胚胎期造血干细胞发育的分子调控

马东媛 王 璐 薛媛媛 刘 峰*
(中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室, 北京 100101)
 
 

刘峰, 中国科学院动物研究所研究员, 1999年毕业于中国科学院遗传研究 所, 获理学博士学位。2000年至2008年分别在新加坡国立大学、美国范德 堡大学医学院和英国牛津大学分子医学研究所, 利用斑马鱼和非洲爪蟾等 模式动物进行血液和血管发育的基础研究。2009年入选中国科学院“百人 计划”并加入中国科学院动物研究所, 任研究员。刘峰研究员主要从事血 液系统发育研究, 尤其关注血液与心血管干细胞/前体细胞的形成、造血 干细胞命运决定、维持及分化等。刘峰研究组首次阐释RNA甲基化修饰 调控胚胎期造血干细胞发育的分子机制; 证实了Notch信号动态变化的必 要性, 鉴定了多个在造血干细胞命运决定、产生和分化过程中的关键因子, 揭示了微环境的重要作用。现已在Nature、Dev Cell、EMBO J、PNAS、 J Exp Med、Blood、Nat Commun、Cell Res和Development等刊物发表论 文40余篇。其研究成果多次受到国际著名科学家的高度评价并被F1000重 点评述和推荐。刘峰研究员还担任国际斑马鱼学会执行委员、中国动物 学会斑马鱼分会主任委员、发育生物学专业委员会副主任委员兼任秘书 长等社会职务。

 
 
1 造血干细胞研究背景
对于血细胞起源的探究始于二十世纪初期, 然 而直到2010年, 来自荷兰、美国和法国的三个研究 组分别以小鼠和斑马鱼为模型, 才证实造血干细胞 是通过内皮–造血转化过程产生的[1-3]。随后, 调控 该过程的一系列关键转录因子和信号通路陆续被发 现[4-5]。在人、小鼠和斑马鱼等脊椎动物中, 血液发 生是一个保守的生物学过程。胚胎期造血干细胞产 生于主动脉–性腺–中肾区, 随后迁移到胎肝(小鼠和 人)或尾部造血组织(斑马鱼)进行扩增, 进而迁移至 胸腺向淋系细胞分化, 最后迁移至骨髓(小鼠和人) 或肾髓(斑马鱼)以维持终生造血[6]。从分子水平来看, 血液发生是由遗传因素和表观遗传因子协同介导的 一个多步骤、多部位的动态发育过程, 其关键调控 要素既包括转录因子、表观修饰蛋白以及miRNA, 也涉及血液流动、炎性信号和内皮细胞等微环境因 素。在临床恶性血液疾病治疗时, 造血干细胞是骨 髓移植术的核心组分, 然而, 其来源匮乏一直是制约 血液疾病治疗的瓶颈。因此, 探索造血干细胞的体 内发育机制以及建立体外诱导扩增方案便成为当今 科学界的研究热点。

2 胚胎期造血干细胞发育的关键因子
真核生物mRNA的修饰及其功能受到广泛关 注, 其中, N6-甲基腺嘌呤(N6-methyl-ade-nosine, m6A) 依赖的RNA甲基化是最常见、最丰富的修饰形式之 一。近年来, m6A在斑马鱼早期发育、果蝇性别决 定以及T细胞稳态等发育过程中的作用逐渐被揭示, 但其在血液发生中的作用却甚少被报道。我们通过 m6A测序技术、RNA-Seq以及基因敲降或敲除的表 型分析发现, m6A修饰水平下降后, 造血干细胞不能 正常产生, 血管的内皮特性却明显增强; 与此同时, 一系列动脉内皮发育相关的基因表达发生变化, 尤其是notch1a显著升高。单碱基分辨率m6A-miCLIPSeq 以及YTHDF2-RIP-Seq综合分析发现, m6A通过 YTHDF2介导了notch1a的稳定性以维持内皮细胞和 造血细胞基因表达的平衡, 进而调控造血干细胞的 命运决定[7]。特别需要强调的是, Notch信号在血管 和血液发生中是动态变化的; 我们首次通过实验证 实, 造血干细胞发育过程中并不是一直需要Notch信 号, 尤其是在内皮–造血转化过程中, Notch信号需要 下调[8]。除了Gpr183-Arrb1-Nedd4对Notch1的负向调 节, 我们还发现, BLOS2与Notch1结合并介导其进入 内体–溶酶体降解途径, 而转录共抑制子Ncor2通过 Fos-Vegfd调控Notch信号活性, 进而调控造血干细胞 产生或维持[9-11]。

在胚胎期造血干细胞发育过程中, ERK信号也 是剂量依赖的, 并被多因素动态协同调控。内皮细 胞中Smad1/5通过招募HDAC1对ERK的抑制作用有 利于造血干细胞产生, 过量的ERK1/2会使得动脉内 皮特性以及内皮细胞间的紧密连接增强, 导致内皮– 造血细胞的转化过程受到抑制[12]。我们还通过ChIPPCR 、萤光素酶报告系统以及基因敲除后的表型分析 等实验证实, ETS家族转录因子Fev(又称为Pet1)可以 直接结合erk启动子区并调控其表达, 以便维持ERK 的水平, 进而促进造血干细胞产生[13]。此外, Fev还通 过tph2控制5-羟色胺(5-HT)合成, 进而影响5-HT神经 元的分化及维持。在此基础上, 我们发现, Fev/Pet1、 Tph2和AAAD等参与5-HT合成的重要转录因子和合 成酶在AGM区内皮细胞和间充质细胞中均有表达。 在内皮细胞特异性缺失tph2(vec-cre;tph2+/fl)的小鼠胚 胎中, AGM区内皮细胞中的5-HT水平下降, 造血簇大 小和数目显著降低, 造血干细胞发育异常。我们还 意外地发现, 在tph2–/–和pet1-cre;tph2fl/fl胚胎中, AGM 区造血簇数量是正常的。这是因为, Shh-Nkx2.2- Lmx1b-Pet1通路因负反馈调控而上调, ERK信号被激活, 造血干细胞增殖加快, 进而使得完全缺失tph2 的胚胎中造血发育缺陷得到恢复[14]。

在造血干细胞分化阶段, 我们发现, 转录因子 Irf4对淋系细胞的命运决定至关重要。Irf4直接调控 趋化因子受体Ccr9a, 促进淋系细胞归巢; 同时, Irf4 也可以直接抑制pu.1表达, 阻止前体细胞向髓系分 化[15]。转录因子Foxn1通过调节胸腺上皮细胞发育 而为T淋巴细胞分化和成熟提供所需的微环境[16]。 在红细胞成熟阶段, 我们证实, KLF家族的转录因子 klf3和klf6是关键的调控基因[17]。

3 胚胎期造血干细胞发育的微环境

造血干细胞的发育不仅需要内源转录因子和 关键蛋白的精密调控, 同时也受周围环境的影响。 随着发育的进程, 造血干细胞由其产生部位主动脉– 性腺–中肾区域迁移至胎肝或尾部造血组织, 最后到 达骨髓或肾髓, 每个阶段所处的不同微环境都有其 特定的作用。对于造血干细胞而言, 微环境既包括 干细胞周围的其他细胞群体(例如: 内皮细胞、间充 质细胞、成骨及破骨细胞等), 也包含血液流动剪切 力、氧气浓度和温度等一系列生物物理性因素。

研究表明, 血液流动的机械力可以通过一氧化 氮(NO)信号通路促进生血内皮产生造血干细胞[18]。 我们的研究工作进一步揭示, 内皮细胞中存在一个 重要的响应血液流动剪切力的转录因子Klf2a, Klf2a 直接调控一氧化氮合成酶基因的表达, 进而调控NO 在体内的含量。这一发现深入阐释了血液流动调控 造血干细胞产生的新机制[19]。众所周知, 炎性信号 参与机体病理和应激反应; 而在生理状态下, 我们发 现, 炎性信号TLR4-Myd88-NFκB通路对胚胎期造血 干细胞的产生也有重要作用, TLR4缺失导致的造血 缺陷表型是由Notch信号介导的[20]。血管内皮不仅 是造血干细胞的来源, 同时也为造血干细胞的迅速 扩增和分化提供了必要条件。我们利用斑马鱼体外 发育和早期胚胎透明的优势, 实时观察造血干细胞 与血管内皮细胞的相互作用。通过功能实验揭示, 斑马鱼尾部血管内皮细胞是造血干细胞必要的微环 境, 并且通过Klf6a-Ccl21通路有效促进造血干细胞 的扩增[21]。

4 造血干细胞研究展望
综上所述, 基于小鼠和斑马鱼等模式动物的研究基本阐释了脊椎动物血液发生的过程, 并从分子 水平初步揭示了其调控机制, 包括: 重要的转录因 子、表观修饰蛋白、信号通路以及微环境等(图1)。 此后, 随着单细胞测序、高灵敏性染色质免疫共沉 淀(STAR ChIP-seq)、核染色质转座酶可接近性高通 量测序分析(ATAC-seq)、高分辩率全基因组DNaseI 超敏位点测序(liDNase-seq)和全基因组甲基化测序 (WGBS)等高灵敏和高通量测序方法的开发以及基 于CRISPR/Cas或多色荧光的活体示踪技术的应用, 将会帮助科研工作者从更新、更深、更广的角度认 识并研究血液发生过程, 更为精确地阐释该过程的 动态调控及各系细胞的命运决定和谱系分化, 揭示 不同微环境对血液发生各阶段的精密、协同调控。 与此同时, 鉴于造血干细胞在临床血液疾病治疗中 的重要地位与广阔应用前景, 造血干细胞的体外诱 导和扩增仍将是研究热点。更为清晰和准确地认识 内源性和外源性因素的协同调控, 也将有助于促进 体外造血的早日实现。
在胚胎期造血干细胞产生过程中, TLR4-Myd88-NFκB通路、RNA甲基化、Gpr183以及Ncor2通过影响Notch信号进行调控, 同时Fev和BMP信
号通过ERK信号通路调控; 在造血干细胞维持阶段, 血液流动通过调控Klf2a-NO通路、5-HT及Klf6/ccl25b都参与调控造血干细胞维持及扩增;
在血细胞分化阶段, FoxN1及Irf4a参与造血干细胞向淋系分化, 而Klf3/6影响其向红系分化。
TLR4-Myd88-NFκB, RNA methylation, Gpr183 and Ncor2 are involved in HSC specification via Notch signaling, while Fev and BMP regulate ERK signaling in this process. Blood flow regulates HSC maintenance through the Klf2a-NO cascade, whereas 5-HT and Klf6/ccl25b regulate HSC maintenance as well as expansion. Once HSCs are formed, FoxN1 and Irf4a thereby drive them towards lymphoid differentiation, while Klf3/Klf6 regulates erythroid differentiation.
图1 造血干细胞发育的调控网络
Fig.1 The regulatory network of hematopoietic stem cell (HSC) development duringembryogenesis


参考文献 (References)
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