靶向CFLAR改善小鼠和非人灵长类动物的 非酒精性脂肪肝炎

王丕晓1 陈明明1 沈立君1 李红良1,2,3*
(1武汉大学人民医院心血管内科, 武汉 430071; 2武汉大学基础医学院, 武汉 430071; 3武汉大学动物实验中心/ABSL-III实验室, 武汉 430071)
 
 

李红良教授, 武汉大学博士生导师, 国家杰出青年基金获得者、教育部长江学者特 聘教授、科技部中青年科技创新领军人才、国家“万人计划”领军人才、湖北省“百人 计划”特聘专家。2006年在中国协和医科大学获得博士学位。2006年至2008年底先后 受邀到美国哈佛大学医学院、加拿大多伦多大学从事博士后研究工作。现任武汉大学 基础医学院院长、武汉大学动物实验中心/ABSL-III实验室主任、武汉大学模式动物研 究所所长、武汉大学心血管病研究所副所长、中南医院医学科学研究中心主任。 李红良教授长期致力于心血管代谢性疾病的发生机制与防治研究以及基因工程动 物模型的研发。回国后创建了湖北省模式动物研究中心及武汉大学模式动物协同创新 中心, 建立了系统而完善的转基因技术和基因敲除技术平台以及大小鼠心血管疾病动 物模型的标准化系统, 自主研发或合作研发基因工程大鼠、小鼠1 300多个品系。过去 十余年来, 应用大量的临床标本, 结合基因工程动物模型, 深入系统地探讨了天然免疫 的网络通路对心血管代谢性疾病的作用及其分子机理。在国际上首次提出了天然免疫 信号重构概念, 并发现这些天然免疫信号完全可以通过非免疫依赖机制实现, 提出的新 理论改变了国际同行学者对天然免疫网络调控作用的认识。 已发表国际重要杂志论文128篇, 其中发表于影响因子10分以上的国际著名杂志25 篇; 包括发表在Nat Med、PNAS、Circulation、Hepatology、J Hepatol、Nat Commun等 国际知名杂志, 并连续3年入选2014、2015、2016年度中国高被引学者榜单(医学)。以 第一申请人申请国内发明专利124项, 获得授权专利43项。承担国家级及省部级项目近 30项, 其中作为项目首席科学家主持国家科技支撑计划1项, 作为项目负责人主持国家 科技支撑计划5项; 并作为项目负责人获得国家杰出青年基金、国家自然基金重点项目、 国家自然基金重大计划项目等。荣获湖北省科技进步一等奖以及药明康德生命化学研 究奖等多项奖励。 实验室近期在Nat Med上发表的研究成果首次揭示了天然免疫重要分子CFLAR对 非酒精性脂肪肝炎(NASH)疾病进程中的关键负调控作用, 深入阐明了其分子机制, 对 NASH防治具有重要的临床指导意义(Wang et al. Nat Med 2017)。

 
 
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)被认为是全身性代谢综合征在肝 脏的表现, 后者的主要表现包括高血压、血脂异常、 糖尿病、肥胖等。NAFLD患病人数逐年增加, 已逐 渐成为最常见的慢性肝病类型。非酒精性脂肪性肝 炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH) 是NAFLD较 为严重的进展阶段, 表现为严重的肝脏脂肪堆积、 炎症反应和纤维化。临床研究表明, NASH患者十 年内肝硬化和肝癌发生率高达25%, 预计NASH将成为未来十年肝移植的主要原因[1-2]。然而, 目前临床 上尚无有效治疗NASH的药物, 原因主要在于NASH 发病存在很大的异质性, 且决定NASH进展的关键 机制尚不明确。当前, NASH的治疗策略主要是改 善不良的饮食习惯和生活方式以及控制并发的代谢 综合征。然而, 这些措施往往收效甚微[3-5]。因此, 找 到更加特异性的作用于肝脏, 尤其是针对NASH进 展关键环节—炎症及纤维化的靶向治疗药物, 是 一件急迫且重要的科学任务。

我们团队长期致力于研究天然免疫与心血 管、代谢疾病的关系及作用机制[6-7]。CASP8和 FADD(Fas-associating protein with death domain) 样凋亡调节因子(CASP8 and FADD-like apoptosis regulator, CFLAR)是天然免疫调控网络重要分子, 我 们之前的研究发现, CFLAR在病理性心脏重构过程 中发挥抗凋亡、抑制炎症及纤维化的作用[8-9]。在 NASH的前期研究中, 我们利用小鼠及人体的NASH 肝脏样本开展了大量的潜在调控靶分子筛选工作, 其中, 发现CFLAR蛋白含量与NASH的疾病进展呈 负相关, 提示CFLAR在NASH进程中可能发挥重要 作用。此外, 临床研究报道了CFLAR在人体多个器 官中对炎症、纤维化的显著调控功能[10-12]。另一方 面, 肝脏的根本功能依赖于其对代谢的调控, 大量证 据显示, 慢性代谢异常是肝细胞损伤和肝功能障碍 的主要原因[13-14]。由此, 我们的目的是探索CFLAR 对肝脏代谢的调控作用, 尤其是阐明CFLAR是否可 以作为NASH的治疗靶点[15]。

1 肝细胞中CFLAR抑制肝脏脂质堆积、 炎症并改善胰岛素抵抗

为了明确CFLAR参与脂肪肝的发病过程, 我们 首先检测了CFLAR在饮食引起的代谢紊乱小鼠多 个组织器官中的表达。结果发现, 与正常小鼠相比, CFLAR蛋白含量在脂肪肝中显著地减少, 而在脂肪 及骨骼肌等代谢相关组织器官中没有明显变化。为 了进一步确认这一发现, 我们收集了人体NASH肝 脏活检样本进行临床相关性研究, 结果证实, 肝脏中 CFLAR的蛋白含量与NASH的疾病进展呈负相关。 随后, 我们构建了肝细胞特异性CFLAR基因敲除小 鼠以及肝细胞特异性CFLAR转基因小鼠。通过给予 高脂饮食喂养诱导脂肪肝疾病模型, 动物实验结果 证实了CFLAR对NASH的中心环节肝脏脂质堆积、 炎症和胰岛素抵抗的关键抑制作用。

2 CFLAR发挥作用的分子机制

随后, 我们进行了深入的分子机制探索。首 先, 通过检测多条可能参与NASH进展的信号通 路的活性, 我们发现, CFLAR特异性地抑制ASK1- JNK1级联信号通路的激活。同时, 与正常肝组织 相比, NASH肝脏组织中ASK1-JNK1处于过度激 活状态。接下来, 我们重点探索CFLAR如何抑制ASK1的激活。通过分子间相互作用实验, 我们发 现, CFLAR(203~260) 和CFLAR(414~480)两个片 段[分别命名为CFLAR(S1)和CFLAR(S2)]可以与 ASK1直接结合。然而, 随后的功能实验证实, 只 有CFLAR(S1)可以阻断ASK1-JNK1信号通路的激 活, 而CFLAR(S2)以及CFLAR(S1)和CFLAR(S2)的 连接体[命名为CFLAR(S3)]均不能有效抑制ASK1 的激活。CFLAR(S1)与全长CFLAR对ASK1的作 用方式完全相同, 但是CFLAR(S1)比CFLAR全长 更稳定, 抑制作用也更强。同时, 我们惊喜地发现, CFLAR(S2)片段与E3泛素连接酶ITCH结合, 导致 CFLAR泛素化修饰并随后被蛋白酶体降解, 揭示了 上述脂肪肝中CFLAR蛋白含量减少的原因。

ASK1形成二聚化及随后发生自磷酸化导致 ASK1激活[16]。N-末端卷曲螺旋(N-terminal coiled coil, NCC; 氨基酸297~324)和C-末端卷曲螺旋(C-terminal coiled coil, CCC; 氨基酸1 239~1 295)结构域负责 ASK1的N-末端和C-末端的二聚化[16]。我们观察到, CFLAR(S1)片段特异性地结合在ASK1的N-端, 通过 抑制ASK1的N-端二聚化形成, 阻断ASK1激活(图1A 和1B)。肿瘤坏死因子受体相关蛋白(tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF)与ASK1结合, 促进ASK1的过度活化[16-17]。除了抑制ASK1的N-端 二聚化形成, 我们的结果还证实了CFLAR可以竞争 性地阻断TRAF6与ASK1的结合, 从而强有力地抑制 ASK1的过度活化。

3 CFLAR对NASH的治疗效果

最后, 我们用CFLAR(S1)治疗小鼠及猴子的 NASH及并发的代谢综合征。腺相关病毒(adenoassociated virus, AAV)是一种复制缺陷型微小病毒, 由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂 细胞)、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长 等特点, 被视为最有前途的基因转移载体之一。此 外, 不同AAV血清型具有特异的组织器官亲和性, 如 AAV8载体表现出明显肝嗜性, AAV9载体则更特异 性地靶向心脏[18]。于是, 我们利用AAV8构建编码 CFLAR(S1)序列的重组表达载体, 体内注射靶向肝 脏治疗小鼠及猴子的NASH。小鼠实验结果显示, 与对照组相比, 肝脏中表达CFLAR(S1)显著减轻并 逆转肝脏脂肪堆积和炎症, 同时, 胰岛素抵抗也得 到显著改善。然而, 研究表明, 小鼠的疾病进展特点与人体疾病的病理生理过程有较大差别[19], 为了 更加确信CFLAR的治疗效果及其临床转化潜能, 我 们从野生猴群中筛选了18只代谢综合征倾向的猴 子, 且肝脏活检证实NASH发病。通过门静脉注射 AAV8-CFLAR(S1)治疗, 结果证实, CFLAR显著阻 断并逆转NASH疾病进展(图1)。同时, 我们观察到, CFLAR(S1)对猴子的体重、心率、体温和血压没有 明显影响, 显示了CFLAR治疗的特异性和安全性。

4 转化意义

本研究首次提出N-端二聚化介导的ASK1酶 过度激活, 是控制NASH进展的关键环节, 对理解 NASH的发病机制提出了全新的认识。通过阐明 CFLAR抑制ASK1过度激活的调控机制, 我们提供 了一种可开发靶向治疗药物的新策略。目前已经研 发的ASK1抑制剂主要是直接抑制ASK1的激酶活 性, 而ASK1的酶活性对于机体正常生理功能至关重 要。正因为如此, ASK1抑制剂有可能影响正常的生 理功能, 因而会限制临床的应用; 而我们的研究证 实, N-端二聚化引起的ASK1的激活主要发生于疾病 过程中, 因此, CFLAR更靶向于治疗疾病本身, 而对 机体正常生理功能影响较小, 更具有临床转化的潜 能。最新一项刊登在国际知名杂志PNAS上的研究 报告证实, ASK1是参与多种疾病发生过程的关键因 子, 比如帕金森综合征、胃癌以及黑色素瘤等[20], 显 示了ASK1对机体病理生理过程的重要作用。此前, 美国吉利德公司公布的数据显示, ASK1的抑制剂在治疗NASH的二期临床实验中显示出了一定的疗 效。而我们的研究更是为围绕ASK1开发靶向药物 指明了方向, 有望彻底打破NASH治疗无药可用的 局面。


A: CFLAR全长和CFLAR(S1)抑制ASK1的N-端二聚化; B: CFLAR全长和CFLAR(S1)抑制ASK1-JNK1信号通路的激活; C: CFLAR(S1)显著减轻 猴子的非酒精性脂肪肝炎。标尺=100 μm。
A: full-length CFLAR (CFLAR-FL) and CFLAR(S1) impaired the N-terminus-mediated dimerization of ASK1; B: CFLAR-FL and CFLAR(S1) inhibit the activation of ASK1-JNK1 signaling; C: therapeutic effects of CFLAR(S1) on nonalcoholic steatohepatitis in monkeys. Scale bar=100 μm.
图1 CFLAR通过抑制ASK1激活减轻非酒精性脂肪肝炎(根据参考文献[15]修改)
Fig.1 CFLAR inhibits ASK1 activation to ameliorate nonalcoholic steatohepatitis (modified from reference [15])



参考文献 (References)
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