路受到抑制。细胞功能上, 在乳腺癌细胞系中过表达野生型OTUD3而非酶活突变型C76A可以抑 制细胞增殖; 裸鼠体内接种实验证明, OTUD3可以 抑制肿瘤的形成。相反, 在乳腺癌细胞系中敲低内 源OTUD3的表达可以促进肿瘤细胞的增殖与侵袭 转移能力, 接种裸鼠后则加速肿瘤形成及转移。而 在正常乳腺上皮细胞中敲低内源OTUD3的表达会 使细胞发生转化, 在裸鼠皮下注射该细胞可形成肿 瘤。这些证据表明, OTUD3抑制乳腺癌的发生、发 展与转移。重要的是, 在PTEN表达缺陷的乳腺癌细 胞系中, 敲低OTUD3表达对细胞的增殖及成瘤能力 没有显著影响, 表明OTUD3调控肿瘤的发生发展依 赖于PTEN的存在。<\/span>

为在体内研究OTUD3的抑癌功能, 我们构建 了OTUD3转基因小鼠模型, 研究发现, OTUD3转基 因小鼠的多种组织器官以及MEF细胞中PTEN都呈 高表达, PTEN的稳定性增强, 泛素化水平显著降低, Akt通路受到抑制。将OTUD3转基因小鼠与MMTVAPyMT转基因小鼠(一种乳腺癌自发成瘤小鼠模型)交 配、观察发现, OTUD3转基因小鼠对MMTV-PyMT 诱导的乳腺癌发生表现出显著的抑制效应。这从遗 传学上证明, OTUD3是PTEN的一个重要的稳定调控 因子, 在体内OTUD3发挥重要的抑癌功能(图1)。<\/span>

此外, 我们通过大规模临床乳腺癌病人样本 检测发现, 与癌旁组织相比, OTUD3在乳腺癌组织 (PTEN基因的突变率低, 但蛋白异常低表达率高)中 低表达, 并且PTEN的蛋白水平与OTUD3的表达呈 正相关性, 且OTUD3的表达与病人的预后有明显相 关性。OTUD3表达越高, 病人出现淋巴结转移的概 率越小, 生存期越长, 预后越好。同时, 我们在乳腺 癌样本的筛查过程中发现, OTUD3在乳腺癌中存在 功能性丧失的基因突变(如E86K等), OTUD3的突变 体(OTUD3-E86K)丧失了对PTEN的去泛素化修饰能 力, 从而失去了维持PTEN的蛋白稳定性的功能。在 正常乳腺上皮细胞中过表达OTUD3-E86K突变体会 促进细胞恶性转化, 说明E86K突变将OTUD3从一个 抑癌基因转变为了癌基因。<\/span>

在研究的过程当中, 美国德州大学MD Anderson 肿瘤中心的Li Ma实验室在《 Nature Cell Biology》 杂 志发表了一篇与我们的工作非常相近的论文, 报道 另一个去泛素化酶USP13可稳定PTEN、抑制Akt 通路, 同时在乳腺癌组织中低表达[23]。为阐释清楚 OTUD3与USP13在乳腺癌中对PTEN的调控关系, 我们设计实验对其进行系列研究。体外泛素化实 验表明, OTUD3对PTEN的去泛素化修饰能力强于 USP13。进一步分析发现, OTUD3主要去除PTEN 的K6/K11/K27/K48型泛素链修饰, 而USP13主要去 除PTEN的K6/K29/K63型泛素链修饰(图2)。细胞 水平上, 单敲低OTUD3细胞的增殖能力、迁移能力 都强于单敲低USP13时相应的细胞学效应; 双敲低 OTUD3/USP13表达时, 相应的细胞学效应进一步增 强, 表明在细胞中OTUD3和USP13在功能上有一定 的协同效应。这一结论进一步在裸鼠成瘤模型和组 织芯片的免疫组化实验中得到验证。<\/span>

我们的研究表明, OTUD3分子是PTEN蛋白稳定 性的重要正调控因子, OTUD3-PTEN通路在肿瘤的抑 制过程中发挥着重要作用。总之, 我们的研究回答了 PTEN领域中一个长期没有解决的重大问题, 弥补了 通过拮抗泛素化降解从而促进对PTEN稳定性调控这 一机制长期未被解决的缺憾。从我们的研究中可见, PTEN泛素化与去泛素化的双向调控可以决定细胞命 运, PTEN除了在细胞增殖与迁移中发挥功能外, 在细 胞代谢、衰老以及干细胞的自我更新中也发挥着重 要作用, 那在小鼠中敲除OTUD3基因后PTEN的蛋白 水平会出现什么样的变化？细胞功能会发生什么变 化？ OTUD3的主要生理功能是什么？这些问题都需 要通过基因敲除小鼠的研究来揭示。<\/span>

对于去泛素化酶的研究, 这几年逐渐成为泛 素化修饰研究领域的热点问题。越来越多去泛素 化酶的功能被揭示, 但关于利用基因敲除小鼠模 型揭示去泛素化酶的生理功能的报道却不多。究 其原因, 一方面是由于对去泛素化酶的研究还不 够深入; 但更重要的是, 目前在人体发现的去泛素 化酶数量仅有100个左右, 与泛素连接酶的数量相去甚远, 意味着一个去泛素化酶可能调控多个底 物, 相应的, 一个底物也将受多个去泛素化酶共同 调节, 这给去泛素化酶的生理功能研究带来极大 的困难。然而, 作为泛素化修饰调控系统的重要组 成部分, 去泛素化酶的研究亟待加强, 随着新技术 的出现与改进, 动物模型构建效率的提升以及信 息化技术的演进, 去泛素化酶的研究很可能迎来一个新的高峰。<\/span>
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参考文献 (References)<\/strong>
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19 Lee JT, Shan J, Zhong J, Zhou B, Zhou A, Parsons R, et al. RFPmediated ubiquitination of PTEN modulates its effect on AKT activation. Cell Res 2013; 23(4): 552-64.

20 Song MS, Salmena L, Carracedo A, Egia A, Lo-Coco F, Teruya- Feldstein J, et al. The deubiquitinylation and localization of PTEN are regulated by a HAUSP-PML network. Nature 2008; 455(7214): 813-7.

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22 Yuan L, Lv Y, Li H, Gao H, Song S, Zhang Y, et al. Deubiquitylase OTUD3 regulates PTEN stability and suppresses tumorigenesis. Nat Cell Biol 2015; 17(9): 1169-81.

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张令强, 军事医学科学院放射与辐射医学研究所、国家蛋白质科学中心(北京)、蛋白质组学国家重点实验室研究员, 博士生导师。2003年毕业于军事医 学科学院细胞生物学专业, 目前的主要研究方向是蛋白质泛素化修饰与人类疾病。他带领课题组较为系统地回答了HECT型泛素连接酶Smurf1如何被激活与灭活、如何通过靶向泛素化进行骨质疏松治疗、抑癌蛋白p53与PTEN的稳定性与活性如何受到精细调控等科学与技术问题, 为骨质疏松和肿瘤治疗药物的研发提供了潜在靶点。<\/span><\/p>","cshort2":"

张令强, 军事医学科学院放射与辐射医学研究所、国家蛋白质科学中心(北京)、蛋白质组学国家重点实验室研究员, 博士生导师。2003年毕业于军事医学科学院细胞生物学专业, 目前的主要研究方向是蛋白质泛素化修饰与人类 疾病。他带领课题组较为系统地回答了HECT型泛素连接酶Smurf1如何被激 活与灭活、如何通过靶向泛素化进行骨质疏松治疗、抑癌蛋白p53与PTEN的 稳定性与活性如何受到精细调控等科学与技术问题, 为骨质疏松和肿瘤治疗 药物的研发提供了潜在靶点。作为通讯或共同通讯作者在Nat Cell Biol、Nat Med、Nat Commun、Cell Rep、Proc Natl Acad USA、EMBO J、EMBO Rep、 Cell Res<\/em>等著名刊物发表论文50余篇, 这些研究全部在国内完成, 并产生了重要的国际影响, 论文被Nature、Nat Med、Nat Rev Mol Cell Biol、Cell、Mol Cell<\/em> 等国际学术刊物较为广泛地正引与评论。基于这些研究成果, 先后获得北京市科学技术一等奖、中华医学科技二等奖、国家科技进步奖创新团队奖等。<\/span><\/p>","ctitle":"去泛素化酶OTUD3通过稳定PTEN抑制癌症发生发展","listseq":40,"seqno":"20","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-27-14-10-34-514"},{"caddress1":"( 1 中国科学院上海生命科学研究院, 生物化学与细胞生物学研究所, 国家蛋白质科学中心(上海), 上海 201210; 2 哈佛大学医学院, 生物化学与分子药理学系, 波士顿 02115)","cauthor":"周界文1,2*<\/sup> 傅青山2<\/sup> 刘志军1<\/sup>","cintpic":"","clicktime":14,"clong1":"

1 HIV疫苗开发的挑战性<\/strong>
人 类 免 疫 缺 陷 病 毒(human immunodeficiency virus, HIV), 即艾滋病[获 得 性 免 疫 缺 陷 综 合 征 (acquired immune deficiency syndrome, AIDS)]病毒, 是 造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。1983年, 人类 免疫缺陷病毒由法国和美国的实验室首次发现[1-2] 。 HIV通过破坏人体的T淋巴细胞, 进而阻断细胞免疫 和体液免疫过程, 导致免疫系统瘫痪, 从而致使各 种疾病在人体内蔓延, 最终导致艾滋病。虽然小分 子药物已能有效地遏制病情, 但是至今仍无政府批 准的预防性疫苗, 因此每年仍有大约两百万人被感 染[3] 。HIV极其迅速的变异给疫苗研发带来很大的 麻烦。自从1987年由美国国立卫生研究院实行的 第一次HIV疫苗临床实验到目前, 已经有过30多次 不同的临床试验, 但是都没有达到预期的效果。理 想情况下, HIV疫苗会诱发两种免疫反应对抗HIV-T 细胞激活和B细胞分泌抗体, 这些免疫反应会阻止 病毒侵染和蔓延, 降低病毒对患者的免疫系统破 坏。然而, 至今还没有一种疫苗能够有效激活这两 种类型的应答。迄今为止, 研究人员只在实验阶段 做到HIV疫苗刺激T细胞产生微弱应答, 而刺激B细胞产生抗体来对抗各种HIV病毒株时却遇到巨大的 困难。这个问题的根源在于我们缺乏对艾滋病毒 免疫原的认识, 那就是什么样的HIV病毒蛋白的片 段作为实验疫苗可以引起免疫反应, 并在实际遭遇 病毒和抵抗艾滋病的过程中起到有效作用。

2 HIV包膜蛋白作为疫苗开发策略的主 要对象<\/strong>
HIV包膜蛋白(Env; gp160三聚体)是病毒粒子 表面上的唯一抗原, 因此也是目前疫苗设计的主要 目标[4-5] 。Env的作用是, 通过与宿主细胞受体发生 相互作用帮助病毒进入细胞[6] 。成熟的Env(gp160)3 被酶切后成(gp120/gp41)3, 是由三个gp120和三个 gp41亚单元组成的三聚体。其中, gp41是跨膜蛋白, gp120位于表面, 并与gp41通过非共价作用结合。在 病毒入侵过程里, gp120结合细胞表面受体CD4和复 合受体CCR5或CXCR4, 触发Env巨大的构象变化, 然后gp41膜融合蛋白又通过一连串的大范围的蛋白 质重折叠, 最终导致病毒与宿主细胞的膜融合[7-9] 。 由于Env的胞外区是病毒入侵宿主时最先被识别的 区域, 科学家的疫苗开发策略主要以Env胞外区作为免疫原。正因如此, 关于Env的胞外区的结构信息 有很多研究报道, 包括胞外区的高分辨率晶体和电 镜结构[9-12] 。可惜的是, 众多以Env胞外区三聚体为 主的免疫原在临床试验中都无法诱导强烈的免疫应 答, 这让大家非常困惑[13-14] 。

3 难以捉摸的HIV gp41跨膜区也许是解 决问题的关键<\/strong>
去年, 哈佛医学院和波士顿儿童医院的Bing Chen课题组在《Science》报道了一个出乎意料的 结果。他们发现, 对HIV-1Env胞内区的改变居然严 重影响了Env胞外区的抗原性质[15] 。更具体地说, 剪 切gp41的胞内区可以让(gp120/gp41)3在膜另一端的 胞外区对之前被鉴定的广泛中和抗体, (如PG16和 PGT145等), 完全失去灵敏度。对此结果的唯一解 释就是, Env作为跨膜蛋白的胞外、跨膜和胞内区的 构象与动态特征是相互偶联的。也就是说, 改变胞 内区的结构会破坏跨膜区的结构, 而跨膜区的结构 对胞外区的三聚体组装结构又起到稳定性的作用。 所以, 胞内区的变异破坏了Env跨膜蛋白的整体结构 协同效应, 间接地导致了胞外区结构的不稳定。根 据以上推测, 我们认为, 获得gp41跨膜区的结构信息 对于设计一个稳定的(gp120/gp41)3胞外区作为抗原 非常关键。然而, 长期以来, 病毒膜融合蛋白的跨膜 区和近膜区域的结构解析一直是困扰结构生物学家 的难题。

4 HIV-1 gp41跨膜区的核磁结构解析<\/strong>
结构研究需要大量均一的蛋白样品。但是由于 膜融合蛋白的跨膜区的疏水性非常强, 给样品制备 带来了很大的麻烦。我们的解决办法包括系统性筛 选跨膜区域构建和在细菌里做定向包含体表达。此 外, 跨膜区比其他内在膜蛋白小很多, 它们往往需要 在磷脂双层的环境里形成稳定的多聚体结构。而这 些条件与传统的结晶、液相核磁等方法是不相容的。 我们的研究手段是把gp41跨膜区重构到bicelle里。 Bicelle是一种由磷脂酰胆碱脂质(1,2-dimyristoyl-snglycero-3-phosphocholine, DMPC)和短链的脂质(1,2- dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DHPC)自组 装成的脂质/两亲性分子的混合物, 用于模拟生物膜 的环境。首先, 我们发现, 由bicelle重构的gp41跨膜区果然形成一个非常稳定的三聚体, 和胞外区的三 聚体构想是吻合的。然后, 我们利用近期建立在上 海蛋白质设施的核磁系统的一整套高效的膜蛋白核 磁技术[16-17] , 采集原子之间的结构约束。虽然gp41 跨膜区是重构在相当大的bicelle里(直径约为10 nm), 高度优化的多维液相核磁实验, 加上高场高灵敏度 的核磁仪器, 使得高分辨率结构解析成为可能。同 时, 因为蛋白是被包含在bicelle的磷脂双层部分, 我 们通过最新研发的顺磁探针滴定方法测定了gp41跨 膜区在膜里的精确位置。
结果表明, HIV-1 gp41跨膜区域形成有序的三 聚体结构[18] , 保护埋在膜内保守的精氨酸残基(图 1)。N-端卷曲螺旋和C-末端的亲水核心一起稳定这 个三聚体, 而后者可以在结构上联接到胞内区。和 我们之前的猜测一致的是, 跨膜区在膜环境里形成 非常明确的三聚体结构, 说明它完全有能力使Env的 胞外区三聚体结构更加稳定。我们没有想到的是, 跨膜区的三聚体结构里在膜的核心疏水部位藏有三 个带有正电荷的精氨酸残基。这个氨基酸在病毒里 非常保守, 意味着跨膜区三聚体在膜里含有很大的 潜能, 其在病毒入侵时的作用有待进一步研究。但 是我们有理由猜测, 这些能量很有可能在膜融合过 程中被释放。我们认为, gp41跨膜区的结构对HIV 疫苗开发的意义是为设计新一代更稳定的Env胞外 区免疫原提供引导性信息。因为此结构是在磷脂 双层的环境里测定的, 所以它应该比较准确的反映 Env在膜里是怎样保持三聚体状态的。获得结构后, Bing Chen课题组和我们进行了非常彻底的基于结 构的功能突变研究。就如我们猜测的那样, 可分解 gp41跨膜区三聚体的氨基酸突变同时也改变了成熟 Env对抗体的敏感性。
最后, 我们的结构和功能数据首次证实了gp41 跨膜区域形成的有序三聚体结构, 不仅对Env的膜锚 定和膜融合起关键作用, 而且对于整个HIV包膜蛋 白的结构稳定性非常重要。下一个有针对性的问题 显然是, 怎样去模拟跨膜区结构, 设计出稳定的Env 抗原。不过, 在解决这个问题之前还有进一步的结 构信息有待解决。那就是, 连接Env胞外区和跨膜区 的一段叫MPER的极其保守的序列。我们希望能够 利用新建立的核磁体系继续研究, 填补这方面的结 构空白。<\/p>


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参考文献 (References)<\/strong>
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周界文, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、 国家蛋白质科学中心研究员、博士生导师。 1993年毕业于美国密西根大学物理系。1999年获得哈佛大学生物物理学博士。2000至2003年在美国国家卫生研究院完成博士后工作。2003年在美国哈佛大学医学院任助理教授, 2008年提升为副教授, 2012年提升为正教授(终身)。<\/span><\/p>","cshort2":"

周界文, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、 国家蛋白质科学中心研究员、博士生导师。 1993年毕业于美国密西根大学物理系。1999年获得哈佛大学生物物理学 博士。2000至2003年在美国国家卫生研究院完成博士后工作。2003年在 美国哈佛大学医学院任助理教授, 2008年提升为副教授, 2012年提升为正 教授(终身)。曾获得美国Pew学者、Genzyme杰出科学家等荣誉。2011年 6月起任生物化学与细胞生物学研究所研究员。周界文研究组主要研究方向为蛋白质的结构与功能, 用生物物理方法检测膜蛋白结构与动态特性, 理解它们的功能与机制。至今已研发了一整套先进液体核磁共振与生物 化学技术, 实现了人们长期以来想用液相核磁方法来测膜蛋白的结构与动态特性的愿望, 并用这些技术解决了相关细胞跨膜受体和病毒跨膜蛋白的 一系列重要问题。<\/span><\/p>","ctitle":"HIV包膜蛋白跨膜区的结构对疫苗设计的意义","listseq":41,"seqno":"19","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-14-04-32-429"},{"caddress1":"(1 上海交通大学医学院基础医学院生物化学与分子细胞生物学系, 上海 200025; 2 复旦大学上海医学院生物医学研究院, 肿瘤代谢实验室, 上海 200032 )","cauthor":"王义平1*<\/sup> 雷群英2*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":68,"clong1":"

1 胰腺癌细胞的代谢特点<\/strong>
近年研究发现, 肿瘤细胞具有独特的代谢表 型[1-3] , 代谢重塑是肿瘤发生发展的关键特征之一[4] 。 干预肿瘤细胞的代谢或修正肿瘤细胞异常代谢途径 逐渐成为极具潜力的治疗方式[5] 。 胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤, 被称为“癌症之 王”, 其五年存活率仅为3%~5%[6] 。胰腺癌对传统的 放化疗和靶向治疗都会发生抵抗, 因此, 近年来胰腺 癌治疗并未获得突破性进展[7] 。系统地揭示胰腺癌 的代谢特征、发掘潜在的抑制胰腺癌代谢的靶点, 进而从代谢的角度干预胰腺癌发生发展成为具有高 度应用前景的治疗策略。

原癌基因KRAS(kirsten rat sarcoma viral oncogene)的激活突变是胰腺癌发生过程中的早 期标志性遗传事件, KRAS的激活突变存在于超过 90%的临床胰腺癌病例中[8] 。与此同时, 在诱导表 达的动物模型中发现, 在胰腺癌形成之后将KRAS 的激活突变体失活会导致肿瘤的迅速消退[9] 。这 些研究表明, KRAS在胰腺癌的发生发展过程中发 挥着极其关键的作用。进一步的研究表明, KRAS 激活突变体会通过影响胰腺癌细胞中的信号转 导、重塑胰腺癌细胞的代谢促进肿瘤的发生和发 展。例如, KRAS的持续激活可以增强其下游信号 通 路 的 活 力[包 括MAPK(mitogen-activated protein kinase)通路和PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)- mTOR(mammalian target of rapamycin)通路等], 进 而促进胰腺癌细胞的增殖和存活。然而, 目前在体 外培养的胰腺癌细胞系和体内动物模型中的研究表 明, 针对KRAS下游信号通路的抑制剂并未体现出高 效的抑癌作用[10-11] 。因此, 干预胰腺癌的代谢引起 了广泛的研究兴趣。

胰腺癌细胞的代谢具有肿瘤代谢共通的特点, 如沃伯格效应(Warburg effect) [12-13] 。胰腺癌细胞从 外界环境中高效摄入葡萄糖, 并采用无氧糖酵解方式将摄取的葡萄糖分子用于生物合成[14] 。转录组和 代谢组研究发现, 胰腺癌细胞的糖代谢体现出一些 独有的特征。KRAS的激活突变可以促使胰腺癌细 胞更快地摄取葡萄糖分子, 并经过糖酵解途径进一 步将糖酵解中间产物用于己糖胺合成通路, 相应的 胰腺癌细胞内的蛋白普遍被高度糖基化; 另一方面, KRAS突变导致吸收进入细胞的葡萄糖用于磷酸戊 糖途径的非氧化还原支路, 进而促进细胞中核糖的 产生, 维持胰腺癌细胞中核酸分子的生物合成[9] 。

磷酸戊糖途径包括氧化还原和非氧化还原两 个阶段, 两个阶段均可产生五碳糖, 即核糖[15] 。而 磷酸戊糖途径的氧化还原支路可以为细胞提供另 一种重要的代谢物, 即还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)。NADPH是细胞内重要的还原力, 一方面, 可用于维持生物合成反应, 如脂肪酸的合成[16] ; 另一 方面, 可用于再生还原型谷胱甘肽, 维持细胞内的氧 化还原稳态[17] 。氧化还原稳态对肿瘤细胞的存活尤 为重要。胰腺癌细胞将葡萄糖选择性的经由非氧化 还原磷酸戊糖途径进行代谢会导致还原力NADPH 生成的缺乏。肿瘤细胞内部的稳态对维持肿瘤细胞 的存活和增殖非常关键[18] 。因此, 胰腺癌需要利用 其他的代谢途径产生NADPH, 维持细胞内的氧化还 原平衡, 保证细胞的存活和增殖。

2 胰腺癌细胞的非经典谷氨酰胺代谢<\/strong>
除葡萄糖外, 谷氨酰胺也是肿瘤细胞重要的 营养物质。早在上世纪50年代, 肿瘤代谢领域的先 驱们就发现, 肿瘤细胞对谷氨酰胺的摄入超过其他 必需氨基酸十倍以上[19] , 表明谷氨酰胺在细胞内绝 不仅仅是核酸和蛋白合成的前体物质。随后的研 究发现, 肿瘤细胞会将谷氨酰胺来源的碳以乳酸的 形式分泌到细胞外[20] , 表明谷氨酰胺可作为肿瘤细 胞的能源物质。进一步研究表明, 胰腺癌、脑胶质瘤、白血病、肺癌等多种肿瘤对谷氨酰胺的利用均 显著增强[20-22] 。谷氨酰胺被摄取进入细胞后, 经过 脱氨和氧化转变为α-酮戊二酸, 进而进入柠檬酸循 环用于供能或生物合成。谷氨酰胺来源的苹果酸可 从线粒体转运到胞质中, 进而作为苹果酸酶(malic enzyme 1, ME1)的底物用于NADPH的生成[23] (图1), 为脂肪酸等生物分子的合成提供还原力, 促进肿瘤 细胞增殖。

与其他肿瘤相似, 胰腺癌细胞的增殖和存活不 仅高度依赖于葡萄糖, 同时依赖于谷氨酰胺。不同 的是, 胰腺癌细胞采用了一条独特的谷氨酰胺代谢 通路。胰腺癌细胞将谷氨酰胺来源的谷氨酸转变 为天冬氨酸, 进而天冬氨酸被转运至胞质中, 随后 由谷草转氨酶1(glutamic-oxaloacetic transaminase 1, GOT1)、苹果酸脱氢酶1(malate dehydrogenase 1, MDH1)和苹果酸酶1催化连续的酶促反应, 将 天冬氨酸转变成为苹果酸、丙酮酸, 同时生成 NADPH[24] 。这条非经典的谷氨酰胺代谢通路被认 为和细胞的氧化还原稳态密切相关, 因此, 胰腺癌细 胞需要将非经典谷氨酰胺代谢途径与细胞的氧化还 原状态偶联到一起, 其调控分子机制引起了我们极 大的兴趣。

3 MDH1精氨酸甲基化偶联谷氨酰胺代 谢和氧化还原状态<\/strong>

我们的工作发现, 胰腺癌细胞通过调控MDH1的甲基化状态将谷氨酰胺代谢和细胞内的氧化还原 状态相偶联。除了在非经典谷氨酰胺代谢中发挥 功能外, MDH1同时也是苹果酸–天冬氨酸穿梭途径 中的重要蛋白, 负责将糖酵解产生的还原力NADH 转移到线粒体内用于线粒体呼吸[25] 。蛋白精氨酸 甲 基 转 移 酶4(protein arginine methyltransferase 4, PRMT4, 又称CARM1)对非经典谷氨酰胺代谢通路 中重要的代谢酶MDH1进行甲基化修饰。MDH1的 主要甲基化位点是第248位精氨酸(R248)。CARM1 介导的R248甲基化可以通过阻断MDH1蛋白的二聚 化进而抑制其催化活力(图2), 从而降低胰腺癌细胞 的线粒体呼吸和谷氨酰胺代谢活性[26] 。

当细胞处在氧化压力下时, CARM1的甲基转 移酶活力显著下降。MDH1的甲基化水平相应降低, 而MDH1的催化活力显著增强, 确保胰腺癌细胞通 过谷氨酰胺代谢通路产生更多的NADPH, 为对抗氧 化压力提供还原力(图3)。因此, CARM1可作为细胞 氧化还原状态的感受器, 维持细胞氧化还原平衡[26] 。

另外, KRAS的激活突变下调CARM1蛋白的表 达水平, 进而降低MDH1的R248甲基化, 从而促进胰 腺癌细胞的谷氨酰胺代谢, 维持胰腺癌细胞的快速 生长和增殖(图3)。更重要的是, 在临床胰腺癌组织 中, MDH1呈现高表达状态, 而CARM1处于低表达 状态。相应地, 胰腺癌细胞中MDH1的甲基化处于 较低水平, 其活力显著增强[26] 。这些证据充分表明, MDH1的甲基化调控在胰腺癌代谢以及胰腺癌发生发展中发挥重要作用。

胰腺癌细胞通过调控MDH1的甲基化水平将细 胞内的氧化还原稳态和非经典谷氨酰胺代谢偶联 到一起。这种调控机制提示我们, CARM1的激活剂 或MDH1的抑制剂可用于干预胰腺癌的谷氨酰胺代 谢。目前, 许多研究正在设计和开发针对CARM1的 小分子激活剂[27] 。胰腺癌代谢特征的逐步揭示将为 我们干预胰腺癌代谢提供更多的药物靶点和治疗策 略。<\/p>



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参考文献 (References)<\/strong>
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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-40-24-295.jpg","cshort":"

雷群英, 博士, 教授, 博士生导师。 1993年获江西医学院学士学位, 1999年获苏州医学院硕士学位, 2002年获上海医科大 学医学博士学位, 之后在美国加州大学洛杉矶分校做博士后研究, 2006年进入复旦大学。<\/span><\/p>","cshort2":"

雷群英, 博士, 教授, 博士生导师。 1993年获江西医学院学士学位, 1999年获苏州医学院硕士学位, 2002年获上海医科大学医学博士学位, 之后在美国加州大学洛杉矶分校做博士后研究, 2006年进入复旦大学，雷群英教授迄今发表SCI论文50余篇, 曾获教育部自然科学一等奖和二等奖、上海市三八红旗手、第十届中国青年女科学 家奖、普康奖教金和上海市牡丹奖等奖项。雷群英教授及其合作者程金科教授、王 义平博士近期在Molecular Cell上发表的研究成果发现了胰腺癌非经典谷氨酰胺代谢 的调控机制。<\/span>
<\/p>","ctitle":"胰腺癌通过调控非经典谷氨酰胺代谢 维持氧化还原稳态","listseq":42,"seqno":"18","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-14-03-42-423"},{"caddress1":"(中国科学院干细胞生物学重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越中心, 中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学医学院健康科学研究所, 上海 200031 )","cauthor":"朱哲鑫 金 颖*","cintpic":"","clicktime":181,"clong1":"

1 相关研究背景及进展介绍<\/strong>
人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)分离自人胚胎内细胞团, 具有无限的自我更 新和多向分化的潜能。因此, hESCs是研究人类早 期胚胎发育的优良工具, 也是未来临床器官修复治 疗的重要细胞来源[1-2]。为了更好地认识hESCs的潜 能, 我们有必要对hESCs特性的建立和维持进行全面 的研究。维持细胞命运所需要的表观遗传调控体现 在不同的染色质层次上—组蛋白修饰[3]、DNA甲 基化修饰、ATP依赖的染色质重塑子以及组蛋白 变体。比如H3.3极其特异性的分子伴侣, 相对于 DNA复制依赖型的经典组蛋白H3.1和H3.2, 非经 典的组蛋白变体H3.3A和H3.3B在整个细胞周期中 泛表达, 起初它们在染色质上的富集被认为是一种 活化的染色质修饰[4], 但随后的研究表明, 这些变 体也存在于基因组的转录沉默位点[5]。在小鼠胚 胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)中, 通过对全基因组的H3.3进行ChIP-seq(chromatin immunoprecipitation-sequencing)分析发现, HIRA(组 蛋白分子伴侣, 能将H3.3以细胞周期非依赖性的方 式掺入到染色质中)依赖的H3.3不仅置入到活跃表 达基因的启动子区域, 而且也存在于发育相关基 因的启动子区域[6]。考虑到hESCs和mESCs存在着 巨大的不同, 因此, 我们十分有必要对HIRA依赖的 H3.3置入在hESCs自我更新中的作用进行研究。<\/span>

除了表观遗传修饰之外, 细胞代谢状态对干 细胞的命运决定也发挥着重要的作用[7-8]。比如, α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, α-KG), 双加氧酶的重 要辅因子, 三羧酸循环的中间产物, 也是Jumonji family组蛋白去甲基化酶和ten-eleven translocation family DNA羟化酶等双加氧酶的辅因子[9-10]。最 近的研究还显示, α-KG能够维持mESCs的多能性[11]; 但在hESCs分化过程中, 往分化诱导培养液中添加 α-KG能够促进细胞的分化[12]。但是, α-KG在hESCs 自我更新中的作用还没有被报道; 此外, 对产生 α-KG的异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是如何受到表观调控的也没被很好地阐释 过。因此, 我们很有必要对维持hESCs自我更新机 制, 表观–代谢环路进行深入研究。<\/span>

2 在全基因组范围内利用siRNA对维持 hESCs特性具有重要作用的转录因子进 行筛选<\/strong>
为了系统地鉴定维持hESCs自我更新的重要 因子, 我们首先建立了1株无动物源成分的SHhES8 hESCs细胞系, 并构建了OCT4启动子驱动的EGFP报 告系[13]。借助此报告系, 我们利用Human siGENOME siRNA Library-Transcription Factors-SMARTpool 进 行了高通量结合裸眼观测细胞形态的双重筛选手 段, 一共得到了25个候选基因, 其中包括OCT4[14]、 RUVBL2[15]、SFRS2[16]等已知对ESCs自我更新具有重要作用的因子。这些实验充分说明了我们的筛选系 统具有有效性和可靠性。<\/span>

3 PHB在维持hESCs表观–代谢环路中的 重要作用<\/strong>
我们课题组对上述筛选出的25个基因进行了 研究, 我们的研究主要集中在抗增殖蛋白(prohibitin, PHB)上。PHB是一个32 kDa大小的泛表达的蛋白, 参与细胞能量代谢、细胞增殖、转录调控和肿瘤发 生等过程[17-20]。我们的研究发现, PHB对维持hESCs 自我更新特性具有非常重要的作用(图1)。特异性地 敲低PHB后, hESCs会出现明显的分化表型; 更重要 的是, 敲低PHB后, hESCs会出现组蛋白甲基化修饰 的异常。我们借助于IP/MS技术手段, 发现PHB能和 HIRA发生特异性的相互作用。进一步借助染色质免疫共沉淀(ChIP)技术, 我们发现, PHB/HIRA共同 调控了一系列基因, 包括多能性相关基因、发育相 关基因的转录调控, 特别是对异柠檬酸脱氢酶(IDH) 的调控, 进一步控制了α-KG的产生, 从而影响了双 加氧酶的活性, 塑造着染色质构象, 进一步决定着 hESCs的特性。<\/span>

4 本研究的意义<\/strong>
hESCs拥有分化为机体内所有细胞类型和在合 适的培养条件下无限自我更新的潜能, 在再生医学 领域是非常珍贵的细胞来源, 而且对于在体外研究 人胚胎发育也是不可或缺的工具[1-2]。我们的研究不 仅发现了一个新的hESCs自我更新调控的基因, 更 重要的是, 揭示了表观通路对一个维持hESCs染色 质地貌和特性的关键代谢产物的调控。<\/span>

虽然在众多细胞系中, 关于PHB多方面的功能 已经有很多研究, 然而它在hESCs中的作用是未知 的。我们的研究表明, PHB通过与HIRA复合体相 互作用, 对维持hESCs未分化的状态起到重要作用。 我们的多方面实验数据表明, PHB是HIRA复合物的 新组分: (1)PHB和HIRA复合物的每个已知组分都有 相互作用; (2)hESCs全细胞裂解液通过体积排阻色 谱时, PHB存在于对应复合物分子量的洗脱组分里; (3)PHB siRNA导致复合物的每个组分蛋白水平下 降, 提示其可能作为支架蛋白稳定整个复合物; (4) PHB缺失的hESCs和HIRA缺失的hESCs有相似的表 型, 包括细胞形态、标记基因表达谱、组蛋白甲基化、 α-KG水平和基因组水平H3.3的置入谱(deposition profile)变化。因此, PHB很可能是调控的H3.3置入 染色质的HIRA复合物的重要新组分。<\/span>

我们的研究中另一个亮点是, 揭示了HIRA复 合物以及H3.3置入对异柠檬酸脱氢酶(IDH)转录的 调控, 阐释了表观遗传修饰对于代谢通路的调控。 最近有很多研究关注代谢产物对表观状态的调控, 如乙酰辅酶A的前体醋酸酯可以阻断早期的组蛋 白去乙酰化, 并延迟多能性细胞的分化[21]。但是, 表观遗传对代谢通路的作用和机制还有待研究。 我们的数据表明, PHB-HIRA复合物通过调控H3.3 在异柠檬酸脱氢酶启动子区域的置入与其他表观 调控因子相互协同, 来维持异柠檬酸脱氢酶的基因 表达和α-KG的产生。反之, 此代谢产物也能调节 维持表观修饰的关键酶。<\/span>

综上所述, 我们的研究揭示了一个表观遗传和 代谢通路相互作用的环路。我们发现, α-KG维持 hESCs特性的重要作用和最近报道的其在mESCs 中的作用一致[22], 证明α-KG对于哺乳动物细胞多能 性的维持具有保守的功能。PHB参与了多个信号通 路以及细胞生存、代谢、肿瘤形成和炎症等生物学 过程。重要的是, 靶向PHB的药物研发进入了临床 实验阶段[20], 揭示了其在疾病和健康中的潜在作用。 我们的研究首次发现了PHB的全新功能, 包括在 hESCs中对染色质地貌和代谢产物的表观调控, 阐 释了其在细胞命运决定中的重要作用。针对PHBHIRA 复合物非依赖的功能的深入研究将更全面地 了解PHB的特性和功能。<\/span>
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参考文献 (References)<\/strong>
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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-32-46-187.jpg","cshort":"

金颖, 中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学健康科学研究所研究员。 1983年于中国医科大学获得医学学士学位; 1988年于北京协和医科大学/中国医 学科学院基础医学研究所获得理学博士学位; 博士毕业后分别在美国北德克萨 斯州医学中心和美国德克萨斯大学西南医学中心进行博士后训练; 1999年底, 金 颖博士放弃了国外优越的生活与科研条件, 毅然回到国内出任上海交通大学医学 院基础医学院研究员。<\/span><\/p>","cshort2":"

金颖, 中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学健康科学研究所研究员。 1983年于中国医科大学获得医学学士学位; 1988年于北京协和医科大学/中国医 学科学院基础医学研究所获得理学博士学位; 博士毕业后分别在美国北德克萨 斯州医学中心和美国德克萨斯大学西南医学中心进行博士后训练; 1999年底, 金 颖博士放弃了国外优越的生活与科研条件, 毅然回到国内出任上海交通大学医学 院基础医学院研究员; 2001年起担任健康科学研究所干细胞研究课题组组长; 2006年起担任中国科学院干细胞生物学重点实验室主任。此外, 金颖研究员还出任国际干细胞学会会员、中国细胞生物学会干细胞分会常务委员、 上海细胞生物学学会理事。金颖研究员领导的研究团队主要从事多能干细胞自 我更新及发育多能性的分子机制和多能干细胞向神经谱系分化的分子调控的研 究。该团队建立了多株人ESC系和正常人及疾病患者体细胞来源的诱导性多能 干细胞系。利用这些细胞系, 他们回答了干细胞命运决定分子调控机制中的若干 重要科学问题; 建立了人早期器官形成期的全基因组表达谱式, 阐明胚胎形态与 基因表达谱之间的变化规律; 建立了人胚胎干细胞定向神经分化的技术体系。他 们的主要研究成果集中在揭示多能干细胞关键转录因子如何建立自我更新的调 控环路和如何抑制诱导多能干细胞分化的信号通路上, 为体外大量扩增和定向诱 导多能干细胞的分化奠定了分子基础。最近, 他们通过大规模siRNA筛选, 鉴定出了一批对人胚胎干细胞特性的维持具有重要作用的因子。金颖研究员在Cell Stem Cell(2011和2016)、JCI(2013)、Development Cell(2010)、PNAS(2010)、EMBO R(2014)、Cell Research(2016)等国际著名学术期刊发表了一系列原创性成果。<\/span><\/p>","ctitle":"人胚胎干细胞自我更新特性维持的表观–代谢调控新机制","listseq":43,"seqno":"17","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-14-02-19-215"},{"caddress1":"(中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所, 上海 200031)","cauthor":"马云青 常 兴*","cintpic":"","clicktime":16,"clong1":"

1 单核苷酸基因编辑的现状<\/strong>

单核苷酸多样性是遗传多样性的主要来源, 是 分子进化的动力和很多疾病的直接诱因[1] 。例如, 单 核苷酸的多样性与肿瘤的发生息息相关, 大量测序 结果表明, 原癌基因和抑癌基因上的单核苷酸突变 是肿瘤发生的重要原因[2] 。除此之外, 激酶结构域是 肿瘤药物的治疗靶点, 然而编码激酶结构域基因中 的单核苷酸突变赋予肿瘤细胞耐药性, 向肿瘤治疗 提出了更高的挑战[3] 。另外, 因为单核苷酸的改变大 多不会破坏蛋白质的整体结构, 同时改变蛋白的功 能, 因此是分子进化的重要机制之一。<\/span>

尽管单核苷酸突变是很多疾病的直接诱因, 但 无法通过常规的基因敲除或过表达来研究单核苷酸 突变与基因功能的关系。因此, 急需一种筛选工具 在基因组上靶向诱导单核苷酸突变, 产生大量多样 的功能突变体, 以用于研究单核苷酸突变与基因功 能的关系。<\/span>

由于哺乳动物基因组的高度稳定性, 在哺乳 动物细胞内很难高效和高通量地诱导单核苷酸的 突变[4] 。另外, 实验室现有的体内单核苷酸突变方 法有其局限性, 如物理方法—紫外辐射, 突变频 率为1×10–10 ; 化学方法 —烷化剂乙基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea, ENU), 引起错配, 单核苷酸 突变或者缺失, 突变频率为(1~1.5)×10–5[5] 。这些方 法效率极低, 且产生的突变方向随机, 突变图谱不均 一, 限制了它们的应用, 往往需要很大的工作量去确 定突变的位点。<\/span>

作 为 细 菌 中 的 适 应 性 免 疫 机 制, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9[(CRISPR)-associated protein 9]是 近 年 来发展的一种便捷的基因组编辑技术, 可以使目标 基因删除和插入, 这些应用都是基于在sgRNA的介 导下, Cas9蛋白在目的基因处切割, 形成双链DNA断 裂(double strand breaks, DSBs), 从而对基因组进行 编辑[6-8] 。除此之外, 当RuvC结构域和HNH结构域同 时处于失活状态时(D10A&H840A; RuvC– &HNH– ), Cas9将不具有核酸酶活性, 成为dCas9(dead Cas9) [9] , 同样可以作为基因编辑工具。dCas9虽然没有剪切 DNA的能力, 但仍然可以在gRNA的引导下与特定 的DNA序列结合。前期研究表明, 通过将特定的转 录激活因子和抑制因子与dCas9复合体融合, 能够精 确地激活或沉默基因表达。例如, dCas9与多个VP16 结构域或KRAB(Kruppel-associated box domain)结合 进行转录激活或抑制。同时与相应的功能域结合,还能进行表观遗传修饰[10-11] 。<\/span>

虽然CRISPR/Cas9方法可以精确地对DNA进行 编辑, 但受限于同源DNA修复的效率低的缺点, 因 此现在主要用于基因的敲除, 无法高效产生单核苷 酸突变[6-8] 。因此, 如何高效地在细胞内引入单核苷 酸突变被认为是基因编辑领域的重大挑战之一。<\/span>

与大部分体细胞不同, 适应性免疫系统在B淋 巴细胞激活过程中可以对B细胞基因组的特定区 域进行高效编辑, 作为一种“突变自我”的机制, 对 抗原受体的可变区进行高频突变, 近乎无限的抗原 受体库, 用以抵御可能的病原体入侵[12-13] 。生发中 心B细胞特异性表达的激活诱导的胞嘧啶脱氨酶 (activation-induced cytidine deaminase, AID)是体细 胞高频突变的分子基础。AID将胞嘧啶脱氨基形成 尿嘧啶, 产生U-G碱基错配。U-G错配有两种修复路 径。第一种是, 如果错配不被及时修复, 在DNA复制 过程中, 产生C-T和G-A的突变。第二种是, U-G错配 被尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-N-glycosylase, UNG) 切除, 产生无嘧啶位点, 通过碱基切除修复引入非模 板依赖性的单核苷酸突变。前期研究表明, 在非B 细胞系中, 外源表达的AID突变效率会大幅下降, 且 AID的作用位点缺少靶向性[14] 。为解决这两个问题, 我们采用CRISPR/Cas9技术。<\/span>

基于这些背景, 我们猜想, 通过dCas9蛋白与 AID融合, 将哺乳动物(体细胞高频突变)和古生菌的适应性免疫系统(CRISPR)结合, dCas9可以在sgRNA 的靶向作用下, 将AID招募到靶向区域, 并且可以提 高AID的局部浓度, 有效提高和扩展AID作用范围, 在非B细胞中针对特定基因实现高频突变, 产生遗 传多样性(图1)。<\/span>

2 靶向性胞嘧啶脱氨酶(targeted AIDmediated mutagenesis, TAM)的靶向性和 高效性<\/strong>

为检测dCas9-AID融合蛋白的单核苷酸突变效 率, 我们首先在293T细胞中建立报告系统, 将绿色荧 光蛋白基因整合入293T基因组中。该绿色荧光蛋 白基因中部插入终止密码子TAG, 绿色荧光蛋白无 法正常表达; 只有当TAG突变向TAC/TAT时, 绿色荧 光蛋白才能正常表达。因此, 通过流式检测EGFP阳 性的细胞比例来指示单核苷酸突变效率。在报告细 胞中共转表达sgRNA和dCas9-AID两种质粒, 其中 sgRNA是针对EGFP终止密码子TAG的上下游100 bp 设计的4个sgRNA, 同时设置对照组在报告细胞中单 转AID。在转染后第7 d流式检测, AID组的EGFP+ % 约0.2%, 而共转dCas9-AID和针对TAG终止密码子 的sgRNA组的EGFP+ %达到2%, EGFP+ %得到10倍提 高。实验结果证明, dCas9-AID融合蛋白能有效纠正 GFP中的终止密码子(TAG)。<\/span>

为了进一步优化dCas9-AID系统的效率, 我们将dCas9与不同的AID突变体融合, 其中, dCas9- P182X(C端核输出信号删除的AID突变体)效率最高, 相对于dCas9-AID效率得到2倍提高。因此, 我们使用 dCas9-P182X(dCas9-AIDx)进行后续实验。为了证明 确实是由AIDx与dCas9融合才赋予dCas9-AIDx融合 蛋白单核苷酸突变功能, 我们在报告子系统中分别共 转Cas9、dCas9、dCas9-AIDx(E58Q)(AID脱氨酶失活 突变体)、dCas9-AIDx和针对EGFP中终止密码子的4 个sgRNA, 只有dcas9-AIDx组EGFP+ %为5.2%, 而其他 组均为0。这一实验结果表明, 确实是AIDx与dCas9 的融合才使整个系统具有单核苷酸突变功能。<\/span>

通过流式在蛋白水平检测EGFP+ %的水平来指 示单核苷酸突变频率, 这只是一种比较便捷的评估方 式, 更直接、精确的方法是通过高通量测序来检测单 核苷酸突变频率的高低。因此, 我们抽提细胞基因组 DNA, 通过PCR将目的基因EGFP加上接头序列, 通过 illumina高通量测序来检测单核苷酸突变频率。<\/span>

单独转染AIDx会在EGFP整个基因上均匀产生 单核苷酸突变, 并且突变频率只有1%~2%, 与之前 的报道吻合[14] 。然而, 共转dCas9-AID和针对终止 密码子的4个sgRNA的报告细胞, 约20%的DNA分子 含有至少1个突变碱基; 并且这些突变主要集中在 EGFP基因中TAG终止密码子上下游150 bp。与AID 本身性质相似, 胞嘧啶和鸟嘌呤是dCas9-AID组的主 要突变碱基, 占总突变碱基的80%以上。<\/span>

对sgRNA靶向区域进行具体分析, 无论是外源 性基因EGFP还是内源性基因AAVS1, dCas9-AIDx都 能使靶向区域超过50%的胞嘧啶和鸟嘌呤产生突变, 而AIDx只能使低于20%的碱基突变。更重要的是, 与AIDx对比, dCas9-AIDx使碱基突变频率得到10倍 提高, 靶点区域碱基突变频率提高到4×10–4 (次/碱基 /细胞周期), 这种效率相当于B细胞生发中心反应过 程中, 体细胞高频突变水平。由此可见, 外源表达的 dCas9-AIDx对胞嘧啶和鸟嘌呤具有高效编辑作用。<\/span>

3 TAM引入多样化突变并且摆脱对AID 对一级序列的依赖性<\/strong>

根据AID的生化性质, AID将胞嘧啶(C)脱碱基 产生尿嘧啶(U)。因此, 如果在非B细胞内过表达 AID, 会产生C向T和G向A的碱基突变类型[10] 。令我 们感到惊喜的是, dCas9与AIDx融合之后, 碱基突变 方向更加多样化。dCas9-AIDx产生的单核苷酸突变方向更加均一化, 打破了原来的单一化格局, 更有利 产生多样均一的突变类型。<\/span>

由这种现象对dCas9-AIDx的突变修饰路径提 出一种假设。AID作用于单链DNA的胞嘧啶(C)上, 使胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶(U)。随后U-G错配有两 种命运。第一种命运, 这种错配方式未被及时修复, 在DNA复制中被保留, 形成C-T和G-A的单核苷酸 突变。第二种命运, 错配碱基U被UNG切除, 形成无 嘧啶位点, 随后在无嘧啶位点处随机掺入A、T、C、 G等4种碱基。而dCas9-AIDx融合蛋白抑制第一条 路径, 从而使碱基突变方向更加多元化。碱基突变 方向的多样化, 更有利于产生不同的蛋白突变体, 用 于功能筛选。<\/span>

除了能够使碱基突变方向多样化之外, dCas9- AIDx给我们的另外一个惊喜是, dCas9-AIDx使AIDx 摆脱对特定DNA一级序列的依赖性。AID发挥胞 嘧啶脱氨酶活性, 强烈依赖于特定的DNA一级序列, 具有活跃作用序列(A/T)GCN(N指任意碱基) [11] 。分 别统计AIDx和dCas9-AIDx诱导的突变碱基上下游 碱基组成, 令突变碱基C为第0位。AIDx具有活跃 作用序列(A/T)GCN(N指任意碱基), 而对于dCas9- AIDx组, 在突变碱基上游–1、–2位, 下游+1位, 4种 碱基均匀分布。因此, dCas9-AIDx除了具有高效的 单核苷酸突变能力和多样化的单核苷酸突变方向 外, 还摆脱了对DNA一级序列的要求。<\/span>

4 UGI提高TAM效率, 固定其突变类型, 并揭示其在DNA上的作用轨迹<\/strong>

UGI(uracil glycosylase inhibitor)作为一种噬菌 体蛋白, 当噬菌体入侵大肠杆菌时, 可以保护自身的 基因组免受宿主UNG(uracil N-glycosylase)的修复, 因此, UGI是UNG的抑制剂, 使UNG无法将AID产生 的U切除, 无法完成下游修复[15] 。共转dCas9-AIDx、 UGI和单个sgRNA使单核苷酸突变效率得到10倍提 高。除此之外, 加入UGI后, 突变方向更加单一, 只 保留C-T和G-A突变。<\/span>

UGI的使用更有利于我们揭示dCas9-AIDx的 作用轨迹。以PAM(protospacer adjacent motif)序列 中NGG中的N为0位。其上游为负(–), 下游为正(+), dCas9-AIDx主要在间隔序列区域造成突变, 而且 突变最高点是在PAM序列+12和+16位。因此利用 TAM的这一特点, 我们可以在DNA上产生特异的点突变。<\/span>

5 碱基编辑新技术的应用<\/strong>

靶向性抗肿瘤药物, 直接特异性的抑制促癌 基因的活性, 是近几十年来肿瘤治疗的突破性进 展, 但随后的临床实践发现, 很多肿瘤都对靶向性 药物产生了耐药。其中, 编码靶点蛋白的DNA中 产生单核苷酸突变, 是肿瘤细胞对肿瘤药物产生耐 受性的重要原因[3] 。在慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)的治疗中, 针对原癌基 因BCR-ABL位点的伊马替尼(Imatinib)药物, 是第一 个开发成功的靶向性药物。Imatinib可以和ATP竞 争, 与ABL(abelson murine leukemia viral oncogene homolog)激酶结合, 从而使ABL激酶处于低活性, 抑 制肿瘤的生长[16-17] 。但在病人样本中发现, 在ABL基 因的酪氨酸激酶活性结构域发生单核苷酸突变, 失 去结合Imatinib的能力, 产生耐药性。针对这些突 变, 制药公司开发或正在开发新一代的抑制剂, 以挽 救病人的生命。因此, 我们认为, 如果可以预测出 Imatinib的耐药性突变, 可以加快新药开发的速度, 造福更多的病人。<\/span>

为筛选Imatinib耐药性位点, 针对ABL基因的 酪氨酸激酶活性结构域中编码ATP结合位点序列设 计sgRNA。在慢性髓样白血病细胞系K562(含BCRABL融合基因)中建立稳定表达dCas9-AIDx融合蛋 白的细胞系, 随后转染针对AAVS1或ABL激酶结构 域的sgRNA库。连续进行Imatinib药物处理2~3周 后, 阴性对照组(转染AAVS1 sgRNA或未感染任何sgRNA)细胞全部死亡, 而实验组细胞数目开始增长, 提示有一些细胞获得了耐药性。<\/span>

收集获得耐药性细胞的RNA和基因组DNA后, 对ABL基因第6个外显子进行高通量测序。数据分 析表明, 约30%的DNA分子发生C944T, 即氨基酸发 生T315I突变。T315I是在CML病人中发现的第一个 耐药性位点。除此之外, 我们还发现6个新的有义突 变。在后续实验中, 我们进一步证明这些新突变位 点可以赋予K562耐药性, 并且细胞耐药性的强度跟 筛选过程中对应的单核苷酸突变频率成正比。以此 为例, 我们的结果表明, 利用TAM技术可以有效地 预测和筛选对抑制剂耐受的点突变, 为研究大分子– 小分子的相互作用和新的药物设计提供新的思路。<\/span>

6 总结
<\/strong>
与其他基因编辑方向相比, 靶向性激活诱导 的胞嘧啶脱氨酶(AID)介导的核苷酸突变(targeted AID-mediated mutagenesis, TAM)新技术具有独特的 功能: (1)在不存在UGI的情况下, 胞嘧啶可以随机 的向其他三个碱基转变; (2)dCas9-AID融合蛋白的 活性只依赖于sgRNA, 与AID的识别的一级序列无 关; (3)dCas9-AID可以同时诱导多个胞嘧啶的突变, 同时这一方法不依赖于DNA切割和修复, 可以大幅 提高单碱基精确编辑的效率, 避免了DNA的双链断 裂。因此作为遗传操作的新技术, TAM可以诱导功 能获得型的突变, 有着广泛的应用前景, 为分子进 化、基因治疗和在单碱基水平上分析基因调控元件 等领域提供新的方法(图2)。<\/span>
<\/p>


dCas9-AID融合蛋白, 被sgRNA招募到相应的基因组DNA上, 随机诱导胞嘧啶和鸟嘌呤的点突变, 从而实现体内特定DNA序列的多样化, 通过遗 传筛选, 高通量分析单核苷酸突变的功能。
Guided by sgRNAs, dCas9-AID fusion protein is recruited to endogenous genomic loci to induce somatic hypermutation in designated DNA sequence. Subsequently through genetic screening are biological functions of SNVs characterized.
图2 利用dCas9-AID融合蛋白诱导基因组原位点突变的示意图
Fig.2 A carton showing to use dCas9-AID fusion protein to induce somatic hypermutation in mammalian cells<\/p>


除了我们的研究外, 另一研究发现, dCas9-AID 融合蛋白结合MS2-MCP(MS2 coat protein)系统可以 有效编辑胞嘧啶, 产生多样化的突变类型, 并且编 辑窗口更加大, 在PAM上下游各50 bp[18] 。和我们的 发现类似, 另两项研究也先后发现, 在UGI存在的情 况下, nCas9(Cas9 D10A突变体)与不同类型的胞嘧 啶脱氨酶融合可以高效地诱导胞嘧啶向胸腺嘧啶转 变, 并且其活性只局限于间隔序列的特定碱基, 因 此可以实现高效率的单碱基精确编辑[19-20] 。这些研 究一起证明了靶向性的胞嘧啶脱氨酶作为基因编辑 工具的可行性和优势。后续的研究将进一步提高这 一系统的效率以及扩展突变的类型(如A/T碱基的修 饰)。<\/span>
<\/p>

参考文献 (References)<\/strong>
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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-40-46-237.jpg","cshort":"

常兴, 中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所研究员, 博士研究生导师。2001年获北京大学理学学士, 2006年获美国俄亥俄州立大学博士学位, 2007年至2011年在耶鲁大学免疫学系从事博士后研究; 2011年至2012年在拉霍亚感染和免疫研究所任研究科学家。常兴课题组主要研究淋巴细胞发育和免疫耐受的分子机制。<\/span><\/p>","cshort2":"

常兴, 中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所研究员, 博士研究 生导师。2001年获北京大学理学学士, 2006年获美国俄亥俄州立大学博士学位, 2007年至 2011年在耶鲁大学免疫学系从事博士后研究; 2011年至2012年在拉霍亚感染和免疫研究所任研究科学家。常兴课题组主要研究淋巴细胞发育和免疫耐受的分子机制。在国际学术杂志Nat Methods、Immunity、elife、 J Exp Med、Blood、J Immunol上发表学术论文20余篇, 多篇论文及学术 成果被国际权威杂志重点报道。近期, 在Nat Methods上发表的研究成果发现, 当把核酸酶缺陷的Cas9蛋白和诱导抗体高频突变的胞嘧啶脱氨酶 AID融合后, 在sgRNA靶向的基因组DNA上, 胞嘧啶和鸟嘌呤可以随机的向其他三个碱基转变。这一新方法可以对细胞内的特定DNA序列进行多样化, 完成遗传筛选, 从而分析单核苷酸突变的功能, 或者直接在哺乳动物细胞内诱导蛋白进化。<\/span><\/p>","ctitle":"AID介导的原位靶点突变——哺乳动物DNA碱基编辑新技术","listseq":44,"seqno":"16","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-13-59-32-374"},{"caddress1":"(1武汉大学人民医院心血管内科, 武汉 430071; 2武汉大学基础医学院, 武汉 430071; 3武汉大学动物实验中心/ABSL-III实验室, 武汉 430071)","cauthor":"王丕晓1<\/sup> 陈明明1<\/sup> 沈立君1<\/sup> 李红良1,2,3*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":19,"clong1":"

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)被认为是全身性代谢综合征在肝 脏的表现, 后者的主要表现包括高血压、血脂异常、 糖尿病、肥胖等。NAFLD患病人数逐年增加, 已逐 渐成为最常见的慢性肝病类型。非酒精性脂肪性肝 炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH) 是NAFLD较 为严重的进展阶段, 表现为严重的肝脏脂肪堆积、 炎症反应和纤维化。临床研究表明, NASH患者十 年内肝硬化和肝癌发生率高达25%, 预计NASH将成为未来十年肝移植的主要原因[1-2]。然而, 目前临床 上尚无有效治疗NASH的药物, 原因主要在于NASH 发病存在很大的异质性, 且决定NASH进展的关键 机制尚不明确。当前, NASH的治疗策略主要是改 善不良的饮食习惯和生活方式以及控制并发的代谢 综合征。然而, 这些措施往往收效甚微[3-5]。因此, 找 到更加特异性的作用于肝脏, 尤其是针对NASH进 展关键环节—炎症及纤维化的靶向治疗药物, 是 一件急迫且重要的科学任务。<\/span>

我们团队长期致力于研究天然免疫与心血 管、代谢疾病的关系及作用机制[6-7]。CASP8和 FADD(Fas-associating protein with death domain) 样凋亡调节因子(CASP8 and FADD-like apoptosis regulator, CFLAR)是天然免疫调控网络重要分子, 我 们之前的研究发现, CFLAR在病理性心脏重构过程 中发挥抗凋亡、抑制炎症及纤维化的作用[8-9]。在 NASH的前期研究中, 我们利用小鼠及人体的NASH 肝脏样本开展了大量的潜在调控靶分子筛选工作, 其中, 发现CFLAR蛋白含量与NASH的疾病进展呈 负相关, 提示CFLAR在NASH进程中可能发挥重要 作用。此外, 临床研究报道了CFLAR在人体多个器 官中对炎症、纤维化的显著调控功能[10-12]。另一方 面, 肝脏的根本功能依赖于其对代谢的调控, 大量证 据显示, 慢性代谢异常是肝细胞损伤和肝功能障碍 的主要原因[13-14]。由此, 我们的目的是探索CFLAR 对肝脏代谢的调控作用, 尤其是阐明CFLAR是否可 以作为NASH的治疗靶点[15]。<\/span>

1 肝细胞中CFLAR抑制肝脏脂质堆积、 炎症并改善胰岛素抵抗<\/strong>

为了明确CFLAR参与脂肪肝的发病过程, 我们 首先检测了CFLAR在饮食引起的代谢紊乱小鼠多 个组织器官中的表达。结果发现, 与正常小鼠相比, CFLAR蛋白含量在脂肪肝中显著地减少, 而在脂肪 及骨骼肌等代谢相关组织器官中没有明显变化。为 了进一步确认这一发现, 我们收集了人体NASH肝 脏活检样本进行临床相关性研究, 结果证实, 肝脏中 CFLAR的蛋白含量与NASH的疾病进展呈负相关。 随后, 我们构建了肝细胞特异性CFLAR基因敲除小 鼠以及肝细胞特异性CFLAR转基因小鼠。通过给予 高脂饮食喂养诱导脂肪肝疾病模型, 动物实验结果 证实了CFLAR对NASH的中心环节肝脏脂质堆积、 炎症和胰岛素抵抗的关键抑制作用。<\/span>

2 CFLAR发挥作用的分子机制<\/strong>

随后, 我们进行了深入的分子机制探索。首 先, 通过检测多条可能参与NASH进展的信号通 路的活性, 我们发现, CFLAR特异性地抑制ASK1- JNK1级联信号通路的激活。同时, 与正常肝组织 相比, NASH肝脏组织中ASK1-JNK1处于过度激 活状态。接下来, 我们重点探索CFLAR如何抑制ASK1的激活。通过分子间相互作用实验, 我们发 现, CFLAR(203~260) 和CFLAR(414~480)两个片 段[分别命名为CFLAR(S1)和CFLAR(S2)]可以与 ASK1直接结合。然而, 随后的功能实验证实, 只 有CFLAR(S1)可以阻断ASK1-JNK1信号通路的激 活, 而CFLAR(S2)以及CFLAR(S1)和CFLAR(S2)的 连接体[命名为CFLAR(S3)]均不能有效抑制ASK1 的激活。CFLAR(S1)与全长CFLAR对ASK1的作 用方式完全相同, 但是CFLAR(S1)比CFLAR全长 更稳定, 抑制作用也更强。同时, 我们惊喜地发现, CFLAR(S2)片段与E3泛素连接酶ITCH结合, 导致 CFLAR泛素化修饰并随后被蛋白酶体降解, 揭示了 上述脂肪肝中CFLAR蛋白含量减少的原因。<\/span>

ASK1形成二聚化及随后发生自磷酸化导致 ASK1激活[16]。N-末端卷曲螺旋(N-terminal coiled coil, NCC; 氨基酸297~324)和C-末端卷曲螺旋(C-terminal coiled coil, CCC; 氨基酸1 239~1 295)结构域负责 ASK1的N-末端和C-末端的二聚化[16]。我们观察到, CFLAR(S1)片段特异性地结合在ASK1的N-端, 通过 抑制ASK1的N-端二聚化形成, 阻断ASK1激活(图1A 和1B)。肿瘤坏死因子受体相关蛋白(tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF)与ASK1结合, 促进ASK1的过度活化[16-17]。除了抑制ASK1的N-端 二聚化形成, 我们的结果还证实了CFLAR可以竞争 性地阻断TRAF6与ASK1的结合, 从而强有力地抑制 ASK1的过度活化。<\/span>

3 CFLAR对NASH的治疗效果<\/strong>

最后, 我们用CFLAR(S1)治疗小鼠及猴子的 NASH及并发的代谢综合征。腺相关病毒(adenoassociated virus, AAV)是一种复制缺陷型微小病毒, 由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂 细胞)、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长 等特点, 被视为最有前途的基因转移载体之一。此 外, 不同AAV血清型具有特异的组织器官亲和性, 如 AAV8载体表现出明显肝嗜性, AAV9载体则更特异 性地靶向心脏[18]。于是, 我们利用AAV8构建编码 CFLAR(S1)序列的重组表达载体, 体内注射靶向肝 脏治疗小鼠及猴子的NASH。小鼠实验结果显示, 与对照组相比, 肝脏中表达CFLAR(S1)显著减轻并 逆转肝脏脂肪堆积和炎症, 同时, 胰岛素抵抗也得 到显著改善。然而, 研究表明, 小鼠的疾病进展特点与人体疾病的病理生理过程有较大差别[19], 为了 更加确信CFLAR的治疗效果及其临床转化潜能, 我 们从野生猴群中筛选了18只代谢综合征倾向的猴 子, 且肝脏活检证实NASH发病。通过门静脉注射 AAV8-CFLAR(S1)治疗, 结果证实, CFLAR显著阻 断并逆转NASH疾病进展(图1)。同时, 我们观察到, CFLAR(S1)对猴子的体重、心率、体温和血压没有 明显影响, 显示了CFLAR治疗的特异性和安全性。<\/span>

4 转化意义<\/strong>

本研究首次提出N-端二聚化介导的ASK1酶 过度激活, 是控制NASH进展的关键环节, 对理解 NASH的发病机制提出了全新的认识。通过阐明 CFLAR抑制ASK1过度激活的调控机制, 我们提供 了一种可开发靶向治疗药物的新策略。目前已经研 发的ASK1抑制剂主要是直接抑制ASK1的激酶活 性, 而ASK1的酶活性对于机体正常生理功能至关重 要。正因为如此, ASK1抑制剂有可能影响正常的生 理功能, 因而会限制临床的应用; 而我们的研究证 实, N-端二聚化引起的ASK1的激活主要发生于疾病 过程中, 因此, CFLAR更靶向于治疗疾病本身, 而对 机体正常生理功能影响较小, 更具有临床转化的潜 能。最新一项刊登在国际知名杂志PNAS上的研究 报告证实, ASK1是参与多种疾病发生过程的关键因 子, 比如帕金森综合征、胃癌以及黑色素瘤等[20], 显 示了ASK1对机体病理生理过程的重要作用。此前, 美国吉利德公司公布的数据显示, ASK1的抑制剂在治疗NASH的二期临床实验中显示出了一定的疗 效。而我们的研究更是为围绕ASK1开发靶向药物 指明了方向, 有望彻底打破NASH治疗无药可用的 局面。<\/span>
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A: CFLAR全长和CFLAR(S1)抑制ASK1的N-端二聚化; B: CFLAR全长和CFLAR(S1)抑制ASK1-JNK1信号通路的激活; C: CFLAR(S1)显著减轻 猴子的非酒精性脂肪肝炎。标尺=100 μm。
A: full-length CFLAR (CFLAR-FL) and CFLAR(S1) impaired the N-terminus-mediated dimerization of ASK1; B: CFLAR-FL and CFLAR(S1) inhibit the activation of ASK1-JNK1 signaling; C: therapeutic effects of CFLAR(S1) on nonalcoholic steatohepatitis in monkeys. Scale bar=100 μm.
图1 CFLAR通过抑制ASK1激活减轻非酒精性脂肪肝炎(根据参考文献[15]修改)
Fig.1 CFLAR inhibits ASK1 activation to ameliorate nonalcoholic steatohepatitis (modified from reference [15])<\/p>



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参考文献 (References)<\/strong>
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20 Weijman JF, Kumar A, Jamieson SA, King CM, Caradoc-Davies TT, Ledgerwood EC, et al. Structural basis of autoregulatory scaffolding by apoptosis signal-regulating kinase 1. Proc Natl Acad Sci USA 2017; doi: 10.1073/pnas.1620813114.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-30-39-349.jpg","cshort":"

李红良教授, 武汉大学博士生导师。2006年在中国协和医科大学获得博士学位。2006年至2008年底先后受邀到美国哈佛大学医学院、加拿大多伦多大学从事博士后研究工作。现任武汉大学基础医学院院长、武汉大学动物实验中心/ABSL-III实验室主任、武汉大学模式动物研究所所长、武汉大学心血管病研究所副所长、中南医院医学科学研究中心主任。<\/span><\/p>","cshort2":"

李红良教授, 武汉大学博士生导师。2006年在中国协和医科大学获得博士学位。2006年至2008年底先后 受邀到美国哈佛大学医学院、加拿大多伦多大学从事博士后研究工作。现任武汉大学基础医学院院长、武汉大学动物实验中心/ABSL-III实验室主任、武汉大学模式动物研究所所长、武汉大学心血管病研究所副所长、中南医院医学科学研究中心主任。 李红良教授长期致力于心血管代谢性疾病的发生机制与防治研究以及基因工程动物模型的研发。回国后创建了湖北省模式动物研究中心及武汉大学模式动物协同创新中心, 建立了系统而完善的转基因技术和基因敲除技术平台以及大小鼠心血管疾病动物模型的标准化系统, 自主研发或合作研发基因工程大鼠、小鼠1 300多个品系。过去 十余年来, 应用大量的临床标本, 结合基因工程动物模型, 深入系统地探讨了天然免疫 的网络通路对心血管代谢性疾病的作用及其分子机理。在国际上首次提出了天然免疫 信号重构概念, 并发现这些天然免疫信号完全可以通过非免疫依赖机制实现, 提出的新 理论改变了国际同行学者对天然免疫网络调控作用的认识。 已发表国际重要杂志论文128篇, 其中发表于影响因子10分以上的国际著名杂志25 篇; 包括发表在Nat Med、PNAS、Circulation、Hepatology、J Hepatol、Nat Commun等国际知名杂志, 并连续3年入选2014、2015、2016年度中国高被引学者榜单(医学)。以第一申请人申请国内发明专利124项, 获得授权专利43项。荣获湖北省科技进步一等奖以及药明康德生命化学研究奖等多项奖励。 实验室近期在Nat Med上发表的研究成果首次揭示了天然免疫重要分子CFLAR对 非酒精性脂肪肝炎(NASH)疾病进程中的关键负调控作用, 深入阐明了其分子机制, 对 NASH防治具有重要的临床指导意义(Wang et al. Nat Med 2017)。<\/span><\/p>","ctitle":"靶向CFLAR改善小鼠和非人灵长类动物的 非酒精性脂肪肝炎","listseq":45,"seqno":"15","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-13-57-08-951"},{"caddress1":"(天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所, 北京 100050)","cauthor":"侯少聪 李平平*","cintpic":"","clicktime":27,"clong1":"

1 肥胖、慢性炎症和胰岛素抵抗<\/strong>
2型糖尿病在全球有着庞大的患病人群, 在所 含热量较高的西方饮食流行的环境下, 其患病率增 长十分迅速。相对于胰岛素绝对缺乏的1型糖尿病, 2型糖尿病病人往往表现为胰岛素的相对缺乏, 即 由于在脂肪、肝脏和肌肉组织这些胰岛素靶器官 存在胰岛素抵抗, 使得胰岛素无法发挥其正常作用 而导致血糖异常升高。大量研究证实, 在2型糖尿 病的发病过程中, 肥胖及其相关的慢性炎症可导致 胰岛素抵抗[1-2] 。肥胖状态下, 上述胰岛素靶组织中 聚集了大量的巨噬细胞, 特别是M1样具有促炎症作 用的CD11c阳性巨噬细胞等免疫细胞, 导致了慢性 低度炎症。这些巨噬细胞分泌一系列的细胞因子, 如TNFα(tumor necrosis factor α)、IL1β(interleukine 1β)等, 阻碍了胰岛素的信号传导, 进而导致了胰岛 素抵抗[3-4] 。例如, Weisberg等[5-6] 研究发现, 在肥胖 人群和小鼠中脂肪细胞可以分泌单核细胞趋化蛋 白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)和其 他趋化因子, 诱导巨噬细胞浸润, 这些巨噬细胞进 入脂肪组织后继续分泌趋化因子诱导迁移, 最终 导致大量巨噬细胞聚集在脂肪细胞周围, 加剧炎 症状态。同时, 这些巨噬细胞[脂肪组织巨噬细胞 (adipocyte tissue macrophages, ATMs)]在肥胖状态下高度活化, 其分泌的肿瘤坏死因子TNFα等细胞 因子的表达水平显著上升, 作用于胰岛素靶组织, 导致胰岛素抵抗[6-7] 。而在肝脏[8-9] 和肌肉[10] 中, 相关 研究都证实了巨噬细胞数目在肥胖时显著增加并 导致慢性炎症。由此可知, 巨噬细胞在肥胖导致胰 岛素抵抗过程中起着重要作用。

巨噬细胞属于白细胞的一种, 由单核细胞进入 组织后分化而来, 在体内有着广泛的功能。它可以 通过清除衰老细胞、重塑和修复炎症反应后组织来 维持组织稳态[11] 。浸润脂肪组织的巨噬细胞在肥胖 相关的脂肪组织重构中起着重要作用[12] 。在死亡的 脂肪细胞周围, ATMs会聚集形成“冠状结构”, 包裹 并消化死亡的脂肪细胞。巨噬细胞有着明显的功 能异质性, 有着两种极化状态, M1样和M2样[13-14] 。 M1样(经典激活)巨噬细胞由促炎症分子[如脂多糖 (lipopolysaccharides, LPS)和IFNγ(interferon γ)]诱导 产生, 可分泌高水平的促炎症细胞因子TNFα、IL-6 和IL-12, 促进炎症反应的发生。M2样(另类激活)巨 噬细胞则可分泌低浓度的促炎症细胞因子和高水平 的抗炎症细胞因子, 如IL-10和IL-4[15] , 抑制炎症反 应。在体内, M1样巨噬细胞表达CD11c, 产生促炎症 细胞因子及F4/80、CD11b等细胞表面抗原, 促进胰 岛素抵抗的发生。研究表明, 在高脂饮食喂养的肥胖小鼠中, M1样巨噬细胞大量增加, 分泌更多的促 炎症细胞因子, 如TNFα和IL-6[6,16-17] , 而当M1样巨噬 细胞被敲除后, 可以逆转肥胖小鼠的胰岛素抵抗[18] 。 以上结果提示, 由巨噬细胞介导的慢性炎症导致胰 岛素抵抗。

2 巨噬细胞与Galectin3(Gal3)<\/strong>
巨噬细胞分泌的TNFα和IL1β曾被认为是导致 胰岛素抵抗的关键因子, 然而, 采用抑制此二者方法 的临床试验所取得的疗效有限[19-21] 。因此, 我们怀 疑有其他的细胞因子参与了这一过程。

在之前的研究中, 我们观察到, 小鼠在高脂饮 食喂养下, 体内CD11c+ M1样巨噬细胞数目大幅 增加, 其分泌的促炎症细胞因子, 如IL-6、TNFα、 IFNγ、IL-1β等基因表达水平显著增加[22] 。将小鼠 由高脂饮食更换为普通饮食后, 虽然CD11c阳性巨 噬细胞的数目保持恒定, 胰岛素敏感性却迅速改善。 在ATMs所分泌的细胞因子中半乳糖苷凝集素Gal3 基因表达水平和浓度都显著降低。因此, 我们推测, Gal3可能在慢性炎症导致的胰岛素抵抗中扮演着关 键角色。

Gal3属于半乳糖苷凝集素Galectins家族的一员, 该家族是一类可结合β-半乳糖苷的动物凝集素, 由 巨噬细胞等免疫细胞分泌, 在诸如免疫和炎症应答、 肿瘤发生和生长等多种生理和病理过程中都起着重 要作用[23] 。Galectins均包括约130氨基酸的糖基识 别结构域(carbohydrate recognition domain, CRD)负 责结合糖基[24] 。通常情况下, 通过CRD与细胞表面 的多聚糖相互作用, Galectins可与多种细胞表面或 胞外基质抗原和受体结合[24-25] , 影响细胞内信号传 导通路等多种细胞功能。

Gal3与半乳糖苷凝集素家族其他成员不同之处 在于, 除C段CRD外, 还有着延长的非凝集素N-端结构 域[26] 。由于N-端结构域的存在, Gal3在结合到多价糖 基上时会寡聚化, 并且可以与细胞表面的糖基形成交 联, 从而启动跨膜信号传导, 影响多种细胞功能[27-28] 。 Gal3在自免疫、炎症和恶性肿瘤等方面的作用多有 报道[29-31] , 但其在胰岛素抵抗方面的作用则研究很少。

3 Gal3可诱发炎症, 导致胰岛素抵抗<\/strong>
为了确认Gal3的作用, 我们首先构建了Gal3基因敲除(knock out, KO)小鼠来评价Gal3对小鼠血糖 和胰岛素敏感性等表型的影响。在高脂饮食喂养 后, 野生型(wild type, WT)和Gal3 KO小鼠体重增长 情况相似, 然而KO小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感 性好于WT小鼠。进一步采用高胰岛素正常血糖钳 夹技术评价后, 确定了Gal3敲除对胰岛素抵抗的改 善主要发生在肌肉和肝脏组织。在小鼠和人体中, 内源性Gal3的正常水平较高, 那么Gal3部分敲除也 可能取得上述效果, 对Gal3部分敲除所得Gal3+/– (Gal HET)小鼠的研究证实了我们的推测。在Gal3水平 下降了50%的情况下, Gal HET小鼠表型和全敲除 小鼠基本一致, 其胰岛素靶组织(肝、肌肉和脂肪组 织)胰岛素刺激的AKT磷酸化水平也显著增加, 说明 Gal3全敲除或部分敲除引起的Gal3水平降低可激活 胰岛素信号通路, 提高胰岛素敏感性, 反之, Gal3是 诱导胰岛素抵抗发生的重要因子[32] 。

Gal3对免疫细胞有趋化作用[33] , 可剂量依赖性 地诱导人单核细胞和巨噬细胞迁移。与上述观察类 似, 我们发现, 在体外, Gal3可刺激小鼠腹腔巨噬细 胞的趋化作用, 其敲除后又可减弱巨噬细胞的吞噬 作用。在体内, 通过直接测定巨噬细胞向脂肪组织 的迁移, 我们证实了Gal3同样可促进巨噬细胞趋化 作用。鉴于巨噬细胞可分泌Gal3, Gal3又通过趋化 作用诱导更多的巨噬细胞入侵到胰岛素靶组织, 进 而分泌更多的Gal3, 从而形成一个恶性循环。

4 Gal3可与胰岛素受体结合并抑制胰岛素作用
<\/strong>
在证明了Gal3可导致胰岛素抵抗后, 我们进一 步研究了其是否会干扰胰岛素的生理作用及信号传 导。结果发现, Gal3在L6肌肉细胞、3T3-L1脂肪细 胞及人诱导多功能干细胞衍生的骨骼肌细胞中均可 剂量依赖性地抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取, 在原 代肝细胞中则可与胰高血糖素类似, 增加肝糖输出, 不同的是, Gal3的这一作用并不会被胰岛素抑制, 因 此其作用方式与胰高血糖素并不相同。

在体内实验中, 正常饮食小鼠注射给予重组 Gal3后, 其血中Gal3浓度显著升高, 与高脂饲料喂养 小鼠血中水平相似, 并且表现出葡萄糖不耐受、胰 岛素敏感性降低等表型。随后, 我们将Gal3基因用 腺病毒包裹后注射进正常小鼠体内, 以实现其过表 达后, 在小鼠上同样观察到了葡萄糖不耐受等相似表型。用分离自WT或KO小鼠腹膜内巨噬细胞的 调整培养基(CM)培养L6肌肉细胞, 进行葡萄糖摄取 实验, 结果发现, 来自WT小鼠的调整培养基显著抑 制了胰岛素刺激的糖摄取, KO小鼠的培养基则无此 作用。上述实验结果进一步证实, 巨噬细胞分泌的 Gal3可抑制胰岛素的多种生理作用, 进而导致胰岛 素抵抗表型。

我们知道胰岛素通过结合胰岛素受体(insulin receptor, IR)发挥作用, 二者结合后, 胰岛素可刺激IR 酪氨酸自磷酸化, 激活其激酶活性, 进而招募如胰岛 素受体底物IRS1(insulin receptor substrate 1)等底物 接头蛋白并将其磷酸化。IRS1可激活磷脂酸肌醇3- 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)和丙酮酸脱 氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1), 将信号传递至AKT和葡萄糖转运蛋白(glucose transporters, GLUT), GLUT进而发生转位, 被招募到细胞 膜上, 开启葡萄糖转运。为探明Gal3究竟会影响上 述哪一环节, 我们采用L6肌肉细胞和3T3-L1脂肪细 胞进行了研究。结果显示, Gal3可抑制胰岛素刺激 的IR赖氨酸磷酸化, IRS1的磷酸化水平也相应降低, 还可抑制胰岛素对PDK1和AKT的激活作用。胰岛 素刺激的GLUT4转位也可被Gal3抑制。

由上述结果可知, Gal3可阻碍胰岛素信号通路 的多个主要环节。而这一作用很有可能是Gal3对IR 直接的抑制作用。我们的实验结果也证明了这一 点, 免疫共沉淀实验发现, 在肌肉和脂肪细胞中, IR/ Gal3可形成复合物, 而Gal3和IRS1则没有相互作用, 说明Gal3可直接与胰岛素受体IR结合。有趣的是, 我们在脂肪细胞和原代肝细胞中进行的胰岛素结合 实验结果表明, Gal3同样并不阻碍胰岛素与IR的结 合, 说明虽然胰岛素与Gal3均可以结合胰岛素受体, 二者之间并没有竞争作用, 可能二者与胰岛素受体结合位点并不相同。

5 Gal3的转化医学研究<\/strong>

在实验中我们发现, 高脂饮食喂养小鼠血液 中Gal3含量显著高于正常饮食组, 人体研究也表明, Gal3在肥胖个体中水平高于瘦的个体, 并且其水平 与身高体重指数(body mass index, BMI)和稳态模型 胰岛素抵抗指数(homeostatic model assessment-insulin resistance, HOMA-IR)指数正相关, 说明肥胖和胰岛 素抵抗均与异常升高的Gal3水平关系密切。而当通过给予氯膦酸(clodronate)敲除巨噬细胞后[34-35] , 高 脂饮食喂养小鼠血中Gal3水平显著降低, 几乎降到 了和正常饮食小鼠血中相同的水平, 提示肥胖时大 量聚集在代谢组织的巨噬细胞是异常升高Gal3的主 要来源。巨噬细胞属于免疫细胞, 而免疫细胞则来 自骨髓造血细胞, 因此, 我们通过骨髓移植手段研究 了免疫细胞对血中Gal3水平的影响。在得到的嵌合 鼠中, 移植自“Gal3 KO小鼠”骨髓的小鼠(BMT Gal3 KO)血 中Gal3的 水 平 相 比 移 植 自“WT小 鼠”(BMT Gal3)骨髓的小鼠下降了约90%, 说明绝大部分血循 环中的Gal3来自免疫细胞。进行高脂饮食喂养后, 两种嵌合鼠体重增长类似, 但是BMT Gal3 KO小鼠 葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性均优于BMT Gal3小 鼠, 胰岛素水平也更低, 而进一步的高胰岛素正常血 糖钳夹实验也证明 前者的肝脏和肌肉胰岛素敏感性 更好。这一结果进一步说明了免疫细胞分泌了绝大 部分的Gal3, 而Gal3水平的高低影响着机体的胰岛素敏感性。<\/p>

最后, 为研究Gal3是否是一个具有临床应用潜力的新靶点, 我们采用Gal3的小分子抑制剂 Cpd47(compound 47) [36] 直接处理L6细胞, 发现它可以废除Gal3对胰岛素刺激的葡萄糖转运的抑制作用。在原代肝细胞上给予Cpd47处理后, Gal3也不再 阻碍胰岛素对肝糖输出的抑制。高脂喂养的肥胖小鼠给予单剂量Cpd47一小时后即可改善葡萄糖耐受性, 而Cpd47通过渗透性微量蠕动泵长期给药后, 同样可改善HFD/肥胖小鼠的葡萄糖耐受性。结果说明, 通过药物手段抑制Gal3来改善胰岛素敏感性是一个 可行的方法。<\/span>

本研究通过上述一系列实验, 证明了来自免疫 细胞的Gal3可直接与胰岛素受体结合并抑制其下游 信号传导, 从而导致胰岛素抵抗, 进而系统地研究了 其在肥胖和胰岛素抵抗中的作用及其作为药物靶点 的潜力。我们的研究表明, 作为联系肥胖、慢性炎 症和胰岛素敏感性的关键分子, Gal3有望成为糖尿 病治疗的新靶点。<\/span>

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参考文献 (References)<\/strong>
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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-29-23-747.jpg","cshort":"

李平平, 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所研究员, 博士生导师, 协和学者特聘教授。2001年毕业于中国药科大学, 获药理学学士; 2006年毕业于中国医学科学院北京协和医学院药物研究所, 获药理学博士学位。2006~2011年间在美国加州大学圣 地亚哥分校(University of California San Diego)进行博士后研究, 2011~2013年担任项 目科学家, 并于2013年被聘为该校助理教授。<\/span><\/p>","cshort2":"

李平平, 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所研究员, 博士生导师, 协和学者特聘教授。2001年毕业于中国药科大学, 获药理学学士; 2006年毕业于中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所, 获药理学博士学位。2006~2011年间在美国加州大学圣 地亚哥分校(University of California San Diego)进行博士后研究, 2011~2013年担任项 目科学家, 并于2013年被聘为该校助理教授。2015年1月起任中国医学科学院药物研 究所研究员, 主要研究领域为肥胖、胰岛素抵抗及糖尿病发生的分子免疫学机制及 糖尿病药理学, 在Cell、Nat Med、Cell Metabolism、PNAS和Diabetes等著名学术期 刊发表论文多篇。<\/span><\/p>","ctitle":"半乳糖苷凝集素Galectin3直接诱发胰岛素抵抗","listseq":46,"seqno":"14","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-11-11-54-841"},{"caddress1":"(清华大学免疫学研究所, 动态免疫生物学实验室, 清华大学医学院, 基础医学系, 北京 100084)","cauthor":"吕佩纹 史长明 祁 海*","cintpic":"","clicktime":408,"clong1":"

高亲和力、同种型转换过的抗体是机体长效 抵抗微生物的重要机制之一。选择高亲和力抗体的 成熟过程发生在次级淋巴器官滤泡区内称为生发中 心(germinal center, GC)的组织结构中。GC主要含有 呈递抗原的滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells, FDC)、高速增殖和进行高频突变的B细胞以及调 控B细胞反应的滤泡性辅助T细胞(follicular helper T cells, TFH)。相比于其他T细胞亚群, TFH细胞有其特 异高表达的基因谱[比如CXCR5(C-X-C chemokine receptor type 5)、ICOS(inducible costimulator)、PD- 1(programmed death-1)以及Bcl-6(B cell leukemia/ lymphoma 6)], 可以通过提供CD40L等辅助信号, 促 进生发中心反应[1-3] 。在生发中心形成之前, TFH细 胞要通过上调G蛋白偶连趋化因子受体CXCR5响 应滤泡区FDC细胞分泌的趋化因子CXCL13[4-6] , 通 过ICOS与非抗原特异B细胞上的ICOSL(inducible costimulatory ligand)作用增强运动能力, 才能脱离 T细胞区并迁移进入B细胞为主的滤泡区[7] 。生发 中心在滤泡中心区形成之后, TFH细胞表面G蛋白 偶联受体进一步发生变化, 下调GPR183(G-protein coupled receptor 183)与上调S1PR2(sphingosine-1- phosphate receptor 2)导致TFH细胞向滤泡中心区定 位, 促使它们进入生发中心[8-9] 。另一方面, TFH细胞 表达SLAM相关蛋白[signaling lymphocytic activation molecule (SLAM)-associated protein, SAP]; SAP促进 TFH细胞与抗原特异B细胞的黏附互作, 而没有SAP 的TFH细胞无法从滤泡区进入生发中心[10] , 以至于 SAP缺陷时生发中心应答会出现严重缺失[11] 。这些 研究结果显示, TFH细胞的组织定位对生发中心反应 至关重要, 暗示着除趋化因子介导的淋巴细胞迁移 调控外, 细胞间接触黏附也可能控制TFH细胞招募到 生发中心的效率。

Ephrin及其受体Eph(erythropoietin-producing human hepatocellular receptor)是目前已知参与神经轴突导向调控的重要分子机制。与这些配体和受体 都是细胞膜表面表达蛋白的事实相一致, 细胞间接 触黏附是Ephrin-Eph产生信号并指引细胞迁移方向 的必要条件[12-14] 。我们的研究发现, 与神经轴突导 向调控相仿, 生发中心表达的Ephrin家族Ephrin-B1 分子调控了TFH细胞在生发中心反应中的定位与功 能。

1 生发中心B细胞上调Ephrin-B1<\/strong>
通过RT-PCR的实验手段, 我们发现, Ephrin-B1 基因在免疫后的淋巴组织中出现上调。进一步分 析各种淋巴细胞亚群以及不同免疫进程的B细胞亚 群, 我们发现, 在生发中心B细胞表面会特异性上调 Ephrin-B1表达量。在淋巴组织切片上, Ephrin-B1 染色可以精确标记生发中心的区域与边界。接下 来, 我们使用条件敲除小鼠, 在小鼠B细胞上特异性 敲除Ephrin-B1后研究了抗原诱导的免疫反应进程。 流式细胞术的结果发现, 在缺失Ephrin-B1的情况下, 生发中心B细胞与TFH细胞的生成比例并无明显变 化。然而, 组化切片分析却显示, 在Ephrin-B1缺失 的生发中心里会出现较多的TFH细胞。

2 Ephrin-B1-EphB6信号调节TFH细胞定位<\/strong>
为了更清楚地研究Ephrin-B1对TFH细胞招募 至生发中心的影响, 我们采用表达荧光蛋白标记的 抗原特异MD4 B细胞[Egg-white lysozyme (HEL)- specific BCR transgenic小 鼠B细 胞]和OT-II T细 胞 [Ovalbumin (OVA)-specific TCR transgenic小鼠T细 胞]共转系统进行实验。在过继转移T、B细胞后, 以 HEL-OVA化学偶联抗原免疫, 取免疫后第7天的淋 巴结固定切片及染色, 根据T细胞所带荧光蛋白精 确定量计算TFH细胞在淋巴组织中的分布密度, 我 们发现, 在缺失Ephrin-B1的生发中心有更多的TFH 细胞堆积, 暗示Ephrin-B1对TFH细胞起了排斥作用。

我们进一步以双光子显微成像技术实时观察TFH细 胞在生发中心附近及内部的运动轨迹以及TFH细胞 与生发中心, B细胞间动态相互作用。分析结果显 示, Ephrin-B1缺失的生发中心B细胞会与TFH细胞 产生更大面积的缠绕(entanglement)现象, 并使TFH 细胞从滤泡区进入生发中心后滞留于此处, 从而为 持Ephrin-B1主要起了排斥作用。接下来, 我们尝试 使用shRNA技术敲低TFH细胞上表达的Ephrin-B1受 体EphB4或EphB6, 试图鉴定向TFH细胞传递排斥信 号的受体[15] 。结果显示, 在T细胞敲低EphB6的情 况下, TFH细胞会更容易堆积在正常的生发中心里。 这些结果表明, 生发中心B细胞上的Ephrin-B1通过 EphB6负向调节TFH细胞在生发中心的定位。

3 Ephrin-B1缺失影响浆细胞生成<\/strong>
TFH细胞作为辅助体液免疫应答发生的重要 细胞亚群, 除了帮助生发中心B细胞产生与维持外, 还调控B细胞亲和力成熟及分化形成浆细胞的过 程[3,16] 。过于密集的TFH细胞, 往往导致强烈的免疫 应答甚至自身免疫疾病的发生。我们以经典的蛋白 抗原NP-KLH(4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl-keyhole limpet hemocyanin)免疫方式诱导小鼠产生免疫应 答, 在不同时间点进行检测, 结果表明, 在B细胞缺 失Ephrin-B1的小鼠中, 虽然生发中心B细胞的生成 不受影响, 但浆细胞生成比例却出现下滑。这与TFH 细胞堆积可能导致反应过度的预期似乎相反。由于 Ephrin-B1可以通过其胞内结构域中的PDZ(PSD95- Dlg1-Zo1)区域招募相关蛋白产生逆向信号(reverse signaling), 一种解释是Ephrin-B1的逆向信号对生成 浆细胞很重要。为检验这一可能, 我们使用50%野 生对50%缺陷型骨髓嵌合体小鼠进行研究。在这种 小鼠出现的生发中心中, 两种B细胞会共用一种野 生型TFH细胞以及其他反应微环境。有趣的是, 这时 Ephrin-B1缺失的B细胞反而更容易形成浆细胞。这 个结果不支持逆信号决定浆细胞生成的假说; 同时, 单个TFH-GC细胞间在缺乏Ephrin-B1时缠绕现象加 剧, 使B细胞能够获得更多接触依赖传递的辅助信 号(比如CD40L), 因而可以解释这些细胞在形成浆 细胞上更具优势[17] 。由此也可产生一个推论, 生发 中心B细胞完全缺失Ephrin-B1时, 可能某种外源促 浆细胞生成的因素被抑制了。换言之, Ephrin-B1可 能促进某种促浆细胞的因子产生。

4 Ephrin-B1-EphB4信号调节TFH细胞功能<\/strong>
IL-21(interleukin-21)在体液免疫反应中能够促 进B细胞上调转录因子Prdm1(PR domain zinc finger protein 1, 又称为Blimp-1)、是促进B细胞向浆细胞 分化的重要细胞因子, 它主要由TFH细胞分泌[18-20] 。 因此, 我们检验了Ephrin-B1是否通过Eph受体前向 信号(forward signaling)促进TFH细胞分泌IL-21。首先, 我们用Ephrin-B1 Fc对体外活化的CD4 T细胞进行 刺激, 发现这种刺激的确特异性上调T细胞的IL-21 表达。进一步比较B细胞特异Ephrin-B1缺陷型与 野生型小鼠中TFH细胞上IL-21的表达, 我们发现, 在 Ephrin-B1缺陷的生发中心中, TFH细胞无法正常产 生IL-21, 说明来自B细胞的Ephrin-B1信号的确是促 进TFH细胞局部产生IL-21的关键之一。接下来, 我 们采取shRNA技术敲低或逆转录病毒过表达EphB4 或EphB6, 并检测这些受体对TFH细胞IL-21生成的影 响。从流式细胞术与荧光定量PCR的分析结果发现, EphB4是TFH细胞响应Ephrin-B1并产生IL-21的主要 受体蛋白。

总结前述研究内容, 我们发现, Ephrin-B1在免 疫系统中可以作为生发中心B细胞表面特异的标志 性分子; 经由TFH细胞上的EphB6受体传递信号, 它 抑制T-B细胞间的黏附接触, 促使TFH细胞离开生发 中心, 从而控制TFH不在生发中心过度聚集。与此同 时, 由于所有生发中心B细胞都表达Ephrin-B1, TFH 细胞只要在生发中心的区域里就会通过EphB4收到 促进它们产生IL-21的信号。这样, 同一个Ephrin-B1 分子完成了两个功能, 排斥控制TFH细胞的定位与聚 集, 但促进TFH细胞在组织局部的辅助功能。这些结 果第一次证明了调控淋巴细胞间互作的排斥性机 制, 揭示了一个局域微环境通过膜表面配受体信号 调控T细胞运动与功能的全新规律。理解这一规律 可能会对未来抗体疫苗设计策略有所启发。<\/p>

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祁海, 清华大学教授, 清华–北大生命联合中心研究员, 曾获谈家桢生命科学奖创新奖(2015 年)、华人生物学家协会青年奖(2016年)、吴阶平–保罗杨森医学药学奖(2016年), 2017年入选为美国霍华德休斯医学研究所国际学者(HHMI International Research Scholar)。<\/span><\/p>","cshort2":"

祁海, 清华大学教授, 清华–北大生命联合中心研究员, 曾获谈家桢生命科学奖创新奖(2015 年)、华人生物学家协会青年奖(2016年)、吴阶平–保罗杨森医学药学奖(2016年), 2017年入选为美国霍华德休斯医学研究所国际学者(HHMI International Research Scholar)。祁海教授主要研究抗体免疫应答的调节机制, 应用包括双光子活体实时 显微成像技术在内的动态免疫学方法, 探究淋巴细胞互作、迁徙以及微环境对其功 能发育的影响, 在B细胞生物学、滤泡辅助T细胞(follicular T-helper cells, TFH)生物学 和生发中心生物学领域取得了一系列原创成果, 以第一或通讯作者发表SCI论文20 篇, 包括2篇《Science》、4篇《Nature》。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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1 相关研究背景及进展介绍<\/strong><\/p>

在真核细胞中, 基因组DNA通常与组蛋白八聚 体缠绕构成染色质的基本结构; 而在哺乳动物的精 子细胞核内, 组蛋白将被另一类富含精氨酸、高碱 性的小分子核蛋白—鱼精蛋白取代[1-2]。鱼精蛋 白携带正电荷, 可协助基因组DNA进行高度折叠, 将父源遗传物质紧密压缩储存于精子头部[1]。在减 数分裂后的精子形成期, 将发生组蛋白–鱼精蛋白 转换, 伴随一系列其他形变, 单倍体精子细胞最终 发育为成熟精子[1,3]。自鱼精蛋白发现至今的100多 年间, 尽管科研人员通过大量实验证据证实了组蛋 白–鱼精蛋白转换故障与雄性不育之间的密切因果 联系[1,3-4], 但对于该转换过程如何起始及具体作用 机制仍然知之甚少。近期有研究表明, 泛素连接酶 RNF8(ring finger protein 8)介导的组蛋白H2A、H2B 泛素化修饰是上述替换过程起始的关键步骤[5], 但 对于该过程如何在精子细胞发育的特定时期被启动 仍然一无所知。<\/span>

进化保守的Piwi(P-element induced wimpy testis)蛋白是Argonaute蛋白家族的亚家族成员, 特 异性地在动物生殖系细胞表达[6-7]。Piwi蛋白通 过结合一类新近发现的小分子非编码RNA— piRNA(Piwi-interacting RNAs)形成Piwi/piRNA“ 机 器”, 抑制基因组中的转座元件, 从而保护维持生殖 细胞基因组的稳定性及完整性[6-7]。此外, 我们及国 际同行的研究均表明, Piwi/piRNA“机器”还参与调 控生殖细胞中的蛋白编码基因[8-11]。在线虫、果蝇、 斑马鱼及小鼠等模式生物中的大量遗传学实验显 示, Piwi蛋白在动物生殖细胞发育分化中发挥重要 功能, 为动物配子发生所必需[6-7]。小鼠基因组编码 三种Piwi成员, 包括Miwi、Mili及Miwi2, 均特异性 地在睾丸中表达, 并为小鼠雄性生殖细胞发育所必 需[12-14]。在人类基因组中, Piwi基因共包含四种成员: Hiwi、Hili、Hiwi2及Piwi13[15]。人源Piwi蛋白主要 在睾丸中高度表达, 但目前有关其在人生殖细胞发 育分化过程中的功能还未见报道。<\/span>

从结构角度而言, Piwi蛋白包含四个功能结构域: N- 端、PAZ(PIWI-ARGONAUTE-ZWILLE)、 MID(middle)及PIWI结构域[16]。PAZ与MID结构域 主要为piRNA的结合区域, PIWI结构域具有RNase H活性[17-19], 而Piwi蛋白N-端结构域的功能尚不清 楚。我们在前期的研究中发现, 脊椎动物PIWI蛋白 (包括MIWI和HIWI)N-端保守地存在一个泛素连接 酶APC/C(anaphase-promoting complex/cyclosome)底 物特征性元件—D-box元件, 并证明MIWI是APC/ C的底物[20]。通过一系列体外及体内实验, 我们证 实在小鼠后期精子细胞中, APC/C通过D-box元件识 别MIWI蛋白并对其进行泛素化修饰, 最终导致其降 解, 且MIWI蛋白在后期精子细胞中适时降解、清除, 为精子形成所必需[20]。基于以上研究背景, 我们进 而探索Piwi基因在人精子形成中的功能机制。<\/span>

2 少弱精症患者携带Hiwi D-box突变<\/strong>

为了探究人精子形成中HIWI蛋白代谢调控的 生物学意义, 我们通过与医院合作, 收集了413例少 弱精症患者及300例可育男性人群的血液样本。通 过基因组DNA测序筛查Hiwi基因的D-box元件, 我 们发现有3例病人携带Hiwi基因D-box杂合突变, 分 别为R218A/L221A(病人#1)、L221G/N225H(病人 #2)及L221R(病人#3); 全长基因测序显示, 这3位病 人的Hiwi基因没有其他的突变。随后, 我们跟踪调 查了其中两位病人的直系亲属并发现: 病人#1的父 母均不携带D-box突变, 表明该病人是后天自发获 得突变; 病人#2的母亲携带与患者相同的杂合突变, 其父亲与兄弟的Hiwi基因为野生型, 表明该病人的 D-box突变从母亲遗传获得。上述结果表明, Hiwi基 因突变可通过自发变异或母系遗传的方式获得。<\/span>

3 小鼠Miwi D-box突变导致雄性不育<\/strong>

为了鉴定我们发现的Hiwi基因D-box突变是否 为导致三位男性病人不育的原因, 我们将在病人#1 中鉴定的突变(R218A/L221A)敲入小鼠Miwi构建 了条件型基因敲入小鼠模型。通过与原始生殖细 胞(primordial germ cell, PGC)特异表达的TNAP-Cre转基因工具小鼠杂交, 我们获得了携带Miwi基因 R218A/L221A杂合突变的基因敲入小鼠。表型鉴定 发现, 所有出生的雄性小鼠均不能繁育后代, 而雌性 小鼠的生育不受任何影响。以上疾病模型小鼠获得 了与临床男性病人一致的不育表型, 证明Hiwi基因 D-box突变是造成男性不育的原因。<\/span>

随后的研究发现, 与对照小鼠相比, 突变小鼠 睾丸中的支持细胞、精母细胞、球型精子细胞及早 期延长型精子细胞的形态及数量均无明显异常, 而 后期延长型精子细胞(steps 14-16)的数量急剧减少, 表明D-box突变致精子发育后期障碍。进一步对附 睾中精子检测发现, 突变小鼠精子数量显著降低、 精子活力严重不足, 且精子头部形态及染色质凝集 异常, 提示突变小鼠在精子发生中的染色质压缩出现故障。<\/span>

4 Miwi D-box突变小鼠精子细胞中组蛋 白–鱼精蛋白转换障碍<\/strong>

为了从分子水平寻找导致突变小鼠精子染色 质压缩异常的原因, 我们通过质谱分析了突变小鼠 精子的蛋白谱。我们发现, 在突变小鼠精子中, 组蛋 白H2A、H2B、H3、H4及其变体的表达水平都剧 烈升高; 免疫染色及免疫印迹实验确认了组蛋白在 突变小鼠精子中大量积累, 且鱼精蛋白水平有一定 程度的降低。这些实验结果表明, Miwi基因D-box突 变小鼠的精子形成出现了问题, 即组蛋白–鱼精蛋白 转换步骤发生严重障碍, 造成组蛋白未被鱼精蛋白 充分转换, 最终导致其精子生成缺陷。<\/span>

5 Miwi D-box突变体扣留RNF8于细胞核外<\/strong>

近期的一项研究表明, 小鼠延长型精子细胞中 泛素连接酶RNF8介导的组蛋白H2A、H2B泛素化修 饰是起始组蛋白–鱼精蛋白转换的早期关键事件[5], 但该过程如何在精子细胞发育中被精准调控并不清 楚。通过免疫染色和免疫印迹实验, 我们发现, 突变 小鼠后期精子细胞中H2A与H2B的单泛素化水平明 显降低。鉴于MIWI蛋白在突变小鼠后期精子细胞 中异常滞留, 我们推测, MIWI蛋白有可能通过某种 方式影响了RNF8对组蛋白的泛素化修饰。我们首 先检测了MIWI蛋白是否能够调控RNF8的泛素连接 酶催化活性。利用体外反应系统, 我们发现, MIWI蛋白能够抑制RNF8对组蛋白H2B的泛素化修饰。 我们进一步利用免疫染色分析发现, 在小鼠球形精 子细胞内, MIWI大量存在, 并与RNF8共定位于核 外; 而在后期精子细胞中, 野生型对照小鼠的MIWI 蛋白被降解清除、RNF8蛋白入核, 而突变小鼠的 MIWI蛋白异常稳定, RNF8蛋白被继续扣留于核外, 使其不能入核启动组蛋白修饰及随后的组蛋白–鱼 精蛋白转换。<\/span>

6 RNF8-N短肽拯救突变小鼠的精子形成 缺陷、恢复精子活性<\/strong>

我们在解析MIWI与RNF8相互作用时发现, 位于RNF8蛋白N-端的68QNPEG72保守序列是其与 MIWI相互作用的关键结合区域。RNF8蛋白的N- 端截短形式RNF8-N(1~210 AA)能够与全长RNF8 蛋白有效竞争结合MIWI; 而将68QNPEG72突变为 68AAAAA72后, 此N-端截短形式的突变体(RNF8- Nmut)丧失与MIWI的结合能力。利用体外反应系统, 我们发现, RNF8-N短肽可显著削弱MIWI对RNF8催 化活性的抑制作用; 相反, RNF8-Nmut因其丧失竞争 结合MIWI的能力而无明显效果。<\/span>

基于上述发现, 我们通过慢病毒睾丸转导在 D-box突变小鼠精子细胞中外源表达了RNF8-N 短肽, 同时, 利用共表达的可线粒体定位的 EGFP(enhanced green fluorescence protein)追踪被感 染的精子细胞及其衍生的精子。令人兴奋的是, 在 被转导表达了RNF8-N短肽的后期精子细胞中, 内源 RNF8蛋白能够得以逃离MIWI蛋白的扣留、从胞质 中释放并转运入核; 同时, 组蛋白H2B再次获得泛素 化修饰。同样, 由附睾中分离获得的成熟精子也被 成功拯救: 精子头部形态恢复正常、组蛋白异常积 累现象消失、精子重新获得游动能力。<\/span>

7 总结及研究意义<\/strong>

在本研究中, 我们首先通过大规模筛查发现少 弱精症患者中存在Hiwi基因D-box元件突变, 并通过 小鼠模型证实该突变致雄性不育。通过一系列体内、 体外实验, 我们揭示了D-box突变致精子形成障碍的 病理机制, 也首次发现Piwi蛋白可作为分子开关, 调 节控制哺乳动物精子发生中组蛋白–鱼精蛋白转换 过程的起始。总之, 我们的研究从人类遗传学出发, 利用动物模型探究分子机理, 首次证明Piwi基因突变可导致男性不育, 并为相关男性不育症的诊断及 治疗提供了理论依据和方法策略。<\/span><\/p>

参考文献 (References)<\/strong>
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刘默芳, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究组长(PI)、研究员。刘默芳研究员主要从事非编码RNA功能机制研究, 围绕piRNA与精子发生、miRNA与癌症等开展系统性探索,获得了前沿性进展,<\/span><\/p>","cshort2":"

刘默芳, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究组长 (PI)、研究员。刘默芳研究员主要从事非编码 RNA功能机制研究, 围绕piRNA与精子发生、miRNA与癌症等开展系统性探索, 获得了前沿性进展, 已发表论文50多篇, 包括作为通讯作者的研究论文12篇(Cell, 2017; Cancer Res, 2017; Oncogene, 2016; EMBO J, 2015; Cell Res, 2015; Cancer Res, 2014; Cell Res, 2014a; Cell Res, 2014b; Dev Cell, 2013; EMBO J, 2012; Cell Res, 2012; Cancer Res, 2010)。这些原创性研究成果揭示了小分子非编码RNA的生理和病理功能机制, 可为男性不育症及肿瘤等疾病的诊治研究提供理论依据和相关基础。<\/span><\/p>","ctitle":"人Piwi基因突变致男性不育的机制研究","listseq":48,"seqno":"12","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-11-10-21-416"},{"caddress1":"(1中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031; 2上海科技大学生命科学与技术学院, 上海 201210))","cauthor":"邢宇航1<\/sup> 陈玲玲1,2*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":28,"clong1":"

大规模基因组以及转录组测序分析表明, 人类的基因组中大于75%的部分为转录活跃区 域, 而这些活跃区域转录产物绝大部分由非编码 RNA(noncoding RNA, ncRNA)组成[1-2]。非编码RNA 是一类能够被正常转录产生但并不翻译为蛋白质 的RNA。非编码RNA可以分为“持家”非编码RNA、 短链非编码RNA、长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)等。“持家”非编码RNA包括转运 RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)与小核仁RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)等。短链非编码RNA包括 microRNA(miRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)和piwi相互作用的RNA(Piwi-interacting RNA, piRNA)[3]。长链非编码RNA则是指长度大于 200个核苷酸但是不编码功能性蛋白或者多肽的一类 RNA分子[4]。越来越多的研究表明, 长链非编码RNA 在基因转录调控以及转录后加工等多个方面参与细 胞的生命活动[5-7]。大部分长链非编码RNA的结构与 mRNA相似, 均含有5′端的m7G(7-methyl guanosine) 帽子以及3′端的poly(A)尾巴。<\/span>

snoRNA是一类长度为70~200个核苷酸的保 守的非编码RNA, 定位于核仁或者Cajal body中, 参 与rRNA转录后修饰过程。哺乳动物中大部分的 snoRNA来自于编码基因的内含子, 由mRNA成熟 过程中被剪切下的内含子经脱分支和核酸外切酶 作用而形成。snoRNA根据功能和结构可以分为 两类, 即box C/D和box H/ACA snoRNA。snoRNA 通过与特定蛋白相结合, 形成小核仁核糖核蛋白复 合物(small-nucleolar ribonucleoprotein complexes, snoRNPs)来行使相应功能[8-9]。我们实验室通过 前期创建的无poly(A)尾转录组分离纯化和高通 量RNA测序技术[10]发现了一系列结构特殊的长链 非编码RNA, 其中包括两端以snoRNA结尾的snolncRNAs( snoRNA-related lncRNAs)[11-12]以及5′端为 snoRNA而3′端则是poly(A)尾巴的SPAs(5′ snoRNA capped and 3′ polyadenylated lncRNAs)[13]。本文主要 围绕这几类新发现并均含有snoRNA的长链非编码RNA介绍相关进展。<\/span>

1 两端以box C/D snoRNA结尾的snolncRNAs 加工机制与功能<\/strong>
小胖威利综合征(Prader-Willi syndrome, PWS) 是一种15号染色体异常的基因遗传疾病, 临床表现 为发育迟缓、智能障碍、食量增加以及性腺发育不 良等[14]。我们通过在人源胚胎干细胞H9中进行无 poly(A)尾转录组分离的RNA测序发现了在15q11- q13印记区域的无poly(A)组分中有较高表达水平的 5条长链非编码RNA。这些长链非编码RNA两端均 以box C/D snoRNA结尾, 因此, 我们将其命名为snolncRNAs 。sno-lncRNAs本身并没有独立的基因启动子, 而是来源于SNRPN(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N)基因转录本的内含子区域。随后, 我 们利用Northern blot技术验证了sno-lncRNAs在多种 人细胞中表达, 并发现sno-lncRNAs两端的snoRNA 可以结合相应的蛋白形成snoRNP复合物, 而正是这 些snoRNP复合物使sno-lncRNAs稳定存在。我们利 用DNA/RNA荧光原位杂交(DNA/RNA fluorescence in situ hybridization, DNA/RNA FISH)技术对snolncRNAs 在人源胚胎干细胞中的定位进行了检测。 结果发现, sno-lncRNAs定位于细胞核内的自身转 录位点附近, 与经典的box C/D snoRNA的细胞内 定位有所差异。进一步的研究发现, sno-lncRNAs 在细胞核中可以与剪接因子RBFOX2(RNA binding protein fox-1 homolog 2)结合。利用反义寡核苷酸 技术(antisense oligodeoxynucleotides, ASO)对snolncRNAs 进行敲除发现, RBFOX2所调控的相关基因 的剪接形式发生了改变, 说明sno-lncRNAs可以通过 与RBFOX2结合来影响其调控pre-mRNA剪接的功 能。根据上述实验结果可推测, 在正常个体发育早期 的细胞中, sno-lncRNAs在细胞核内可以充当“分子海 绵”来“吸附”RBFOX2, 使其发挥正常功能; 而在PWS 病人的细胞中则缺少sno-lncRNAs的表达, 这种缺失 造成了RBFOX2在细胞核内的散乱分布, 从而改变了相关基因的可变剪接, 最终可能导致了PWS疾病的 发生。我们的研究发现了一类全新的结构独特的长 链非编码RNA家族, 并解释了其独特的生成加工机 制, 拓展了人们对于长链非编码RNA的认识。另外, PWS是一类多系统紊乱的疾病, 疾病成因复杂, 其病 理机制至今仍未被阐明。PWS病人细胞中缺失snolncRNAs, 对这种疾病特异性缺失的长链非编码RNA 的功能研究有助于更加深入地了解PWS的病理机制, 同时也为今后针对PWS的治疗提供了理论基础。<\/span>

2 对sno-lncRNAs的物种特异性分析及其 特性的应用研究<\/strong>

临床研究表明, 大于70%的PWS病人是由chr15q11 -q13染色体缺失所导致的, 但是现有的小鼠PWS 基因区域缺失模型不能完全模拟人PWS的临床症 状。我们在可导致PWS的最小染色体缺失区域中 发现了5个可转录产生sno-lncRNAs的基因。通过比 较人、猴、小鼠的无poly(A)转录组发现, PWS区域 sno-lncRNAs仅在灵长类动物中表达, 而在小鼠转录 组中不表达[15]。尽管组成sno-lncRNAs的snoRNA基 因在这3个物种中均保守存在, 但是这个区域的可 变剪接具有物种特异性: 在人类基因组中, 可变剪 接导致单内含子中存在2个snoRNAs, 因此可以形 成sno-lncRNAs; 而在小鼠基因组中, 单内含子仅有 1个snoRNA, 因此不能形成sno-lncRNAs。该项工作 发现, 多内含子snoRNA通过可变剪接形成熟的snolncRNAs 并具有物种特异性, 揭示了人类特异的PWS 区域sno-lncRNAs在疾病发生中可能的重要性, 也提 示PWS小鼠模型不能很好地模拟人类疾病的原因可 能是由于这些进化不保守的长链非编码RNA。<\/span>

如同研究蛋白一样, 研究lncRNA功能也需要 通过质粒载体将其在细胞内过表达。然而, 目前已 有的真核表达载体多数是用来表达编码基因的, 载 体上含有转录元件、翻译元件和一些促进核质运 输的元件。因此, 这些载体表达的转录本就会按照 mRNA的方式进行加工并且运到细胞质中。使用这 些载体外源表达一些仅定位在细胞核中的lncRNA 时, 这些 RNA也经常会被运到胞质里, 对上述现有 技术中所存在的问题, 利用sno-lncRNAs分子不含5′ 帽子和3′尾巴并可以滞留在细胞核中的特征, 我们 研发了snoVector质粒表达体系用于表达细胞核内的 lncRNA[16]。该载体可以表达基因组中不同来源的RNA, 并将其滞留在细胞核内。例如, 利用snoVector 表达细胞核的一条lncRNA NEAT1(nuclear enriched abundant transcript 1), 不仅使之滞留在细胞核内, 还具有内源NEAT1的活性, 即调控细胞核亚结构 paraspeckles的组装和功能[17]。因此, 该snoVector体系 为研究细胞核内lncRNA的功能提供了有效工具。<\/span>

3 5′端为snoRNA、3′端为poly(A)尾巴的 SPAs加工机制与功能<\/strong>

PWS病人细胞中缺失的基因印记区域可以产 生多种snoRNA, 为了进一步探究PWS疾病形成原 因并寻找更多的与snoRNA相关的lncRNA, 我们进 行了box C/D snoRNA相应的结合蛋白Fibrillarin的 RNA免疫共沉淀(RNA-immunoprecipitation, RIP)实 验。该工作使得我们发现了另外一类新型的长链 非编码RNA, 其5′端是box C/D snoRNA而非经典的 m7G帽子, 3′端则是poly(A)尾巴, 我们将其命名为 SPAs。在人源胚胎干细胞中, SPA1和SPA2是两条表 达丰富的长链非编码RNA, 来源于PWS关键15q11- q13缺失区域。SPAs由多顺反子基因SNURF-SNRPN 转录产生, 生成过程依赖于其上游较弱的转录终止 信号、5′端snoRNA帽子以及相应蛋白因子CPSF和 XRN2。与sno-lncRNAs的细胞定位类似, DNA/RNA 荧光原位杂交显示, SPAs也定位在细胞核中其转录 位点附近, 并且可以与sno-lncRNAs定位在一起形成 聚集簇。为了深入探究SPAs的作用功能, 利用RNA pulldown的技术对其结合蛋白进行了检测。实验结 果表明, SPAs与sno-lncRNAs类似, 可以与剪接因子 TDP43、RBFOX2、hnRNPM结合。利用超高分辨 率三维结构照明显微镜(3D-structured illumination microscopy, 3D-SIM)对SPAs、sno-lncRNAs以及结合 相应蛋白进行了观察, 发现SPAs与sno-lncRNAs在细 胞核内形成一个半径约为1 μm的积聚小体。在此核 积聚小体内, SPAs与sno-lncRNAs结合了大量的可变剪 接调控蛋白TDP43、RBFOX2、hnRNPM。随后, 利 用基因编辑技术对SPAs进行敲除发现, SPAs的缺失影 响了TDP43、RBFOX2、hnRNPM等蛋白与一部分 pre-mRNA的结合, 进而影响了相应基因的可变剪接。 由于SPAs产生于PWS的核心基因缺失区域, 这些RNA 分子的表达缺失可能与PWS的发生、发展密切相关。 因此, SPAs的研究为探索PWS的致病机理奠定了重要 的理论基础。<\/span>

4 两端为box H/ACA结尾的SLERT加工 机制与功能<\/strong>

通过对前期创建的无poly(A)尾转录组测序和 分析, 我们还发现了另外一条全新的sno-lncRNA, 该 lncRNA两端以box H/ACA snoRNA(图1A), 我们将 其命名为SLERT(snoRNA-ended lncRNA enhances pre-ribosomal RNA transcription)。SLERT全长为694 个核苷酸, 位于人七号染色体TBRG4(transforming growth factor beta regulator 4)基因的第3个内含子中, 由pre-RNA可变剪接生成。为了研究SLERT的定位 情况, 我们进行了人卵巢癌PA1细胞的核质分离实 验, 发现SLERT位于细胞核的核仁中(图1B)。随后, 我们对SLERT原位FISH以及细胞核仁蛋白Nucleolin 免疫染色发现, 两者在细胞中位置基本一致(图1C), 进一步证实了SLERT定位在细胞核的核仁中。由于 很大一部分snoRNA同样定位在核仁中, 我们猜想, SLERT的定位可能与其两端snoRNA相关。随后, 我 们构建了两端snoRNA部分缺失的SLERT, 并将之转入细胞中进行定位观测, 最终发现snoRNA被破坏的 SLERT散乱分布在细胞核中(图1D), 证明了SLERT在 细胞核核仁中的定位由其两端的snoRNA介导。<\/span>

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A: 人源胚胎干细胞H9的RNA测序结果以及Northern blot验证SLERT存在; B: 人源卵巢癌细胞PA1的核质分离; C: SLERT以及核仁蛋白Nucleolin
在PA1细胞中的的染色; D: SLERT以及其突变体与核仁蛋白Nucleolin在人源宫颈癌细胞HeLa中的的染色。
A: RNA-seq data of H9 cells and Northern blot detected SLERT in H9 and PA1 cells; B: subcellular fractionation of PA1 cells; C: co-staining of SLERT
and Nucleolin in PA1 cells; D: co-staining of SLERT mutant and Nucleolin in HeLa cells.
图1 SLERT的发现及特性研究(根据参考文献[12]修改)
Fig.1 Identification of box H/ACA sno-lncRNA SLERT (modified from reference [12])<\/p>

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A: SLERT敲除导致了pre-rRNA表达量的下降; B: SLERT结合蛋白的鉴定; C: SLERT143在体外可与DDX21直接结合。*表示DDX21单体, **表示 DDX21多聚体, 箭头表示RNA单体。 A: SLERT knockout (KO) reduced the steady-state level of pre-rRNA; B: identification of proteins associated with SLERT; C: SLERT143 interacted with DDX21 in vitro. One and two asterisks denoted monomer and multimer status, respectively, and the arrow without any asterisk indicated RNA-only. 图2 SLERT增强了pre-rRNA的转录并与DDX21相结合(根据参考文献[12]修改) Fig.2 SLERT enhances pre-rRNA transcription and is associated with DDX21 (modified from reference [12])<\/p>


为研究SLERT的功能, 我们利用CRISPR/CAS9 基因编辑技术对SLERT进行敲除。由于SLERT定 位于细胞核的核仁中, 而核仁是RNA聚合酶I(RNA polymerase I, Pol I)转录生成核糖体RNA的场所, 我 们猜测, SLERT可能参与了这个过程。利用Northern blot的实验方法在SLERT KO的细胞株中检测核糖 体前体RNA(pre-rRNA)发现, pre-rRNA的表达大幅 下降(图2A), 表明SLERT在正常人细胞中可以促进 Pol I转录。为阐明SLERT在Pol I转录中的作用, 我 们利用了tRSA pulldown的方法对其结合的蛋白进 行了检测, 发现DDX21可与其相结合。DDX21是一 类RNA解旋酶[18], 最近有报道其与rRNA的生成加 工相关[19]。随后, 我们利用Western blot的实验方法 对质谱结果分析进一步验证了SLERT与DDX21的 结合(图2B)。另外, 体外纯化蛋白DDX21与SLERT的凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)证明, SLERT可以与DDX21直接结合(图2C)。<\/span>

目前, 人们对于DDX21功能还知之甚少, 为了 探究DDX21在pre-rRNA转录中的作用, 我们首先 采用了3D-SIM技术对其在细胞中的定位进行观 察。令人惊奇的是, DDX21在PA1细胞的核仁中呈 现出直径约为400 nm的环状排布(图3A), 而当用 Pol I转录抑制剂actinomycin D处理细胞之后, 这些 环状结构也随之消失, 提示DDX21的环状排布可能 与Pol I转录相关。随后, 我们将DDX21与Pol I的大 亚基RPA194共同染色, 3D-SIM观察结果显示, Pol I 处于DDX21环状结构的中央(图3B), 提示DDX21可 能与Pol I相互作用。后续的蛋白免疫共沉淀实验 (Co-immunoprecipitation, Co-IP)也证实了这一点(图 3C)。我们利用shRNA技术对DDX21蛋白进行了敲 除操作(图3D), 发现DDX21缺失后细胞的pre-rRNA 的表达水平相比对照组有了明显上升(图3E), 提示 DDX21通过结合Pol I来抑制转录。<\/span>
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\"\"/
A: DDX21在核仁中形成环状排布; B: Pol I位于DDX21环的中心区域; C: 在PA1细胞中, DDX21可以与Pol I结合; D: 利用shRNA对DDX21蛋白 进行敲除; E: DDX21的敲除导致了pre-rRNA表达量的增加, **P<0.01。 A: DDX21 forms ring-shaped structures in the nucleolus; B: the Pol I complexes are located within DDX21 rings; C: DDX21 interacts with RPA194 in PA1 cells; D: DDX21 knockdown by two different shRNAs; E: DDX21 knockdown led to enhanced steady-state levels of pre-rRNAs, **P<0.01. 图3 DDX21在核仁中成环状排布并抑制Pol I的转录(根据参考文献[12]修改) Fig.3 DDX21 forms ring-like structures and inhibit Pol I transcription (modified from reference [12])<\/p>


为阐释SLERT、DDX21以及Pol I在转录调控 过程中的关系, 我们在SLERT敲除以及过表达细胞中对DDX21环的直径大小以及pre-rRNA生成量进 行了统计。结果表明, SLERT表达量越多, 相应的 DDX21环的直径越长, 而pre-rRNA的生成也随之增 加(图4A)。这说明, SLERT是通过改变DDX21环直 径的长度来调控Pol I的转录。进一步的荧光能量共 振转移(F?rster resonance energy transfer, FRET)实验 证明, SLERT可以改变单个与之结合的DDX21的分 子构象(图4B), 从而起到调控DDX21环状排布的作 用。另外, 在SLERT敲除的细胞中进行蛋白免疫共 沉淀实验表明, 在缺少SLERT的情况下, DDX21与 Pol I的结合更加紧密(图4C), 抑制转录的效果更强。<\/span>

有研究表明, 很多肿瘤的发生都与rRNA的异 常有关[20-21], 而SLERT能够促进rRNA的产生[12], 提示 SLERT可能与肿瘤发生相关。将SLERT敲除的细胞 注射到裸鼠背部并使其生长, 我们发现, SLERT的缺 失可以抑制小鼠的体外的肿瘤生长, 使肿瘤体积减 小(图4D)及体重减轻(图4E), 这表明SLERT通过调控 Pol I转录而对肿瘤生成起到促进作用。<\/span>

本研究首次在人类细胞中发现了可以调控Pol I 转录的长链非编码RNA, 并阐释了此RNA独特的改变DDX21蛋白构象的功能, 拓展了长链非编码RNA的 作用机制。该研究通过多种实验手段揭示了DDX21 环直径的大小对于Pol I转录的调控机制以及SLERT对 DDX21环的控制作用, 以崭新的视角揭示了Pol I转录 的新机制, 为进一步研究核仁结构及功能提供了新的 方向, 同时, 也为针对Pol I转录的肿瘤靶向治疗提供 了新的靶标。<\/span>

5 总结与展望<\/strong>
通过对哺乳动物转录组包括无poly(A)尾RNA转 录组的分离纯化分析, 我们发现了一系列分子末端 含有snoRNP特殊结构的新型长链非编码RNA分子家 族, 揭示了哺乳动物细胞转录组的复杂性。这些含有 snoRNA结构的新型长链非编码RNA结构特殊, 其产 生具有物种特异性, 并且在人细胞中表达量非常丰 富, 提示这些RNA分子在人类细胞功能中可能扮演着 极为重要的角色。更为重要的是, 这些新的长链非编 码RNA分子与细胞核仁Pol I转录调控偶联的肿瘤发 生以及小胖威利综合征等人类疾病密切关联。总之,我们的研究初步解析了这些疾病相关的长链非编码 RNA的加工生成机制及作用功能, 为进一步认识人类 疾病的发生、发展提供了新的研究思路, 也为相关疾 病的治疗奠定了理论基础。随着今后生物学技术方 法的不断完善发展以及对人类转录组进行更加深入 的分析和研究, 未来人们有望发现更多新类型的特殊 长链非编码RNA。这些曾经被称为“转录组垃圾”的 RNA分子很可能以不同的形式更加广泛地参与到细 胞的各种层次调控中去, 拓展并加深人们对于正常生 命活动以及疾病发生的认识与理解。<\/span><\/p>

\"\"/
A: SLERT表达量、DDX21环的大小以及pre-rRNA的产量之间呈正相关性; ns: 差异性不显著; B: SLERT结合DDX21并改变其单个分子构象; C: SLERT的缺失导致DDX21与Pol I结合增强; D、E: 利用SLERT敲除细胞进行裸鼠体外成瘤实验。 A: the positive correlation of SLERT expression, DDX21 ring size, and pre-rRNA production; ns: not significant; B: binding of SLERT induces conformational change of individual DDX21 molecules; C: SLERT depletion leads to increased interaction between DDX21 and RPA194; D,E: Xenograft assay of SLERT knockout (KO) cells in nude mouse. 图4 SLERT通过控制DDX21环的大小来促进Pol I的转录并促进肿瘤生成(根据参考文献[12]修改) Fig.4 SLERT promotes Pol I transcription and tumorigenesis by controlling the sizes of DDX21 ring-shaped structures (modified from reference [12])<\/p>


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参考文献 (References)<\/strong>
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21 Nguyen le XT, Raval A, Garcia JS, Mitchell BS. Regulation of ribosomal gene expression in cancer. J Cell Physiol 2015; 230(6): 1181-8.<\/p>


<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-24-46-496.jpg","cshort":"

陈玲玲, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研 究员、博士生导师, 从事长链非编码RNA(lncRNA)代谢与功能研究。2011 年回国以来, 主要集中于新型lncRNA家族的发现、自身加工代谢机制及 其在细胞核结构和功能调控等领域开展前沿性探索, 在Cell、Nat Rev Mol Cell Biol、Mol Cell等期刊发表责任作者论文30余篇。入选霍华德 休斯 国际研究员(HHMI International Research Scholar)。 <\/span><\/p>","cshort2":"

陈玲玲, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研 究员、博士生导师, 从事长链非编码RNA(lncRNA)代谢与功能研究。2011 年回国以来, 主要集中于新型lncRNA家族的发现、自身加工代谢机制及 其在细胞核结构和功能调控等领域开展前沿性探索, 在Cell、Nat Rev Mol Cell Biol、Mol Cell等期刊发表责任作者论文30余篇。入选霍华德 休斯 国际研究员(HHMI International Research Scholar); 曾获中国青年女科学家奖、全球华人生物学家协会青年研究员奖(CBIS Young Investigator Award)等。目前担任国际期刊Trends in Genetics、Genome Biology和Journal of Biological Chemistry 的编委。 <\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"小核仁RNA相关的长链非编码RNA家族的发现与功能研究","listseq":49,"seqno":"11","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-11-09-47-030"},{"caddress1":"(1浙江大学医学院, 卫生部医学神经生物学重点实验室, 神经科学研究中心, 杭州 310013; 2中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所, 国家重点神经科学实验室, 上海 200031; 3中国科学院大学, 上海 200031; 4浙江大学求是高等研究院, 杭州 310013)","cauthor":"周亭亭1,2,3<\/sup> 胡海岚1,4*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":254,"clong1":"

1 社会等级神经基础研究的现状<\/strong>
在多数物种中, 精神力量或者说性格因素(包括 勇气、坚持力、驱动力)以及先前胜利的经历都会 影响个体的社会地位[1-5]。2011年, 我们课题组首次 建立研究小鼠的社会等级的行为范式—钻管测 试[6]。我们发现, 用钻管测试的方法测量出来的社会 等级具有传递性和稳定性, 并且与其他社会等级行 为具有高度相关性。借助钻管测试的方法我们发现, 中缝背侧前额叶皮层(dorsalmedial prefrontal cortex, dmPFC)的突触连接强度与小鼠的社会地位呈正相 关。使用辛德毕斯(sindbis)病毒在dmPFC表达增强突 触连接的基因可以使小鼠社会等级升高, 而减弱突 触连接的基因则可以使小鼠社会等级降低。然而, 使 用sindbis病毒包装相应基因来操控突触连接强度的 方法时间精确度比较低, 小鼠社会等级的改变发生 在注射病毒后的12~24 h, 无法区分社会等级的变化 是间接的由于激素的变化还是直接的由于神经活动 引起。dmPFC的神经元活动性是如何即时地调控社 会等级相关行为依然是一个谜团。<\/span>
除了以上内在因素, 社会等级的建立可能会受到“胜利者效应”的影响[1,7-10]。所谓的“胜利者效应”, 是指动物先前的胜利经历, 会使之后面的胜利更加 容易。“胜利者效应”从鱼、鸟类到哺乳动物都广泛 存在。目前关于其机制的研究多关注在胜利前后各 种神经内分泌物质的变化, 比如雄性激素、糖皮质 激素、多巴胺等, 然而关于“胜利者效应”的神经环 路机制鲜有研究涉及[8,11]。另外, 目前对于“胜利者 效应”的研究全部都是在同一种行为学范式中, “胜 利者效应”是否可以推广, 也就是说, 从一种竞争中 获得的胜利是否可以转移到其他行为中去, 也尚未 可知。<\/span>

2 赢的小鼠在钻管测试中发出更多推挤和抵抗<\/strong>
为了在实验小鼠中研究社会竞争, 我们采用了 钻管测试的方法并对小鼠在钻管测试中的行为进行 了细致的划分。钻管测试中老鼠的行为被分为: 主 动推挤、反推挤、抵抗、后退和静止。通过对72次 钻管测试比赛的分析, 我们发现, 赢的小鼠会比输的 小鼠主动发出更多推挤, 并且每次推挤会持续更长的时间。当被推挤的时候, 赢的小鼠会更多地进行 反击推挤和抵抗以及更少地后退。我们对一笼四只 小鼠的推挤行为进行了分析, 发现等级相近的小鼠 之间会比等级悬殊的小鼠比赛时间更长并且有更多 次的推挤。<\/span>

3 前额叶皮层神经元在社交竞争的“努 力”行为过程中被激活<\/strong>
我们在自由活动的小鼠进行钻管测试的时候, 对它们的前额叶皮层进行了单细胞水平的在体电 生理记录。我们成功地在ACC(anterior cingulate cortex) 和PL(prelimbic cortex)记录到了342个神 经元, 其中包括306个潜在的锥体神经元(putative pyramidal neurons, pPyr)和36个潜在的中间神经元 (putative interneurons, pIN)。我们分析了这些神经元 在不同的行为(包括推挤、抵抗、后退、静止)中的 发放活动。结果发现, pPyr神经元在推挤的时候有 更高的发放频率, 而pIN则在小鼠后退的时候有发放 增加的趋势。值得注意的是, 有一群神经元, 在小鼠 推挤和抵抗的时候, 发放频率会显著地升高, 这群神 经元所占的比例显著地高于在推挤和抵抗的时候发 放频率显著降低的比例。而在后退的时候, 发放显 著升高和显著降低的细胞比例则没有什么差别。在 推挤的时候显著升高的神经元中, 有三分之一在抵 抗的时候也会显著升高, 而且它们的发放频率的改 变在这两种不同的行为中呈高度线性相关关系。这 说明, 尽管推挤和抵抗是两种不同的需要付出努力 的行为(前者需要身体的移动, 而后者不需要), 它们 会以相似的方式募集dmPFC中同一群神经元。<\/span>

4 DREADDs抑制dmPFC减少努力行为 并导致失败<\/strong>
为了研究dmPFC神经元活动对于钻管测试中 的胜利是否必需, 我们采取了DREADDs(designer receptors exclusively activated by designer drugs) 的 方法, 具体地, 我们把hM4D[human M4 muscarinic receptor (Gi)]病毒表达在小鼠的双侧前额叶皮层, 对表达了hM4D的神经元进行体外细胞记录发现, 给予CNO(clozapine-N-oxid)后这些细胞的活动性降 低。对这些老鼠进行腹腔注射CNO, 发现在注射后 1~1.5 h, 这些小鼠的社会等级开始降低, 并且在6~8 h 降到最低。在CNO注射之后, 小鼠的推挤次数和时长都有明显降低, 而且它们会发出更多的后退。<\/span>

5 光遗传学激活dmPFC瞬时直接地引起 钻管测试中的胜利<\/strong>
接着我们利用光遗传学的手段测试了dmPFC 的激活是否足以快速地在社会竞争中诱导胜利。我 们在小鼠的前额叶皮层表达了广谱的启动子CAG驱 动的chR2(channelrhodopsin 2), 并在该脑区上方埋入 光纤。我们的在体电生理和脑片电生理实验证明, 表达了chR2的细胞可以受光刺激而被激活。我们用 100 hz的高频相位刺激和5 hz的刺激都可以激活前 额叶皮层并且相应地可以使小鼠在钻管测试中发出 更多次、更长时间的推挤, 从而使小鼠即时地赢得 钻管测试的比赛。我们发现, 光激活赢得比赛所需 要的光强与对手之间的等级差呈正相关, 也就是说 两只小鼠等级差别越大, 会越需要更大的光强使低 等级小鼠战胜对手。<\/span>

重要的是, 光遗传激活dmPFC并没有改变小鼠 的肌肉力量。而且大部分光遗传激活前额叶皮层使 小鼠赢得比赛, 都发生在一分钟之内, 提示雄性激素 很有可能来不及参与这样快速的过程。而我们也检 测了光照1 min和1.5 h的雄性激素水平, 发现与基线 并没有差别。另外, 为了测试光遗传激活dmPFC是 否通过影响攻击性水平来调控社会等级, 我们也在 resident-intruder test激活小鼠的dmPFC, 结果发现, 光 照并不会改变小鼠的攻击水平。另外, 光照时也不会 改变小鼠对陌生和熟悉小鼠的识别, 说明小鼠的社 会等级的变化并不是由社会识别的异常引起的。<\/span>

我们还精准地操纵了前额叶皮层的不同亚区。 结果发现, ACC更靠后的部分和前额叶皮层更深层 (infralimbic cortex, IL)的激活并不能调控钻管测试 中的等级。另外, 对于dmPFC锥体神经元的特异性 激活, 也可以使钻管测试中的社会等级升高。<\/span>

6 MDT(mediodorsal thalamic)-dmPFC 环路突触强度介导钻管测试中的“胜利者 效应”<\/strong>
在光照激活前额叶皮层的实验里, 我们发现, 在不照光的第2 d, 小鼠在钻管测试中的表现分为两 种: 一种小鼠在第2 d可以维持升高的等级不变, 而 第二种小鼠的等级则会降回去。我们分析了这两类 小鼠在照光当天经历的不同, 发现维持等级的小鼠都接受了超过6次的光照, 而接受光照少于5次的小鼠等 级则会降回来。我们另外设计实验证明, 这种等级的 维持并不是由对手的变化引起的。这种现象符合“胜 利者效应”。如果给接受超过6次照光赢的小鼠腹腔 注射MK801, 这些小鼠的等级则会再恢复。这说明, 这种“胜利者效应”, 是依赖于神经元可塑性的。<\/span>

接下来, 我们探索了胜利者效应的神经环路基 础。中缝背侧丘脑(MDT)是前额叶皮层的主要上游 之一。有研究证明, MDT-PFC的环路神经突触连接 在重复的被攻击之后会被削弱[12]。我们由此提出了 MDT-PFC这个环路有可能介导了“胜利者效应”这 样的假说。为了证明这个假说, 我们做了如下实验。 (1)结合光遗传学和在体电生理记录的方法, 我们发 现, MDT-PFC在重复赢6次之后的突触连接强度增 强。(2)在MDT表达了光敏感离子通道蛋白的老鼠上, 用光低频(low frequency stimulation, LFS)刺激MDTPFC 的神经突触末梢, 可以在这个环路上产生长时 程的突触后减弱(long term depression, LTD)。如果 在小鼠照光重复赢6次之后立刻给MDT-PFC这个环 路低频刺激, 则会使“胜利者效应”消失。(3)同样在 MDT表达了光敏感离子通道蛋白的老鼠上, 用高频 刺激(high frequency stimulation, HFS)刺激MDT-PFC 的神经突触末梢, 可以在这个环路上产生长时程的 突出后增强(long term potentiation, LTP)。如果在小 鼠生活的笼子里给小鼠LTP的刺激, 则可以直接诱 导使之钻管测试等级升高。以上实验证据从相关性、 必要性和充分性三个方面说明, MDT-PFC这个环路 的神经突触连接介导了“胜利者效应”。<\/span>

7 “胜利者效应”从钻管测试到热源争抢 测试中的转移<\/strong>
为了检测胜利者效应是否能够在不同类型的竞 争中迁移, 我们首先设计了一种新的检测社会等级的 行为学范式: 把同笼四只小鼠放在一个冰冷的盒子 里, 这个盒子里有一个只能容得下一只小鼠的角落是 温暖的, 这四只小鼠便会去竞争这个温暖的角落。我 们发现, 在温暖的窝中测量的等级与钻管测试获得的 等级具有非常好的相关性。而且用DREADDs的方法 激活dmPFC, 也可以提高在热源争抢测试中的等级。 以上结果说明, 这个热源争抢测试也可以用来检测社 会等级。我们用光遗传学激活前额叶皮层的方法使 原先低等级的小鼠在钻管测试中重复赢10次之后, 这只原先低等级的小鼠在热源争抢测试中的等级也会 升高。这说明, 在一种行为学范式中的胜利经历也可 以转移到其他类型的竞争中。<\/span>

8 总结<\/strong>
这项研究结合了行为学、电生理、光遗传等多 层手段, 首次确定了前额叶皮层对社会竞争的动态 控制, 第一次发现了“胜利者效应”的神经环路, 并且 第一次发现了“胜利者效应”在不同行为学范式中的 转移。由于社会等级与健康状况息息相关, 这为研 究社会等级相关的疾病提供了治疗靶点, 并且为在 各项比赛中提高参赛选手的表现的行为训练策略提 供了理论依据。<\/span>

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参考文献 (References)<\/strong>
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<\/p>","coverpic":"Upload/qianyan/20-05-20-09-23-12-187.jpg","cshort":"

胡海岚, 浙江大学神经科学研究中心教授。1996年于北京大学获得学士学位,2002年于加州大学伯克利分校获得神经生物学博士学位。2003~2008年在美国冷泉港实验室和弗吉尼亚大学从事博士后研究工作, 2008~2015年在中国科学院上海生命科学研究院担任研究员、博士生导师, 自2015年5月起任职浙江大学。<\/span><\/p>","cshort2":"

胡海岚, 浙江大学神经科学研究中心教授。1996年于北京大学获得学士学位, 2002年于加州大学伯克利分校获得神经生物学博士学位。2003~2008年在美国冷泉港实验室和弗吉尼亚大学从事博士后研究工作, 2008~2015年在中国科学 院上海生命科学研究院担任研究员、博士生导师, 自2015年5月起任职浙江大 学。获得中国科学院优秀导师奖(两次)、明治生命科学杰出奖、中国青年女科学家奖及中国青年科技奖等。实验室致力于研究情绪与社会行为的分 子与神经环路机制。近六年来, 在情绪效价的神经编码(Nat Neurosci 2014; Ann Rev Neurosci 2016)、抑郁症发生的核心分子机制(Science 2013)以及社会等级 的神经基础(Science 2011; Trends Neurosc 2014; Science 2017)等方向取得了一 系列既有理论意义又有潜在应用价值的系统性原创成果。近期, 在Science杂 志以研究论文(research article)形式报导了胜利者效应调节社会竞争的神经环 路机制。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


<\/p>","ctitle":"胜利经历重塑丘脑–前额叶皮层 神经通路以稳固社会等级","listseq":50,"seqno":"10","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-11-08-34-704"},{"caddress1":"(中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室, 北京 100101)","cauthor":"马东媛 王 璐 薛媛媛 刘 峰*","cintpic":"","clicktime":337,"clong1":"

1 造血干细胞研究背景<\/strong>
对于血细胞起源的探究始于二十世纪初期, 然 而直到2010年, 来自荷兰、美国和法国的三个研究 组分别以小鼠和斑马鱼为模型, 才证实造血干细胞 是通过内皮–造血转化过程产生的[1-3]。随后, 调控 该过程的一系列关键转录因子和信号通路陆续被发 现[4-5]。在人、小鼠和斑马鱼等脊椎动物中, 血液发 生是一个保守的生物学过程。胚胎期造血干细胞产 生于主动脉–性腺–中肾区, 随后迁移到胎肝(小鼠和 人)或尾部造血组织(斑马鱼)进行扩增, 进而迁移至 胸腺向淋系细胞分化, 最后迁移至骨髓(小鼠和人) 或肾髓(斑马鱼)以维持终生造血[6]。从分子水平来看, 血液发生是由遗传因素和表观遗传因子协同介导的 一个多步骤、多部位的动态发育过程, 其关键调控 要素既包括转录因子、表观修饰蛋白以及miRNA, 也涉及血液流动、炎性信号和内皮细胞等微环境因 素。在临床恶性血液疾病治疗时, 造血干细胞是骨 髓移植术的核心组分, 然而, 其来源匮乏一直是制约 血液疾病治疗的瓶颈。因此, 探索造血干细胞的体 内发育机制以及建立体外诱导扩增方案便成为当今 科学界的研究热点。<\/span>

2 胚胎期造血干细胞发育的关键因子<\/strong>
真核生物mRNA的修饰及其功能受到广泛关 注, 其中, N6-甲基腺嘌呤(N6-methyl-ade-nosine, m6A) 依赖的RNA甲基化是最常见、最丰富的修饰形式之 一。近年来, m6A在斑马鱼早期发育、果蝇性别决 定以及T细胞稳态等发育过程中的作用逐渐被揭示, 但其在血液发生中的作用却甚少被报道。我们通过 m6A测序技术、RNA-Seq以及基因敲降或敲除的表 型分析发现, m6A修饰水平下降后, 造血干细胞不能 正常产生, 血管的内皮特性却明显增强; 与此同时, 一系列动脉内皮发育相关的基因表达发生变化, 尤其是notch1a显著升高。单碱基分辨率m6A-miCLIPSeq 以及YTHDF2-RIP-Seq综合分析发现, m6A通过 YTHDF2介导了notch1a的稳定性以维持内皮细胞和 造血细胞基因表达的平衡, 进而调控造血干细胞的 命运决定[7]。特别需要强调的是, Notch信号在血管 和血液发生中是动态变化的; 我们首次通过实验证 实, 造血干细胞发育过程中并不是一直需要Notch信 号, 尤其是在内皮–造血转化过程中, Notch信号需要 下调[8]。除了Gpr183-Arrb1-Nedd4对Notch1的负向调 节, 我们还发现, BLOS2与Notch1结合并介导其进入 内体–溶酶体降解途径, 而转录共抑制子Ncor2通过 Fos-Vegfd调控Notch信号活性, 进而调控造血干细胞 产生或维持[9-11]。<\/span>

在胚胎期造血干细胞发育过程中, ERK信号也 是剂量依赖的, 并被多因素动态协同调控。内皮细 胞中Smad1/5通过招募HDAC1对ERK的抑制作用有 利于造血干细胞产生, 过量的ERK1/2会使得动脉内 皮特性以及内皮细胞间的紧密连接增强, 导致内皮– 造血细胞的转化过程受到抑制[12]。我们还通过ChIPPCR 、萤光素酶报告系统以及基因敲除后的表型分析 等实验证实, ETS家族转录因子Fev(又称为Pet1)可以 直接结合erk启动子区并调控其表达, 以便维持ERK 的水平, 进而促进造血干细胞产生[13]。此外, Fev还通 过tph2控制5-羟色胺(5-HT)合成, 进而影响5-HT神经 元的分化及维持。在此基础上, 我们发现, Fev/Pet1、 Tph2和AAAD等参与5-HT合成的重要转录因子和合 成酶在AGM区内皮细胞和间充质细胞中均有表达。 在内皮细胞特异性缺失tph2(vec-cre;tph2+/fl)的小鼠胚 胎中, AGM区内皮细胞中的5-HT水平下降, 造血簇大 小和数目显著降低, 造血干细胞发育异常。我们还 意外地发现, 在tph2–/–和pet1-cre;tph2fl/fl胚胎中, AGM 区造血簇数量是正常的。这是因为, Shh-Nkx2.2- Lmx1b-Pet1通路因负反馈调控而上调, ERK信号被激活, 造血干细胞增殖加快, 进而使得完全缺失tph2 的胚胎中造血发育缺陷得到恢复[14]。<\/span>

在造血干细胞分化阶段, 我们发现, 转录因子 Irf4对淋系细胞的命运决定至关重要。Irf4直接调控 趋化因子受体Ccr9a, 促进淋系细胞归巢; 同时, Irf4 也可以直接抑制pu.1表达, 阻止前体细胞向髓系分 化[15]。转录因子Foxn1通过调节胸腺上皮细胞发育 而为T淋巴细胞分化和成熟提供所需的微环境[16]。 在红细胞成熟阶段, 我们证实, KLF家族的转录因子 klf3和klf6是关键的调控基因[17]。<\/span>

3 胚胎期造血干细胞发育的微环境<\/strong>

造血干细胞的发育不仅需要内源转录因子和 关键蛋白的精密调控, 同时也受周围环境的影响。 随着发育的进程, 造血干细胞由其产生部位主动脉– 性腺–中肾区域迁移至胎肝或尾部造血组织, 最后到 达骨髓或肾髓, 每个阶段所处的不同微环境都有其 特定的作用。对于造血干细胞而言, 微环境既包括 干细胞周围的其他细胞群体(例如: 内皮细胞、间充 质细胞、成骨及破骨细胞等), 也包含血液流动剪切 力、氧气浓度和温度等一系列生物物理性因素。<\/span>

研究表明, 血液流动的机械力可以通过一氧化 氮(NO)信号通路促进生血内皮产生造血干细胞[18]。 我们的研究工作进一步揭示, 内皮细胞中存在一个 重要的响应血液流动剪切力的转录因子Klf2a, Klf2a 直接调控一氧化氮合成酶基因的表达, 进而调控NO 在体内的含量。这一发现深入阐释了血液流动调控 造血干细胞产生的新机制[19]。众所周知, 炎性信号 参与机体病理和应激反应; 而在生理状态下, 我们发 现, 炎性信号TLR4-Myd88-NFκB通路对胚胎期造血 干细胞的产生也有重要作用, TLR4缺失导致的造血 缺陷表型是由Notch信号介导的[20]。血管内皮不仅 是造血干细胞的来源, 同时也为造血干细胞的迅速 扩增和分化提供了必要条件。我们利用斑马鱼体外 发育和早期胚胎透明的优势, 实时观察造血干细胞 与血管内皮细胞的相互作用。通过功能实验揭示, 斑马鱼尾部血管内皮细胞是造血干细胞必要的微环 境, 并且通过Klf6a-Ccl21通路有效促进造血干细胞 的扩增[21]。<\/span>

4 造血干细胞研究展望<\/strong>
综上所述, 基于小鼠和斑马鱼等模式动物的研究基本阐释了脊椎动物血液发生的过程, 并从分子 水平初步揭示了其调控机制, 包括: 重要的转录因 子、表观修饰蛋白、信号通路以及微环境等(图1)。 此后, 随着单细胞测序、高灵敏性染色质免疫共沉 淀(STAR ChIP-seq)、核染色质转座酶可接近性高通 量测序分析(ATAC-seq)、高分辩率全基因组DNaseI 超敏位点测序(liDNase-seq)和全基因组甲基化测序 (WGBS)等高灵敏和高通量测序方法的开发以及基 于CRISPR/Cas或多色荧光的活体示踪技术的应用, 将会帮助科研工作者从更新、更深、更广的角度认 识并研究血液发生过程, 更为精确地阐释该过程的 动态调控及各系细胞的命运决定和谱系分化, 揭示 不同微环境对血液发生各阶段的精密、协同调控。 与此同时, 鉴于造血干细胞在临床血液疾病治疗中 的重要地位与广阔应用前景, 造血干细胞的体外诱 导和扩增仍将是研究热点。更为清晰和准确地认识 内源性和外源性因素的协同调控, 也将有助于促进 体外造血的早日实现。<\/span><\/p>

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在胚胎期造血干细胞产生过程中, TLR4-Myd88-NFκB通路、RNA甲基化、Gpr183以及Ncor2通过影响Notch信号进行调控, 同时Fev和BMP信
号通过ERK信号通路调控; 在造血干细胞维持阶段, 血液流动通过调控Klf2a-NO通路、5-HT及Klf6/ccl25b都参与调控造血干细胞维持及扩增;
在血细胞分化阶段, FoxN1及Irf4a参与造血干细胞向淋系分化, 而Klf3/6影响其向红系分化。
TLR4-Myd88-NFκB, RNA methylation, Gpr183 and Ncor2 are involved in HSC specification via Notch signaling, while Fev and BMP regulate ERK signaling in this process. Blood flow regulates HSC maintenance through the Klf2a-NO cascade, whereas 5-HT and Klf6/ccl25b regulate HSC maintenance as well as expansion. Once HSCs are formed, FoxN1 and Irf4a thereby drive them towards lymphoid differentiation, while Klf3/Klf6 regulates erythroid differentiation.<\/p>

图1 造血干细胞发育的调控网络
Fig.1 The regulatory network of hematopoietic stem cell (HSC) development duringembryogenesis<\/p>



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参考文献 (References)<\/strong>
1 Bertrand JY, Chi NC, Santoso B, Teng S, Stainier DY, Traver D. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature 2010; 464(7285): 108- 11.

2 Boisset JC, van Cappellen W, Andrieu-Soler C, Galjart N, Dzierzak E, Robin C. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature 2010; 464(7285): 116-20.

3 Kissa K, Herbomel P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature 2010; 464(7285): 112-5.

4 Jagannathan-Bogdan M, Zon LI. Hematopoiesis. Development 2013; 140(12): 2463-7.

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6 Orkin SH, Zon LI. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell 2008; 132(4): 631-44.

7 Zhang C, Chen Y, Sun B, Wang L, Yang Y, Ma D, et al. m6A modulates haematopoietic stem and progenitor cell specification. Nature 2017; 549(7671): 273-6.

8 Zhang P, He Q, Chen D, Liu W, Wang L, Zhang C, et al. G protein-coupled receptor 183 facilitates endothelial-tohematopoietic transition via Notch1 inhibition. Cell Res 2015; 25(10): 1093-107.

9 Wei Y, Ma D, Gao Y, Zhang C, Wang L, Liu F. Ncor2 is required for hematopoietic stem cell emergence by inhibiting Fos signaling in zebrafish. Blood 2014; 124(10): 1578-85.

10 Zhou W, He Q, Zhang C, He X, Cui Z, Liu F, et al. BLOS2 negatively regulates Notch signaling during neural and hematopoietic stem and progenitor cell development. Elife 2016; 5: doi: 10.7554/ eLife.18108.

11 He Q, Gao S, Lv J, Li W, Liu F. BLOS2 maintains hematopoietic stem cells in the fetal liver via repressing Notch signaling. Exp Hematol 2017; 51: 1-6.e2.

12 Zhang C, Lv J, He Q, Wang S, Gao Y, Meng A, et al. Inhibition of endothelial ERK signalling by Smad1/5 is essential for haematopoietic stem cell emergence. Nat Commun 2014; 5: 3431.

13 Wang L, Liu T, Xu L, Gao Y, Wei Y, Duan C, et al. Fev regulates hematopoietic stem cell development via ERK signaling. Blood 2013; 122(3): 367-75.

14 Lv J, Wang L, Gao Y, Ding YQ, Liu F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med 2017; 214(2): 529-45.

15 Wang S, He Q, Ma D, Xue Y, Liu F. Irf4 regulates the choice between T lymphoid-primed progenitor and myeloid lineage fates during embryogenesis. Dev Cell 2015; 34(6): 621-31.

16 Ma D, Wang L, Wang S, Gao Y, Wei Y, Liu F. Foxn1 maintains thymic epithelial cells to support T-cell development via mcm2 in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109(51): 21040-5.

17 Xue Y, Gao S, Liu F. Genome-wide analysis of the zebrafish Klf family identifies two genes important for erythroid maturation. Dev Biol 2015; 403(2): 115-27.

18 North TE, Goessling W, Peeters M, Li P, Ceol C, Lord AM, et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell 2009; 137(4): 736-48.

19 Wang L, Zhang P, Wei Y, Gao Y, Patient R, Liu F. A blood flow-dependent klf2a-NO signaling cascade is required for stabilization of hematopoietic stem cell programming in zebrafish embryos. Blood 2011; 118(15): 4102-10.

20 He Q, Zhang C, Wang L, Zhang P, Ma D, Lv J, et al. Inflammatory signaling regulates hematopoietic stem and progenitor cell emergence in vertebrates. Blood 2015; 125(7): 1098-106.

21 Xue Y, Lv J, Zhang C, Wang L, Ma D, Liu F. The vascular Niche regulates hematopoietic stem and progenitor cell lodgment and expansion via klf6a-ccl25b. Dev Cell 2017; 42(4): 349-62.e4.<\/p>


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刘峰, 中国科学院动物研究所研究员, 1999年毕业于中国科学院遗传研究所, 获理学博士学位。2000年至2008年分别在新加坡国立大学、美国范德 堡大学医学院和英国牛津大学分子医学研究所, 利用斑马鱼和非洲爪蟾等 模式动物进行血液和血管发育的基础研究。<\/span><\/p>","cshort2":"

刘峰, 中国科学院动物研究所研究员, 1999年毕业于中国科学院遗传研究所, 获理学博士学位。2000年至2008年分别在新加坡国立大学、美国范德 堡大学医学院和英国牛津大学分子医学研究所, 利用斑马鱼和非洲爪蟾等 模式动物进行血液和血管发育的基础研究。2009年加入中国科学院动物研究所, 任研究员。刘峰研究员主要从事血 液系统发育研究, 尤其关注血液与心血管干细胞/前体细胞的形成、造血 干细胞命运决定、维持及分化等。刘峰研究组首次阐释RNA甲基化修饰 调控胚胎期造血干细胞发育的分子机制; 证实了Notch信号动态变化的必 要性, 鉴定了多个在造血干细胞命运决定、产生和分化过程中的关键因子, 揭示了微环境的重要作用。现已在Nature、Dev Cell、EMBO J、PNAS、 J Exp Med、Blood、Nat Commun、Cell Res和Development等刊物发表论文40余篇。其研究成果多次受到国际著名科学家的高度评价并被F1000重点评述和推荐。刘峰研究员还担任国际斑马鱼学会执行委员、中国动物学会斑马鱼分会主任委员、发育生物学专业委员会副主任委员兼任秘书长等社会职务。<\/span><\/p>","ctitle":"胚胎期造血干细胞发育的分子调控","listseq":51,"seqno":"9","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-11-07-29-915"},{"caddress1":"(1中国科学院神经科学研究所, 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心, 神经科学国家重点实验室, 上海 200031; 2中国科学院大学, 北京 100049)","cauthor":"穆 迪1,2<\/sup> 孙衍刚1*<\/sup>","cintpic":"","clicktime":293,"clong1":"

1 痒觉研究背景<\/strong>
痒觉是一种引起强烈抓挠欲望、令人不愉快的 感觉。痒觉诱发的抓挠行为可以去除已经入侵皮肤 的有害物质, 因此痒觉对动物个体生存有积极作用。 然而, 在皮肤相关的疾病中, 多数疾病都会出现瘙痒 症状[1]。临床常使用抗组胺类药物治疗瘙痒, 但是大 多数慢性痒对抗组胺类药物不敏感。这些难以根除 的瘙痒严重影响患者的生活质量。近年来, 关于痒 觉的神经机制研究方面取得了突破性的进展。<\/span>

临床上根据对组胺受体抑制剂的敏感性将痒分 为组胺依赖类型和非组胺依赖类型。一部分背根神 经节神经元表达组胺受体和TRPV1(transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 1)通道, 主要负责组胺依赖类型的痒觉[2-3]。另外一部分背 根神经节神经元表达Mrgprs(Mas-related G-proteincoupled receptors)受体家族以及TRPA1(transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1)通道[4-5]。研究发现, Mrgprs是非组胺依赖类型痒 觉的重要受体家族。MrgprA3阳性神经元的缺失显 著降低痒觉诱发的抓挠行为而不影响痛觉行为, 说 明MrgprA3阳性神经元是一类痒觉特异神经元[6-7]。<\/span>

近些年来, 许多工作研究了痒觉在脊髓水平的 传递环路。2007年, 研究人员发现了第一个痒觉特 异的基因—胃泌素释放肽受体(gastrin-releasing peptide receptor, GRPR)基因。GRPR阳性(GRPR+)神 经元分布在脊髓背角浅层, GRPR突变小鼠对多种致 痒剂引起的抓挠行为都有下降, 并且不影响机械或 者温度感受阈值[8]。杀死脊髓背角GRPR+神经元后,小鼠对致痒刺激的反应几乎完全消失[9]。这些结果 说明, GRPR+神经元是脊髓中特异介导痒觉的神经 元。最近的研究表明, 脊髓中表达NPRA(natriuretic peptide receptor A)的神经元可能是GRPR+神经元的 上游[10]。此外, 脊髓内的抑制性中间神经元对痒觉 环路具有重要的调节作用。脊髓中甘氨酸能抑制性 神经元是同时负责痛觉和痒觉的“门控”神经元, 杀 死或者抑制这群神经元会影响痛觉与痒觉行为[11]。 表达转录因子Bhlhb5(basic helix-loop-helix family, member e22)的神经元和表达神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)的抑制性神经元分别参与化学性致痒和机 械性致痒的调控[12-13]。除了来自脊髓内部的调控外, 脊髓也接受来自延髓等脑区的下行调控[14]。<\/span>
那么, 痒觉信息是如何从脊髓上传到大脑中 的呢？以往的研究表明, 脊髓的投射神经元到臂 旁核(parabrachial nucleus, PBN)、延髓腹外侧区 (ventral lateral medulla, VLM)、中央导水管周围灰质 (periaqueductal gray, PAG)等脑区都有投射, 其中, 脑 干的臂旁核有密集的来自脊髓的投射纤维分布[15]。 研究人员使用不同逆行染料同时标记投射到不同 脑区的脊髓投射神经元发现, 无论投射到PAG还是 VLM脑区的投射神经元都会同时投射到臂旁核, 进 一步提示臂旁核是接受脊髓输入的重要脑区[16]。<\/span>

臂旁核可以分为外侧臂旁核、内侧臂旁核以 及K?lliker-Fuse核。臂旁核中大部分神经元是兴 奋性神经元, 表达2型囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 2, VGLUT2)[17]。臂旁核除了接 受脊髓的投射外, 还接受来自延髓、脑桥、前脑、皮层等的输入[18-19]。臂旁核的输出包括脊髓、延髓、 脑桥、中脑、前脑等[18,20-21]。臂旁核的一个重要下 游脑区是中央杏仁核(central amygdala, CeA)[22-23]。 以往的研究提示, 臂旁核参与多种生理过程, 包括 传递痛和痒觉[24-25]、调节情绪[26-27]、控制摄食[28]等。 然而, 臂旁核在痒觉信息处理中的作用并不十分清 楚。所以, 我们深入研究了脊髓–臂旁核投射以及臂 旁核脑区在痒觉信息处理中的作用[29], 旨在揭示痒 觉传递的中枢环路机制。<\/span>

2 脊髓–臂旁核投射参与痒觉信息传递<\/strong>

我们验证了脊髓投射到臂旁核的神经元在痒 觉刺激时被激活。我们在臂旁核注射逆标染料标记 脊髓投射到臂旁核的神经元。在皮内注射致痒剂 后发现, 部分被逆标的细胞表达c-Fos蛋白。这说明, 部分脊髓投射到臂旁核的神经元在痒觉抓挠行为过 程中被激活, 提示痒觉信息可以经过脊髓–臂旁核投 射传入大脑。<\/span>

我们进一步使用光遗传学操控脊髓–臂旁核环 路, 研究脊髓–臂旁核投射在痒觉中的作用。我们向 野生型小鼠的脊髓注射AAV-eNpHR3.0-EYFP病毒 (eNpHR3.0实验组)或者AAV-EGFP对照病毒(EGFP 对照组), 并在双侧臂旁核埋植光纤。eNpHR3.0是 一种人工改造的氯离子泵, 可以在560~590 nm光 照下引起细胞膜电位超极化, 抑制动作电位的产 生, 是常用的光遗传抑制工具[30]。我们先给小鼠 皮内注射致痒剂, 再通过光照抑制脊髓–臂旁核投 射, 比较eNpHR3.0组给光时抓挠行为与不给光时 抓挠行为是否有差异以及eNpHR3.0实验组与对照 组整体是否有差异。我们发现, 在组胺致痒模型中, eNpHR3.0实验组在给光期间的抓挠次数相对不给 光期间明显减少, 而同样的给光并没有使EGFP对照 组有明显改变。在给光期间, eNpHR3.0组的抓挠次 数明显低于对照组(图1A和图1B)。这些结果说明, 抑制脊髓–臂旁核投射会减少组胺引起的抓挠行为。 在氯喹致痒模型中, 我们发现了类似的现象。小鼠 运动能力并未受到光抑制脊髓–臂旁核投射的影响。 这些结果说明, 脊髓–臂旁核投射对组胺依赖类型和 非组胺依赖类型致痒剂诱发抓挠行为都是必要的。<\/span>

接下来的问题是, 脊髓投射到臂旁核的神经元 是否直接接受脊髓GRPR+神经元的输入？为了标记 并操控GRPR+神经元, 我们构建了GRPR-iCreERT2转基因小鼠。这种小鼠在他莫昔芬(tamoxifen)诱 导情况下启动Cre重组酶的功能[31]。我们使用单细 胞RT-PCR实验对转基因小鼠的特异性进行了验证, 发现这种小鼠标记的GRPR+神经元的大部分都表 达Grpr mRNA。这些GRPR+神经元绝大部分表达 Vglut2 mRNA, 提示GRPR+神经元是兴奋性神经元。 另外, 通过组化实验, 我们发现, GRPR+神经元不直接 向大脑投射, 提示GRPR+神经元是本地神经元。这些 结果与之前对GRPR+神经元性质的认识一致[32]。那 么, 这些GRPR+神经元是否与脊髓投射到臂旁核的 神经元形成突触连接, 进而将痒觉传递到大脑呢？ 通过急性分离脊髓片电生理记录, 我们发现, 脊髓 GRPR+神经元和脊髓投射到臂旁核的神经元存在兴 奋性单突触连接(图1C和图1D), 另外, 通过脑片电生 理记录, 我们发现, 脊髓投射到臂旁核也是单级兴奋 性突触连接。所以GRPR+神经元到臂旁核存在两级 兴奋性投射的结构, 痒觉信息可以通过这条环路传 递到大脑中的臂旁核。<\/span>

3 臂旁核是参与痒觉信息处理的重要脑区<\/strong>

我们进一步研究了在痒觉抓挠过程中臂旁核 细胞的活性变化。我们的实验结果表明, 给予致痒 刺激后, 臂旁核中c-Fos阳性神经元数量显著增加。 并且, 这些c-Fos阳性细胞绝大部分是谷氨酸能兴奋 性细胞。这提示, 臂旁核参与痒觉信息处理过程。 我们进一步采用在体光纤钙成像和在体胞外记录的 方法发现, 臂旁核细胞群体钙信号以及单细胞电活 动与抓挠行为有明显相关性。在抓挠动作开始之 前, 臂旁核细胞的钙信号已经开始上升(图1E), 说明 臂旁核细胞活性可能与痒觉信息传递相关。为了进 一步在痒觉抓挠过程中将痒觉感觉输入区与抓挠 所引起的机械感觉输入区分开, 我们采用了GRPRiCreERT2 小鼠与光遗传结合的方法。在GRPR+神经 元中表达光敏感通道ChR2(channel-rhodopsin 2)后, 在脊髓埋植无线LED, 通过给光诱导稳定的抓挠行 为。这种抓挠行为出现的时间点和给光之间存在延 迟, 一般在0.2~0.5 s。在这个时间窗口中, LED光照 可以引发GRPR+神经元激活, 痒觉感觉信号可以传 递到臂旁核。但是因为还没有出现抓挠行为, 所以 小鼠没有机械感觉输入。此时, 臂旁核神经元的钙 信号变化反应的是痒觉感觉信息对神经元的影响。 我们发现, 臂旁核钙信号在给光开始时间点开始升高, 这说明臂旁核的钙信号上升是激活GRPR+神经 元引起的。我们进一步分析发现, 在抓挠行为开始 的时间点, 小鼠的钙信号已经基本达到稳定, 抓挠动 作并没有明显继续使钙信号升高, 这进一步说明机 械感觉输入并不是钙信号上升的主要原因。<\/span>

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A、B: 光遗传学抑制脊髓到臂旁核投射降低组胺引起抓挠行为。A: 为36 min抓挠行为, 黄色区域数据点为给予黄色激光抑制的抓挠行为, eNpHR3.0实验组明显低于对照组; B: 为统计结果。C: 脊髓电生理记录示意图。D: 电生理记录显示, 光诱发的兴奋性突触后电流, 上图黑色为 加药前, 红色为加入拮抗剂后电流减小, 下图为统计图。E: 在组胺模型中, 光纤钙成像记录臂旁核神经元的钙信号变化与抓挠行为有相关性。F: 在臂旁核中腺相关病毒的表达情况。G: 药理遗传学抑制臂旁核对痒觉诱发的抓挠行为的影响。上图为实验流程图, 下图为抑制臂旁核明显减 少组胺与氯喹诱发的抓挠行为。
A,B: effect of optogenetic inhibition of the spino-parabrachial pathway on scratching behavior in response to histamine. A: 36 min scratching behavior. Each point represents the number of scratching bouts in light on period (yellowed shaded) or light off period. eNpHR3.0 group showed less scratching behaviors than EGFP group during light on period. B: the total number of scratching bouts during light on or off phase in response to histamine. C: schematic depicting virus and retrobeads injection as well as recording configuration in spinal slices. D: photostimulation evoked EPSCs in beads+ neurons. Top: representative traces showing EPSCs before (black) and after BNQX (red). Bottom: summary data showing the amplitude of light-evoked EPSCs. E: calcium transients associated with scratching behavior induced by histamine. Top: the heatmapillustrating calcium signals aligned to the beginning of scratching trains. Bottom: mean fluorescent signal of mice injected with AAV-hSyn-GCaMP6s (red) or AAV-hSyn-EGFP (blue) in the PBN in response to histamine. F: expression of hM4Di-mCitrine or EGFP in the PBN. G: effect of pharmacogenetic inhibition of the PBN on the scratching behavior. Top: timeline of the behavioral experiment. Bottom: scratching behavior in response to histamine or chloroquine.<\/p>

图1 脊髓–臂旁核环路参与痒觉信息传递(根据参考文献[29]修改)
Fig.1 Functional role of spino-parabrachial pathway in itch processing (modified from reference [29])<\/p>



我们采用了两种方法研究臂旁核在痒觉抓挠 行为中的作用。第一种是采用药理遗传学整体抑制 臂旁核细胞活性, 第二种是利用Cre-Loxp系统敲除 臂旁核Vglut2阻断臂旁核的兴奋性突触输出。<\/span>

我们首先使用药理遗传学整体抑制臂旁核, 研 究其在痒觉中的作用。我们向小鼠双侧臂旁核注射 AAV-hM4Di-mCitrine病毒或者AAV-EGFP对照病毒 (图1F)。hM4Di改造自毒蕈碱型乙酰胆碱受体(the human muscarinic acetylcholine receptor, mAchRs) 亚型M4[33]。改造后的对应配体是氯氮平-N-氧化物 (clozapine N-oxide, CNO)。小鼠本身不含有这种化 合物, 当我们给予小鼠CNO后可以激活hM4Di以及 它所偶联的Gi信号通路, 导致神经元被抑制。我们发现整体抑制臂旁核活性后, 无论是注射组胺、氯 喹, 还是蛙皮素(bombesin)引起的急性抓挠行为都有 明显降低(图1G), 这说明臂旁核对组胺依赖以及非 组胺依赖类型的痒觉抓挠行为都是必要的。在组胺 模型中, 这种抓挠行为降低程度更明显, 这与之前的 c-Fos在组胺模型中表达更多相一致。<\/span>

臂旁核中主要的细胞类型是谷氨酸能兴奋性神 经元, 而且谷氨酸能神经元在痒觉诱发的抓挠行为中 被激活。我们推测, 谷氨酸能神经元是参与痒觉信 息传递的主要细胞类型。臂旁核中的谷氨酸能兴奋 性神经元主要表达2型囊泡谷氨酸转运蛋白(vesicular glutamate transporter 2, VGLUT2), 囊泡谷氨酸转运蛋 白的主要作用是将谷氨酸运输到囊泡。敲除Vglut2 基因可以阻断臂旁核的突触传递[17]。我们向Vglut2f/f 小鼠的双侧臂旁核注射编码Cre重组酶的AAV(adenoassociated virus)病毒, 在Cre重组酶表达后, 会将Vglut2 的第2个外显子敲除。我们通过光遗传学与脑片电生 理记录结合的方法验证了敲除Vglut2后, 臂旁核到中 央杏仁核的兴奋性突触传递被阻断。<\/span>

我们发现, 敲除臂旁核中的Vglut2后, 小鼠 对组胺依赖类型致痒剂(组胺、compound 48/80、 HTMT、clobenpropit)、非组胺类型致痒剂(氯喹、 5-HT、ET-1)以及鞘内注射蛙皮素引起的抓挠行为 都有显著的降低。这说明, 臂旁核中谷氨酸能神经 元参与多种急性痒觉。不同于急性痒模型, 过敏性 痒或者慢性痒可能存在皮肤组织损伤, 引起痒觉环 路敏化, 是临床常见的瘙痒症状[34-35]。在过敏性痒 模型中, 我们发现, 阻断臂旁核的兴奋性突触传递能 够减少过敏原引起的抓挠。在DNFB(1-Fluoro-2,4- dinitrobenzene)慢性痒模型中, 阻断臂旁核的兴奋性 突触传递可以减少DNFB引起的急性和慢性痒觉抓 挠行为。这部分结果提示, 臂旁核参与过敏性和慢 性痒觉过程, 这为治疗慢性瘙痒疾病提供了一个新 的方向。<\/span>

4 总结与展望<\/strong>

我们的研究表明, 脊髓中痒觉特异的GRPR+神 经元通过脊髓投射神经元间接地将痒觉信息传入大 脑臂旁核(图2)。脊髓–臂旁核环路在痒觉信息处理 中发挥重要作用。此外, 臂旁核是痒觉信息处理的 关键脑区。该研究为进一步解析中枢神经系统中痒 觉信息处理环路提供了基础。<\/span>

关于痒觉信息的传递还有若干问题没有解决, 有待深入研究。第一个问题是脊髓到臂旁核的双侧 投射的功能是否有区别; 第二个问题是臂旁核是否参 与痒觉相关情绪成分的处理; 第三个问题是脊髓丘脑 束在痒觉中的功能是什么; 第四个问题是脊髓投射神 经元中是否存在特异传递痒觉的神经元。<\/span>


<\/p>

<\/p>

脊髓中介导痒觉信息的GRPR+神经元通过兴奋性突触将痒觉信息传递给脊髓投射到臂旁核的神经元, 再由这些兴奋性投射神经元传递到臂旁 核脑区。 Itch-mediating spinal neurons, which express the gastrin-releasing peptide receptor (GRPR), are disynaptically connected to the parabrachial nucleus (PBN) via glutamatergic spinal projection neurons (PN).<\/p>

图2 痒觉信息从脊髓到大脑传递通路示意图(根据文献[29]修改)
Fig.2 Schematic showing a central neural circuit critical for itch signal processing (modified from reference [29])<\/p>



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参考文献 (References)<\/strong>
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孙衍刚, 中国科学院神经科学研究所研究员、博士生导师, 中国科学院脑 科学与智能技术卓越创新中心青年骨干。孙衍刚博士多年来从事痒觉的分子、细胞和神经环路机制研究。他的研究发现痒觉特异基因, 揭示痒觉信息处理的神经环路, 阐明了丘脑神经环路突触传递的调节机制。孙衍刚博士实验室主要致力于解析中枢神经系统中痒觉信息处理的神经环路机制, 并阐明中枢神经系统对痒觉调控的机理。<\/span><\/p>","cshort2":"

孙衍刚, 中国科学院神经科学研究所研究员、博士生导师, 中国科学院脑 科学与智能技术卓越创新中心青年骨干。孙衍刚博士多年来从事痒觉的 分子、细胞和神经环路机制研究。他的研究发现痒觉特异基因, 揭示痒觉信息处理的神经环路, 阐明了丘脑神经环路突触传递的调节机制。孙衍刚博士实验室主要致力于解析中枢神经系统中痒觉信息处理的神经环 路机制, 并阐明中枢神经系统对痒觉调控的机理。现已经以第一作者或 通讯作者身份在Nature、Science、J Neurosci等杂志发表研究论文26篇。<\/span><\/p>","ctitle":"痒觉的中枢环路机制","listseq":52,"seqno":"8","status":"1","uploader":"admin","uploadtime":"22-09-26-11-06-33-706"},{"caddress1":"(中国科学院上海巴斯德研究所, 中国科学院分子病毒与免疫重点实验室, 上海 200031)","cauthor":"颜 雨 王雪松 黄 忠* 钟 劲*","cintpic":"","clicktime":344,"clong1":"

1 开发丙肝病毒预防性疫苗的迫切需求<\/strong><\/p>

丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染引发, 是危害公共健康的重大传染性疾病。约70%的患者感染HCV后不能自发清除, 导致持续终身的慢性化感染[1-2]。据世界卫生组织最新统计, 截至2017年全球约有7 100万HCV慢性感染者。我国缺乏可靠的丙肝流调数据, 保守估计至少有1 000万丙肝患者。HCV是黄病毒科丙型肝炎病毒属的正链RNA病毒, 基因组含一个开放阅读框, 全长9.6 Kb 。该阅读框编码病毒多聚蛋白体, 切割后产生core、E1、E2三个结构蛋白和p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B七个非结构蛋白。干扰素加利巴韦林是丙肝的传统疗法, 但疗效有限, 对不同病毒基因型的效果差异很大, 且治疗时间长、副作用较大。2011年后, 丙肝治疗进入直接抗病毒药物(direct-acting antiviral agents, DAA)时代。这类DAA药物的作用靶点是病毒蛋白NS3/4A、NS5A以及NS5B, 治愈率达90%以上, 而且副作用小, 对多种病毒基因型有效[3]。但DAA的治疗成本高, 一个12周的标准疗程在美国费用为7~15万美元, 即使在中国也超过5万人民币。DAA药物的价格因素极大限制了其在全球范围内尤其是低收入国家和地区丙肝治疗中的应用, 而这些国家和地区往往是全球丙肝流行高发区域。<\/p>

HCV主要的传播方式包括血液传播、性接触传播、注射吸毒传播和母婴传播等。尽管DAA药物能够治愈丙肝, 各种旨在阻断丙肝传播的预防措施也逐渐完善, 但近年来新发HCV感染病例仍在增加。据估计, 从2010到2015年美国HCV发病率增加了294%[4-5]。目前注射毒品是HCV新发感染最主要的危险因素。来自不同地区的报告显示, 在过去10年中，由于注射吸毒和针头共享的不断升级, 美国年轻群体中的HCV感染病例增加了一倍左右[6-8]。在中国, 有48%~95%的注射吸毒者被查出感染HCV[9-10]。注射吸毒者等高危群体存在极高的反复感染风险。即使所有感染者都能在首次感染之后得到即时的发现和治愈, 也并不能减小他们在治愈之后被再次感染的几率。这些反复再感染患者的DAA治疗将增加病毒产生抗药突变的概率, 最终有可能促成耐药株的出现。另一个问题是, HCV感染后症状极其轻微、缺乏有效的HCV筛查机制, 导致HCV感染者中极低的知情率和治疗率。据报道, 高危人群中存在大量的无症状HCV感染者[11]。保守估计, 在慢性丙型肝炎患者中, 只有不到30%的人最终意识到自己被感染，而只有大约10%的患者能够最终接受治疗[12-14]。因此, 即使新的抗病毒药物治愈率极高, 每年仍会有大量的感染者被排除在治疗之外, 在高危人群中尤其如此。大量患者很可能在不知情的情况下发展成为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。此时, 即使能够通过DAA药物治疗清除病毒, 但已经造成的肝脏损伤往往难以挽回。因此通过预防性疫苗接种高危人群来控制新发或反复感染将是成本最低、效果最好的解决方法。<\/p>

此外, 不少国家还存在经由不安全的医疗手段感染HCV的情况, 例如外科手术、透析和内窥镜等介入式的治疗。因此对经常接触HCV样品和相关患者的医护人员的保护也是一个值得关注的问题。总之, 沉重的治疗成本负担、高危人群反复感染的存在、耐药突变的可能性、病毒感染筛查率低等因素都预示着仅靠DAA药物治疗仍难以消除HCV对人类健康威胁。而一种高效的针对HCV的预防性疫苗不论从经济性还是可操作性上来讲, 无疑都是完成这一目标最好的选择。<\/p>

2 开发丙肝病毒预防性疫苗的可行性<\/strong><\/p>

大约30%的HCV感染者能够在急性感染期依靠自身免疫系统的作用自发清除病毒, 产生的免疫记忆还能在一定程度上保护机体免受二次感染。有报道显示, 与初次感染相比, 被HCV再次感染的黑猩猩虽然仍会出现病毒血症, 但其持续时间和峰值强度均远小于初次感染, 这种情况即便在两次感染相隔数年仍然存在[15]。在注射吸毒者中进行的调查研究也显示, 80%的HCV初次感染者将会发展为持续感染, 而在自发清除后再次感染的人群中, 只有20%会发展为慢性感染[16-17]。研究表明, 针对HCV包膜蛋白的广谱中和抗体的迅速诱导与病毒在急性期的清除和对再感染的保护有关[17-20]。同时, HCV特异性CD4+辅助性T细胞或CD8+细胞毒性T细胞反应的激活也与HCV的自发清除有关[21-26]。对于体液免疫和细胞免疫在抵抗HCV感染中的作用, 有报道认为, 体液免疫主要影响急性期HCV的清除, 如果机体不能在感染早期产生高滴度的广谱中和抗体清除病毒, 一旦进入感染后期, 中和抗体的作用就会非常有限[27]。而这个阶段HCV的清除则主要由T细胞免疫完成, 尤其是CD8+ T细胞免疫。病毒感染的慢性期往往伴随HCV特异性T细胞的耗竭(T cell exhaustion), 导致病毒清除失败[27-28]。<\/p>

这些研究结果表明, HCV感染过程中存在自然免疫, 这意味着通过疫苗接种保护机体对抗HCV感染是可能实现的, 并且这种保护效果可能在机体中长期持续存在。如果能够通过特定方式诱导机体产生出比自然感染中更强有效的免疫反应, 则很有可能达到预防HCV感染的效果。<\/p>

3 HCV预防性疫苗开发的主要难点<\/strong><\/p>

目前已有针对甲肝病毒(hepatitis A virus, HAV)、乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)和戊肝病毒(hepatitis E virus, HEV)的预防性疫苗。甲肝疫苗为灭活病毒疫苗, 乙肝疫苗抗原为病毒表面蛋白, 分别于1986年和1995年在美国获得上市许可。戊肝疫苗抗原为病毒衣壳蛋白, 于2012年在中国获得上市许可[29]。与此相对, HCV的预防性疫苗迟迟没有出现。<\/p>

其中一个重要原因是, HCV基因组的多变性。HCV编码的RNA依赖性RNA聚合酶缺乏校正功能、错配率高, 因此, HCV表现出极高的遗传多样性, 存在7种不同的基因型和多达67种亚型, 基因型之间的核苷酸差异度高为30%~35%[30]。与此相比, HBV不同基因型之间的差异在8%左右[31]。已上市的HAV、HBV、HEV预防性疫苗均为单价疫苗, 能有效预防病毒所有基因型的感染。考虑到HCV基因组的多变性, 一方面要寻找保守的病毒表位作为疫苗靶点, 另一方面需要发展多价的HCV疫苗, 以期覆盖差异极大的不同基因型。<\/p>

长久以来, 有效的体内和体外评价模型的缺乏也制约着HCV疫苗的研发。2003年, HCV假病毒模型(HCV pseudoparticles, HCVpp)建立才使得体外中和实验成为可能[32-33]。与HCV真病毒不同的是, HCVpp病毒颗粒表面不结合脂蛋白, 更容易被抗体中和, 因此不能完全模拟HCV真病毒进入细胞的真实情况。2005年, 研究者利用一株高效复制的2a基因型病毒株JFH1建立了HCV细胞感染模型(HCV produced from cell culture, HCVcc)[34-36]。HCVcc病毒颗粒表面结合有脂蛋白, 用其来评价疫苗免疫后的中和抗体反应更为真实。研究者利用JFH1的非结构蛋白区, 嵌合其他基因型病毒的结构蛋白区, 陆续建立了1-7型的HCV感染细胞模型[37], 为广谱中和抗体的评价提供了重要工具。<\/p>

长久以来, 黑猩猩是人以外唯一的HCV感染模型[38-39]。然而由于动物伦理的争议, 2013年美国国立卫生院宣布停止使用黑猩猩作为实验动物[40]。人肝细胞的嵌合小鼠模型[41-42], 由于其免疫系统的缺陷, 不能产生正常的体液免疫反应, 因此也无法作为疫苗评价的有效体内模型。目前, 唯一可用做主动免疫保护实验的HCV动物模型是含有人源HCV受体的转基因小鼠模型[41-43]。然而, 该小鼠HCV感染能力仍然有限, 即使通过含有Cre-LoxP系统放大感染检测指标信号, 作为评价多价疫苗诱导的广谱中和反应的动物模型仍不够稳定。有效动物攻毒模型的限制很大程度上制约了HCV疫苗的评价和发展。<\/p>

4 现有HCV预防性疫苗开发的主要策略<\/strong><\/p>

HCV疫苗研发主要有两类策略: 一是侧重于体液免疫, 主要致力于诱导广谱中和抗体, 保护机体免受HCV感染; 二是侧重于细胞免疫, 主要致力于诱导T细胞反应, 用于清除已感染成功的病毒。下面就这些疫苗研发策略进行阐述。<\/p>

灭活及减毒疫苗由于其免疫原性强、设计简单, 在许多病毒感染疾病的预防中都达到了很好的效果, 例如流感、乙型脑炎等。但过去二十余年, 针对HCV的灭活或减毒疫苗开发却一直没有成功的先例。即使在2005年HCV细胞培养模型建立之后[34-36], 灭活和减毒疫苗研发进展仍然不大, 这主要是由于细胞培养获取的病毒颗粒产量很低。最近, 来自日本的研究团队尝试开发了HCV的灭活疫苗[44-45], 利用细胞培养系统生产2a基因型病毒颗粒, 纯化灭活后用于免疫动物, 发现能够诱导体液免疫, 可中和1、2、3基因型病毒, 也能诱导一定的T细胞应答。但是鉴于病毒产量低、浓缩纯化程序复杂、生产成本高, 难以扩大到商业生产的规模。<\/p>

要阻止病毒感染细胞, 一个比较理想的选择就是刺激宿主免疫系统产生针对病毒包膜蛋白的抗体, 在病毒进入细胞之前捕获病毒颗粒, 阻止其与受体的结合。许多旨在预防HCV感染的B细胞疫苗多是基于这一思路, 选择能够有效诱导广谱中和抗体的免疫原进行疫苗设计。例如, 原美国Chiron公司(后被诺华公司收购)开发的来源于1a基因型的重组E1/E2包膜蛋白疫苗, 与MF59佐剂结合免疫后能在豚鼠和黑猩猩中引起较强的体液免疫反应[46-47]。该疫苗免疫豚鼠后的血清具有对1a、1b和2a基因型的HCV假病毒颗粒(HCVpp)的中和作用, 其中对1a、1b型的中和作用效果要好于2a型[46]。此外, 该疫苗免疫黑猩猩后能诱导出针对1a、4a、5a、6a基因型HCVpp/HCVcc的中和抗体, 但对2a、3a型的中和效果较差[48]。该疫苗于2005年完成一期临床试验(NCT00500747)[49], 但没有进入二期临床。此外，2017年来自澳大利亚的研究团队研发了删除了高变区的E2蛋白疫苗，发现该E2抗原的多聚体形式能够在豚鼠体内产生广谱中和抗体[50]。<\/p>

进入临床阶段的另外两种HCV预防性疫苗Ad6-Nsmut/AdCh3-Nsmut和MVA-NSmut/AdCh3-NSmut是基于细胞免疫反应策略。这两种疫苗均表达相对保守的HCV非结构蛋白NS3-NS5B，不同之处是使用了不同的疫苗表达病毒载体。前者三次免疫分别使用人类腺病毒Ad6或黑猩猩腺病毒AdCh3作为载体, 后者两次免疫则分别使用修饰后的痘病毒安卡拉株MVA及黑猩猩腺病毒AdCh3作为载体。这两种疫苗能够在黑猩猩和人体内诱导出较强的CD8+ T细胞反应, 也能促进多功能T细胞和长期记忆T细胞的产生[51-53]。前者已于2011年2月完成一期临床试验, 但目前没有进入二期试验。后者正在进行I/II期临床试验, 预计在2018年完成。<\/p>

5 基于昆虫表达系统的多价亚单位疫苗开发<\/strong><\/p>

HCV包膜糖蛋白E1和E2形成二聚体, 其中E2与HCV受体分子直接结合，而且病毒的中和表位大部分均位于E2上，因此E2是疫苗抗原设计的重要靶点。我们将1b基因型Con1毒株的E2羧基端跨膜区域删除，产生一个易表达、可溶性E2蛋白(sE2)[54-55]。考虑到E2上高度糖基化对于中和表位的遮盖作用, 我们采用果蝇S2系统表达sE2。得益于昆虫细胞相对独特的糖基化方式, S2系统表达后纯化的Con1-sE2蛋白在免疫小鼠后, 能产生比哺乳动物细胞表达的sE2更强的中和抗体反应[54-55]。同时, Con1-sE2蛋白在恒河猴中也能诱导出针对多种HCV基因型的中和抗体[54-55]。通过分析病毒基因型中和谱, 我们发现, Con1-sE2疫苗诱导的抗体对于1a、3a等株型的中和作用仍存在提升的空间。考虑到HCV基因型在世界范围内的分布情况, 我们在最新的研究中补充了来自1a型H77株和3a型S52株的sE2蛋白, 与来自1b型Con1株的sE2一起组合成三价亚单位疫苗[56]。该三价疫苗所包含的抗原基因型涵盖了世界上近70%的主要HCV流行株型。<\/p>

研究发现, 与三个单价sE2苗相比, 三价苗显著提升了小鼠免疫血清对于囊括世界上最为流行的1a型(H77)、1b型(Con1)、2a型(JFH-1)和3a型(S52)病毒的中和效价，同时对其他亚型毒株也有较好的中和效果。进一步研究发现, 三价疫苗中的每个sE2抗原可诱导出独特的多克隆中和抗体谱, 这些抗体的集合对部分病毒株的中和产生明显的协同作用。此外, 该三价苗在恒河猴中诱导出的中和抗体的效价和广谱性不但优于单价苗, 而且在遗传背景差异较大的恒河猴个体间的均一性更好。同时, 三价苗还在恒河猴体内诱导出HCV特异性T细胞免疫反应。这些研究结果表明, 我们研发的sE2三价亚单位疫苗具有产量高、单体组分间无优势表位竞争干扰、能诱导协同效应的广谱性中和抗体等优势。这些结果为未来多价苗的研发及疫苗产业化奠定了重要基础。<\/p>

6 展望<\/strong><\/p>

我们的研究结果表明, 昆虫细胞表达的sE2抗原的免疫原性强, 是一个理想的HCV候选疫苗, 其产量高、易纯化等在制备环节上的优势克服了研发多价sE2抗原疫苗的技术屏障。包含1a型、1b型和3a型sE2抗原的三价苗诱导出更加广谱、更加均一的中和抗体, 展现了较好的商业开发前景。在此三价苗基础上, 还可以进行其他基因型sE2的添加或置换, 以获得中和活性覆盖范围更广的多价HCV疫苗。此外, 最理想的HCV疫苗是同时诱导强有效的广谱中和抗体和T细胞免疫反应, 这也将是未来的发展方向之一。<\/p>

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钟劲, 中国科学院上海巴斯德研究所研究员、博士生导师, 中国科学院特聘研究员, 上海科技大学特聘教授。1994年获四川大学学士学位, 1997年获北京大学硕士学位, 2003年获美国德克萨斯大学博士学位, 美国Scripps研究所博士后。2006年12月加入中国科学院上海巴斯德研究所, 任病毒性肝炎研究组组长(PI)。共发表SCI论文70余篇。<\/span><\/p>","cshort2":"
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钟劲，中国科学院上海巴斯德研究所研究员、博士生导师，中国科学院特聘研究员，上海科技大学特聘教授。1994年获四川大学学士学位，1997年获北京大学硕士学位，2003年获美国德克萨斯大学博士学位，美国Scripps研究所博士后。2006年12月加入中国科学院上海巴斯德研究所, 任病毒性肝炎研究组组长（PI）。钟劲研究员主要从事丙型肝炎病毒（HCV）和RNA病毒的研究，围绕HCV新型细胞感染模型的建立、HCV诱导调控宿主固有免疫应答的机制研究、以及HCV复制和组装上的机制研究、HCV疫苗研发等方面取得了重要进展。建立了世界上第一个HCV的细胞感染模型，为HCV研究领域的发展做出了重要贡献，该项工作被Faculty of 1000给以最高等级的评价，发表以来被引用次数超过千次。共发表SCI论文70余篇。获得中科院“优秀研究生指导教师”奖、中科院“朱李月华”优秀教师奖、法国驻沪领馆法国创新人才奖等。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>
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黄忠，中国科学院上海巴斯德研究所研究员。1997年毕业于中国农业大学，获博士学位。1998-2002年，美国Boyce Thompson研究所博士后。2002-2008年，在美国亚利桑那州立大学先后任职高级研究助理、研究助理教授。2009年1月加入中国科学院上海巴斯德研究所，建立疫苗学与抗病毒策略课题组，任课题组长、研究员。黄忠研究员主要从事抗病毒基因工程疫苗及抗体的应用基础研究。黄忠研究组现已建立多种基因工程疫苗及抗体研发平台，开展基于结构的疫苗理性设计及抗体优化，在PLoS Pathogens、J Virol、Vaccine等刊物发表研究论文40余篇，获得相关发明专利授权4项，有多项科研成果实现转移转化。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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1 线粒体呼吸链的研究背景<\/strong><\/p>

线粒体几乎参与了细胞内所有的生命活动, 包括呼吸作用、细胞分裂、细胞衰老、细胞凋亡、甚至癌症发生等, 但其中最为重要的则是呼吸作用。呼吸作用是生物体内最基础的能量代谢活动, 由位于线粒体内膜上的四种呼吸链蛋白复合物分步完成, 这四种蛋白复合物分别为复合物I(NADH脱氢酶)、复合物II(琥珀酸脱氢酶)、复合物III(细胞色素c还原酶)和复合物IV(细胞色素c氧化酶)[1-2]。以这些复合物为基础, 可以聚合形成多层次的呼吸链超级复合物乃至超超级复合物, 从而获得更高的稳定性和更高的能量转换效率。对线粒体呼吸链的研究至今已有100多年的历史, 包括其组成成分、组织形式、组装过程、电子传递机制、能量转换方式、致病机理等方方面面。20世纪初, 科学家基本鉴定出线粒体呼吸链上所有进行电子传递的辅基, 并且确定了这些辅基在呼吸链上的排列顺序, 它们包括:NADH、FAD、FMN、Fe-S中心、泛醌、Cu中心以及细胞色素a、a3、bH、bL、c、c1。到20世纪60年代,科学家们确定呼吸链由五种大分子蛋白复合物机器组成, 每一种复合物执行呼吸作用的一部分过程[3]。1961年, Peter Mitchell提出了化学渗透假说, 预测了四种蛋白质复合物在传递电子的过程中会将质子由线粒体基质泵入线粒体膜间隙, 这个过程中所形成的质子电化学梯度导致质子回流驱动复合物V(ATP合成酶)合成高能分子ATP[4]。后续的一系列实验逐步证实了这一假说, 其中最为重要的是1994年John Walker解析牛源ATP合成酶的晶体结构, 其利用质子回流产生的能量使头部旋转以合成ATP的机制与化学渗透假说相吻合[5]。<\/p>

随着X射线晶体学的发展, 哺乳动物复合物II-IV的晶体结构相继被解析。1995年到2003年, 从原核生物到哺乳动物CIV的完整结构被逐步确定,CIV的功能机理也逐渐清晰[6-7]。1997年到2002年,单独的复合物III与结合了各类抑制剂的复合物III的晶体结构相继被解析, 多种关于复合物III功能机理的模型也相继出现[8]。2003年, Yankovskaya等[9]解析了原核生物复合物II的晶体结构。2005年, 我国著名结构生物学家饶子和实验室[10]解析了首个猪心来源的线粒体复合物II的高分辨率晶体结构, 阐明了复合物II中电子传递的通路。2006年到2013年,Sazanov等[11]逐步解析了原核生物中复合物I的完整晶体结构, 揭示了复合物I传递电子和转运质子的核心功能。但是, 与功能相对简单、只有14个核心蛋白亚基的原核生物复合物I相比, 哺乳动物的复合物I含有44种蛋白、45个亚基, 难以纯化、结晶。2014年,Hirst等[11]通过冷冻电镜的方法首次解析了5埃哺乳动物复合物I的中等分辨率的结构, 让我们首次看到了哺乳动物复合物I的完整构象。我们研究组2016年以猪心为实验原材料, 终于成功获得了目前为止哺乳动物复合物I分辨率最高的近原子分辨率的完整电镜结构[12]。此外, 我们实验室还在2012年首次报道了酵母来源的II-型复合物I高分辨率晶体结构并验证了其电子传递机制[13-14]。 此外, 在解析的疟原虫NDH-2的结构基础上设计、开发了一种可以在体内外有效杀死耐药性疟原虫的药物前体分子[15],为开发新一代的抗疟药物打下了良好的基础。根据这些已经解析的呼吸链复合物的结构, 科学家们预测了电子传递的通路以及质子转运的机制, 其中一些理论已经被后续生化实验所证实, 但仍有一些理论存在争议。另外, 由于当时认知水平的局限性, 大多数理论都在描述单独的呼吸链复合物的功能机制, 这并不符合生物体内的实际情况。随着实验证据的不断发现, 呼吸链超级复合物的存在逐步得到科学家们的认可[16]。<\/p>

2 线粒体呼吸链的层级组织形式<\/strong><\/p>

2000年, Schägger等[17]抽提牛心来源的线粒体上的膜蛋白, 通过BN-PAGE这一新型电泳手段检测到了复合物I到IV更高级的组合形式, 即超级复合物。后续的实验发现, 线粒体内几乎全部的复合物I、大部分的复合物III(超过60%)以及15%~20%的复合物IV是存在于超级复合物中的。在超级复合物中, 复合物单体的数量可以发生变化, 以形成不同组合形式的超级复合物。由于物种来源的不同,超级复合物的组成形式差异也很大。比如, 酵母中最主要的形式为III2IV1, 土豆微管组织中的存在有I1III2, 牛心中主要是I1III2IV1, 而小鼠肝脏中则存在I1II1III2IV1。甚至在同一个物种中, 正常的生理条件下也同样存在不同组成形式的超级复合物。高等哺乳动物中, 最为常见的组成形式为I1III2IV1, 即呼吸体(respirasome)[17]。而我们近年来的实验逐步证明,以上这些实验结果并不可靠, 极有可能是因为实验操作人员所用抽提溶液不对导致的线粒体复合物被人为的打开了。<\/p>

在超级复合物的发现之初, 许多科学家质疑其是否实验技术局限所导致的假象。直到2008年,Enriquez[9]通过测定电子供体消耗和氧气消耗的方法验证了超级复合物的呼吸活性, “呼吸体”的概念才被大家广泛接受。具有完整的呼吸活性(消耗电子供体和氧气产生水)的呼吸链超级复合物被称为呼吸体。<\/p>

组合形式不同的超级复合物所适应的代谢通路也不尽相同。比如, 最主要的呼吸体形式I1III2IV1只能完成NADH的氧化, 而NADH主要是葡萄糖代谢的产物; 超级复合物III2IV1则不同, 它可以接受来自复合物II的辅酶Q, 进而完成FADH的氧化, 而FADH则是琥珀酸盐以及3-磷酸甘油的代谢产物。不同组成形式的超级复合物在线粒体上的存在比例会随着细胞状态的变化而不断调整, 以满足细胞不同生长状态下特定的能量需求[18]。<\/p>

现在的理论认为, 在正常的生理条件下, 多种超级复合物, 甚至是单独的复合物I~IV都是有生理活性的。也就是说, 虽然形成超级复合物可以有效地提高能量代谢效率, 但并不是所有单独的复合物都会相互结合形成超级复合物, 而是单独的呼吸复合物与各类超级复合物之间处于动态平衡当中, 以适应不同生理状态下细胞能量代谢的特定需求。这一描述线粒体内膜上呼吸链蛋白质复合物组织形式的模型被称为动态模型[1]。<\/p>

2016年9月, 我们课题组在《自然》杂志发表研究长文, 首次获得了哺乳动物呼吸体3.97~5.40埃的中高分辨结构[16], 并于同年12月在《细胞》杂志上发文, 解析了哺乳动物呼吸体整体4.0埃、局部3.6埃的高分辨率结构[12]。我们的结构对超级复合物存在以及底物通道理论提供了有力的证据。随着研究工作的不断深入, 我们发现了呼吸体并不是呼吸链复合物最高级的组织形式, 在正常的生理条件下, 一些这些复合物之间的聚合程度甚至可以更高, 我们称之为超超级复合物(I2III2IV2), 这一成果发表在2017年9月份的《细胞》杂志上[19]。<\/p>

3 超超级复合物的结构介绍<\/strong><\/p>

高等生物线粒体呼吸链由四种基础的蛋白复合物构成, 它们分别包含44种(45个蛋白亚基)蛋白亚基的复合物I(NADH脱氢酶)、4种蛋白亚基的复合物II(琥珀酸脱氢酶)、11种蛋白亚基的复合物III(细胞色素c还原酶)和15种蛋白亚基的复合物IV(细胞色素c氧化酶)。此外, 这些复合物中还含有众多的电子传递辅基。我们研究组首次从体外培养的人类细胞中纯化得到了一类超超级复合物I2III2IV2, 它是由2个复合物I、1个复合物III的二聚体、2个复合物IV和2个细胞色素c蛋白组成的超大膜蛋白分子机器, 含有包括88个膜蛋白在内的142个蛋白亚基(70种不同蛋白分子), 分子量高达2.7兆道尔顿[19]。<\/p>

超超级复合物中的6个复合物单体共包含238个跨膜螺旋, 这些跨膜螺旋在线粒体内膜上处于同一曲面上, 形成1个盘状的结构。2个L状的复合物I环绕在超超级复合物外围, 中间包含着1个复合物III的二聚体。在复合物I的尾部各有1个复合物IV, 与复合物I及中间的复合物III有相互作用, 而与另一个复合物I有所间隔。通过计算机模拟, 我们发现, 这一间隔与复合物II的结构可以很好地吻合, 所以不排除纯化过程中复合物II掉落或者计算过程中复合物II的电子密度被平均掉的可能性[19](图1)。我们以此模型构建出了完整的高等生物线粒体呼吸链超超级复合物I2II2III2IV2的模型, 此模型可以形成一个闭合环, 从而将所有呼吸链电子传递链蛋白复合物整合在了一起。复合物I由跨膜臂和位于线粒体基质的亲水臂两部分组成。在亲水臂中, 1个FMN分子, 1个NADPH分子, 8个FeS簇和1个锌离子被鉴定出来,发挥电子传递的功能, 在跨膜臂中鉴定出11个磷脂分子位于蛋白亚基相互作用或者发生构象变化的关键位点。在复合物III中, 共有12个磷脂分子和6个卟啉环分子被发现, 而在复合物IV中则发现了2个卟啉环分子。根据这些卟啉环分子的位置以及其周围氨基酸残基的分布情况, 我们可以推测出电子传递的可能通路[19]。<\/p>


左图上, 人源线粒体呼吸链超超级复合物结构模型; 左图下, 线粒体膜间隙一侧, 复合物III和IV中细胞色素c结合位点。右图上, 线粒体呼吸链复合物完整聚合形式预测模型I2II2III2IV2; 右图下, 线粒体膜间隙一侧, 细胞色素c参与电子传递时在复合物III和IV之间的运动路径。Megacomplex: 超超级复合物; M: 线粒体基质; IM: 线粒体内膜; IMS: 线粒体膜间隙; CI: 复合物I; CII: 复合物II; CIII: 复合物III; CIV: 复合物IV; Cyt.c: 细胞色素c。
Left column: cartoon model of human megacomplex I2III2IV2 structure on the top and circular arrangement viewed from intermembrane space side showing Cyt.c sites in the bottom; Right column: predicted complete electron transport chain complex I2II2III2IV2 on the topand circular arrangement viewed from intermembrane space side showing electron trace in the bottom. M: Matrix; IM: inner membrane; IMS: intermembrane space; CI: complex I; CII: complex II; CIII: complex III; CIV: complex IV; Cyt.c: cytochrome C.
图1 人源呼吸链超超级复合物整体结构
Fig.1 Human mitochondrial megacomplexes<\/p>

4 人源呼吸链超超级复合物结构解析的重大意义<\/strong><\/p>

一百多年来, 对线粒体呼吸链的研究一直都是国际生命科学领域的热点之一。彼得· 米切尔(Peter D. Mitchell)曾于1978年因提出线粒体呼吸链的化学渗透假说而获得了诺贝尔化学奖; 1997年英国著名结构生物学家约翰· 沃克(John E. Walker)因对线粒体复合物V(ATP合成酶)的结构生物学研究而获得诺贝尔化学奖。我们研究组首次获得了来源于体外培养的人源细胞的呼吸链蛋白复合物样品, 并且运用冷冻电镜三维重构的方法首次成功解析了比呼吸体更高聚集形式的呼吸链超超级复合物的三维结构, 证明了线粒体呼吸链复合物存在更高级的组成形式, 为此前一直处于各种猜想阶段的最高级线粒体呼吸链复合物组织形式的存在提供了直接的证据, 是该研究领域的一项重大研究突破[20-22]。<\/p>

在近60年的研究中, 高等生物线粒体呼吸链蛋白纯化均来自于新鲜的活体动物心脏组织, 由于人源心脏的来源困难, 所以人源线粒体呼吸链蛋白复合物的结构一直没有得到解析。在经过大量的、长期的实验条件摸索之后, 我们成功地从体外培养的人源细胞中纯化得到了大量人源呼吸链复合物蛋白样品。这些样品不仅为解析人源呼吸链蛋白提供了必要条件, 同时也为科学家开展相关研究奠定了良好基础。比如, 一直以来线粒体呼吸链蛋白复合物一直被认为是一类很好的药物靶标, 但是科学家却因为无法获得体外纯化的蛋白样品而不能开展其基本的药物筛选工作。随着基因测序成本的大幅降低, 相信在不远的将来, 人人都可能会有一份自己独特的基因图谱, 而一旦发现在呼吸链上某一蛋白上有突变位点, 我们可以很容易地通过其结构信息预测这一突变是否是有害的, 并可以通过基因操作在细胞水平上进行验证。<\/p>

我们的这一系列研究不仅突破性地解析了人源线粒体超级复合物(SCI1III2IV1)的原子分辨率结构, 而且根据结构分析及数据分析, 我们设想了超超级复合物(MCI2III2IV2)的存在, 并通过不断摸索纯化条件最终纯化得到了这一蛋白复合物样品, 解析了目前所知的人源呼吸链蛋白质最高级的组织形式—超超级复合物(MCI2III2IV2)的中高分辨率三维结构[19]。首次解析的人类细胞来源的呼吸链超超级复合物结构, 并且首次获得了目前为止分辨率最高的人源呼吸链复合物I和复合物III的结构, 为深刻理解在这两种复合物上突变所导致的线粒体功能异常所导致的近百种疾病提供了坚实的理论基础。这是继我们阐释了猪源呼吸链超级复合物I1III2IV1(呼吸体)的原子分辨率三维结构之后的又一项重大突破[12]。<\/p>

我们依据最新的结构信息提出了一个区别于经典Q循环理论的更加合理的电子传递理论[12,16,23]。根据Q循环理论, 来自复合物I的还原态辅酶Q首先结合在膜间隙一侧bL附近的Qo位点, 先将一个电子通过c1传递给细胞色素c, 再将另一个电子通过bH传递给基质一侧结合在Qi位点上的氧化态辅酶Q形成一个不稳定的半醌。之后, 第二个来自复合物I的还原态辅酶Q再一次结合在Qo位点, 完成相同的过程,使结合在Qi位点好的半醌得到1个电子成为还原态的辅酶Q。这一过程中, 2个来自复合物I的辅酶Q共传递2个电子给2个细胞色素c完成后续还原氧气的反应, 另外传递2个电子给内膜另一侧的氧化态辅酶Q将其还原。现在看来, 这一过程有诸多不合理之处,包括以下三方面内容。(1)复合物I释放还原态辅酶Q的位点位于基质一侧, 而Qo位点位于膜间隙一侧,这一电子传递过程必须使辅酶Q的极性头部穿过非极性的内膜发生翻转, 本身是一个需要消耗能量的过程。(2)在这一过程中会产生不稳定的半醌, 进而产生活性氧族对蛋白质本身具有破坏作用。(3)这一过程会在Qi位点附近堆积还原态的辅酶Q。由于复合物I与III之间形成一个封闭的Q池, 这将不利于产生于复合物I的辅酶Q向复合物III移动, 进而降低了电子传递的效率。基于我们所解析的结构, 我们提出了一种新的通路。我们认为, 产生于复合物I的还原态辅酶Q直接结合在复合物III的Qi位点上, 这将无需使辅酶Q极性的头部跨膜翻转。还原态辅酶Q的2个电子相继传递给bH, 经由复合物III二聚体的2个bL, 分别传递给2个c1, 最终传递给2个细胞色素c。这一过程中不会产生超氧自由基, 并且具有最高的电子传递效率。目前, 这一理论还处于假设阶段, 需要后续更加精细的生物化学实验进行验证。<\/p>

通过计算机模拟的方法, 我们研究组首次将复合物II的结构嵌入进呼吸链超级复合物的模型之中,由此可以推论在线粒体呼吸链中4个电子传递链蛋白将组合成1个更大的超超级复合物来更高效地发挥功能, 从而将全部4个呼吸链复合物在结构水平统一到了一起, 巧妙地预测了呼吸链复合物全新的完整聚合形式, 为之后的研究提供了一条新的思路。这个超大型复合物MCI2II2III2IV2是能量大分子机器的终极形态[19]。尤其值得一提的是, 在MCI2II2III2IV2结构中, 在靠近每1个复合物II的一侧, 复合物I、复合物III与复合物IV之间, 存在着1个封闭的空腔隔间被称为Q池。它们是辅酶Q来回穿梭于复合物I、II与复合物III的通路。这一封闭的Q池的存在极大地提高了复合物I、II与复合物III之间电子传递的效率, 不仅可以很好地解释以往发现的复合物I和复合物II共同使用同一来源的Q作为底物, 而且还可以很好地解释以前发现的这一系统是如何反向用琥珀酸合成NADH的。在超超级复合物的结构中, 复合物III与复合物IV的细胞色素c结合位点相互靠近, 只有10 nm, 提高了复合物III与复合物IV之间进行电子传递的效率。有意思的是, 在我们解析超超级复合物I2III2IV2结构中, 复合物III的每一个单体上都结合了一个细胞色素c蛋白亚基, 说明两个亚基都参与了电子传递的过程[19]。结构分析表明, 该结合的细胞色素c处于正在结合到可以适合电子传递的位置的状态, 由此, 我们通过结构分析发现了学界争论已久的细胞色素c池的位置。这一发现可以推测, 细胞色素c的池子处于复合物I、复合物III及复合物IV的膜间隙表面, 且以逆时针方向运动。目前所有的教科书中, 均把各个呼吸链复合物作为一个个独立的单元来进行描述, 我们的发现将在未来更好地指导这些教科书的编写。<\/p>

人类线粒体呼吸链系统异常会导致如阿兹海默综合征、帕金森综合征、多发性硬化、少年脊髓型共济失调以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等多种疾病[24-27]。由于人源线粒体呼吸链蛋白复合物的纯化条件极为苛刻、难度系数大, 所以针对这些蛋白的药物筛选一直都很难开展。我们研究组建立的一系列蛋白纯化方法和技术为今后的药物研发打下了良好的基础, 其结构的解析不仅阐明了这些蛋白的作用方式及反应机理, 也为人类攻克线粒体呼吸链系统异常所导致的疾病提供了一个良好的开端。我们今后将对线粒体呼吸链继续进行更加深入的研究,希望获得处于不同反应中间态的呼吸链复合物群的分辨率更高的三维结构, 并将致力于研发治疗线粒体异常疾病的新型靶向药物[19]。<\/p>

5 结语<\/strong><\/p>

生死只在呼吸之间。呼吸是机体最基本的生命活动, 最为平常却十分神秘。针对呼吸作用的研究, 我们研究组目前已经走在了世界前列, 但是许多重要的细节仍在等待未来科学家们通过共同的努力来加以阐述。希望我们的研究能为人类对生命现象的认知作出更大的贡献。<\/p>

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杨茂君, 清华大学生命科学学院教授、博士生导师, 先后在吉林大学和中国协和医科大学获得学士和博士学位, 之后进入美国西南医学研究中心从事博士后研究工作, 2008年进入清华大学任教。<\/span><\/p>","cshort2":"
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杨茂君, 清华大学生命科学学院教授、博士生导师, 先后在吉林大学和中国协和医科大学获得学士和博士学位, 之后进入美国西南医学研究中心从事博士后研究工作, 2008年回国, 进入清华大学任教。自加入清华大学以来, 杨茂君教授紧紧围绕细胞能量代谢系统这一领域开展研究, 特别是在线粒体呼吸链及呼吸链超级复合物的结构、功能及药物前体分子开发等方面取得了一系列重大原创性成果。杨茂君教授研究组首次报道了II-型呼吸链复合物I的结构(Feng et al, Nature, 2012); 解析了目前为止世界上所解析的最复杂的猪源及人源膜蛋白–线粒体超级及超超级复合物的结构等, 为进一步理解哺乳动物及人类呼吸链超级复合物的组织形式、分子机理以及治疗细胞呼吸相关的疾病提供了重要的结构基础(Gu et al, Nature, 2016; Wu et al, Cell, 2016; Guo et al, Cell, 2017)。杨茂君教授先后发表SCI论文54篇, 其中在国际顶级期刊Nature<\/em>(2012、2015、2016)、Cell<\/em>(2016、2017)等杂志发表通讯作者论文26篇。<\/p><\/td><\/tr><\/tbody><\/table>


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