内质网–细胞质膜连接区蛋白质组鉴定及对其中的STIMATE的功能研究

张舒策1 何 涟2 周育斌2 王友军1*
(1北京师范大学生命科学学院抗性基因资源与分子发育北京市重点实验室, 北京 100875; 2Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, Houston, Texas 77030, USA))
 
 

王友军, 北京师范大学生命科学学院教授。1997年毕业于烟台大学生化 系, 获学士学位; 2000年于北京大学生命科学学院获得神经生理学专业硕 士学位; 2007年于美国马里兰大学帕克分校获得神经与认知专业博士学位, 2007–2010年在美国费城天普大学生化系Gill实验室做博士后, 之后三年继 续在Gill处做副科学家(Associate Scientist)。2013年起, 在北京师范大学生 命科学学院抗性基因资源与分子发育北京市重点实验室工作, 并入选教育 部2013年度“新世纪人才支持计划”及第五批“青年千人计划”。王教授多年 来一直从事胞内钙信号转导的相关研究, 用荧光钙成像、FRET及膜片钳 技术等手段研究STIM介导钙信号的分子机制及其生理意义。其主要工作 揭示了STIM蛋白激活Orai通道的重要分子机制, 发现了STIM蛋白对Orai 及L型钙离子通道的交互控制作用, 从而说明STIM是一个细胞内决定细胞 反应类型的一个重要的选择开关。最近, 与周育斌教授合作鉴定了一个ER 蛋白—STIMATE, 并初步阐明了其调控STIM1激活的分子机制。其中 后两个发现均被同领域专家在同期杂志上加以评论。迄今为止, 王教授在 Science、Nat Cell Biol、Proc Natl Acid Sci USA、Nat Commun等杂志上发 表相关论文20余篇。

 
 

1 内质网–细胞质膜连接区背景介绍
真核细胞具有各种形状及功能各异的、膜包 被的细胞器, 这些细胞器膜之间的信息交流对于细 胞维持正常的形态和执行功能非常重要[1]。而其中 对内质网与细胞质膜之间的交流的研究近来进展较 快[2]。在某些细胞的边缘, 管状或片状的内质网膜 延伸至细胞膜附近, 与细胞质膜保持大约10~20 nm 的距离, 两者之间没有直接的膜融合, 这些区域被称 为内质网–细胞质膜连接区(endoplasmic reticulumplasma membrane junction, ER-PM J 或ER-PM连接 区)。而其中位于ER-PM连接区的距离质膜较近的 内质网被称为皮层内质网(cortical ER, cER)(如图1 蓝色箭头所示)。在ER-PM连接区发生着许多重要 的生理活动, 例如脂质代谢以及包括钙库操纵钙内 流(store-operated calcium entry, SOCE)在内的钙离子 稳态的维持等[1]。由于缺少适当的方法和方便的工 具对这个特化部位进行分子水平的解析一直非常困 难。

钙池操纵钙内流(SOCE)是一种发生在ER-PM 连接区的重要的生理过程[3]。经典的SOCE由位于内质网膜上的钙离子感受器蛋白STIM1(stromal interaction molecule 1)和质膜上Orai1钙离子通道共 同介导。STIM1蛋白是内质网膜上的单次跨膜的一 个钙结合蛋白, 其位于内质网腔内的N-端EF-hand结 构域可以结合钙离子。当内质网钙库中钙离子浓 度降低时, 钙离子从STIM1上解离下来, 引起STIM1 发生构象变化[4]并转位到ER-PM连接区的cER处, 并 形成众多斑块状的结构“puncta”(如图2黄色箭头所 示)。STIM1位于胞质一侧的C-末端, 与定位在细胞 质膜上的Orai1通道相互作用, 并激活Orai1通道, 胞 外的钙离子通过Orai1进入胞质, 这种钙内流即为 SOCE[5]。SOCE普遍存在于非兴奋性细胞和兴奋 性细胞中, 在分泌、基因转录、酶活调节、细胞凋 亡等过程中发挥重要的作用[6-7]。SOCE重要的下游 反应之一是导致活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells, NFAT)的激活和核转位, 并启动下 游基因的转录[8]。因而解析在ER-PM连接区参与调 控SOCE的蛋白质组并了解其作用机理有着非常重 要的意义。

尽管传统的基于免疫共沉淀的蛋白质组学的质谱鉴定方法可以同时检测数以千计的互作蛋白, 但是该方法的灵敏度和特异性均较低, 对互作蛋白 的时空分辨率较低。比如在质谱检验之前的细胞裂 解及免疫共沉淀过程中会损失掉很多蛋白, 特别是 一些弱相互作用蛋白, 从而产生假阴性结果。另外, 细胞裂解后一些本来在细胞内不同部位、没有相互 接触的蛋白也有可能发生相互作用而被鉴定为互作 蛋白, 产生假阳性结果。

2 原位活体生物素蛋白标记技术

为了解决上述问题, Rhee等[9]在2013年首次建 立了基于抗坏血酸过氧化酶2(ascorbateperoxidase 2, APEX2)的原位活体蛋白标记技术。APEX2可以在 H2O2存在的情况下催化生物素–苯酚转化为生物素 酚氧自由基, 后者可以攻击附近蛋白的酪氨酸、色 氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基, 从而可以对临近的 蛋白进行原位活体生物素标记。而且由于生物素– 酚氧自由基存在的半衰期非常短(<1 ms), 因而该方法仅能标记距APEX2小于20 nm的蛋白。生物素标 记之后, 将细胞裂解, 用链霉亲和素磁珠富集这些被 生物素标记的蛋白, 最后运用质谱技术对这些蛋白 质组进行鉴定。通过这一方法, Rhee等[9]在细胞内 表达了特异性定位于线粒体基质的APEX2融合蛋 白, 原位活体标记并鉴定了线粒体基质及线粒体内 膜上面对基质的蛋白质组, 有效提高了实验结果的 时空分辨率, 并显著降低了假阳性率。

由于STIM1可以在内质网钙库清空后转位到 ER-PM连接区, 而且ER-PM连接区的空间大小正好 与这种结合原位活体生物素标记法的蛋白质组鉴 定技术的时空分辨率(<20 nm)一致。因而我们将该 技术手段运用到对ER-PM连接区内的STIM1互作 蛋白质组的鉴定上(图1)。我们首先构建了STIM1- APEX2融合蛋白, 并发现该融合蛋白的两个组分 均能正常行使功能。全内反射荧光(total internal reflection fluorescence, TIRF)显微成像结果显示, 其 STIM1部分作用跟野生型的STIM1一样, 都能在内质网钙库清空后形成典型的激活后的斑块状结构 “puncta”(图2)。而用亲和素进行免疫染色的结果显 示, 该融合蛋白的APEX2部分跟野生型的APEX2一 样, 都仅能在加入H2O2时才能对蛋白进行生物素标 记。这表明, 我们构建的融合蛋白能有效地定位到 ER-PM连接区并对其周围20 nm内的蛋白进行生物 素标记。



3 运用原位活体生物素蛋白标记技术鉴 定ER-PM连接区STIM1附近蛋白质组并 发现STIMATE

借助我们构建的STIM1-APEX2融合蛋白, 在 静息或内质网钙库清空时, 我们在HEK-293活细 胞内原位标记了ER-PM连接区内距离STIM1蛋白 20 nm之内的蛋白质组。然后, 用亲和素磁珠富集 细胞裂解液中的生物素标记蛋白, 最后使用液相色 谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法对富集到的蛋白进行分析鉴定。Orai1作为已知的STIM1结合蛋白仅 在激活状态下被检测到, 这与STIM1和Orai1仅在 STIM1激活时有相互作用的实验预期相符合。同 时, 我们还检测到了其他已报导的STIM1结合蛋白, 如MAPRE1/EB1(microtubule associated protein RP/ EB family member 1)、ATP2A2/SERCA2(ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ transporting 2)等。这些结果表明, 这一新的蛋白质组鉴定方 法是有效的。包括上述蛋白在内, 我们一共找到 了73个潜在的STIM1相互作用蛋白, 其中17个在 HEK-293细胞中不论钙库充满还是清空的状态下 都被检测到。它们中大部分都是内质网或细胞 质膜的驻留蛋白、细胞骨架组分、参与胞内膜运 输和翻译后修饰的蛋白。接下来, 我们选择了其 中在钙库清空前后均能检测到的、具有钙信号功 能注释的或具有预测的跨膜区的38个蛋白, 并进 行了与STIM1的双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescence complementation, BiFc)。结果显示, TMEM110(RefSeq ID: NM_198563)在APEX和BiFc 的实验中都是一个很好的潜在STIM1互作蛋白, 我 们将它命名为STIMATE(STIM-activating enhancer)。

4 STIMATE功能初步探索
为了探究STIMATE对SOCE及其下游反应的影 响, 我们使用siRNA在HEK-293细胞中对STIMATE 进行沉默, 并分别使用钙成像技术和萤光素酶技 术检测了沉默STIMATE对SOCE和NFAT活性的影 响。与对照组相比, STIMATE沉默的细胞中SOCE 和NFAT依赖的萤光素酶活性均受到了抑制。在干 扰STIMATE的HEK-293细胞中回补STIMATE的表 达可以恢复SOCE和萤光素酶的活性。我们又使用 CRISPR/Cas9基因组编辑技术制作了两个稳定敲除 STIMATE的HEK-293细胞系, 它们的第四个外显子 被破坏, 具有提前的终止密码子。在这两个细胞系 中, 离子霉素(ionomycin)引发的内质网钙库的钙释 放没有明显的变化, 但SOCE显著地减小了。这些 结果提示, STIMATE是一个之前未被发现的可上调 SOCE的蛋白。

STIMATE在人和小鼠的组织中广泛表达, 在 HEK-293、HeLa和COS-7等细胞系中单独过表达 时定位于内质网上。在共表达STIMATE与STIM1 的细胞中, 二者共定位; 在10 nm的尺度上, CFP标记 的STIMATE与YFP标记的STIM1之间可以检测到 荧光共振能量转移(f?rsterresonance energy transfer, FRET)的信号; 在体外, STIM1和STIMATE可以免 疫共沉淀。这些结果暗示, STIMATE是STIM1的 互作蛋白。经过一些列的免疫共沉淀和FRET实 验, STIMATE与STIM1相互作用的部分被定位在 STIM1位于233~343位氨基酸的CC1(coiled-coil 1) 区, 以及STIMATE的C-末端(STIMATE-CT、214- 294位氨基酸)。应用表面等离子体共振(surface plasmonresonance, SPR)技术可以测定STIM1-CC1与 STIMATE-CT之间的解离常数为8.9±0.7 μmol/L。这 些结果表明, STIMATE是通过其C-末端与STIM1- CC1的互作来实现其调控SOCE的作用的。

为进一步探究STIMATE是如何通过与STIM1 互作来影响其介导SOCE的功能的, 我们首先进行了TIRF成像实验。结果显示, 在部分共表达STIMATE 和STIM1的细胞中, 即使在内质网钙库充满的静息 状态下, STIM1也会移动到ER-PM连接区, 形成典型 的激活时的puncta结构, 并与STIMATE共定位。钙 库清空后, 过表达STIMATE的细胞中STIM1形成的 斑块状结构面积更大, 而在STIMATE敲除的细胞中, TIRF成像所观察到的EGFP-STIM1的荧光减少了 大约70%。基于这些结果, 我们认为, STIMATE可 以调控STIM1 puncta的形成。进一步的钙及FRET 成像结果表明, 由STIMATE共表达引起的puncta状 分布的STIM1在静息时处于持续激活状态, 在钙库 充满时即结合并激活Orai1, 引发自发的持续钙内 流。并且该钙内流可以被高浓度的SOCE工具药2- 氨基乙氧基二苯硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate, 2-APB)抑制。这些结果暗示, STIMATE可能通过与 STIM1互作, 影响STIM1 puncta的形成, 进而调控由 STIM1-Orai1介导的钙内流。

由于STIM1在激活时, 首先需要进入与质膜 距离较近的层内质网(cortical ER, cER), 之后才能 与Orai1结合并引发SOCE。所以另外一种可能是, STIMATE通过调节层内质网的形成, 从而间接地调 节STIM1 puncta的产生。因而我们探究了STIMATE 的敲除对cER形成的影响。但利用高分辨率透射电 镜成像的结果表明, STIMATE的敲除没有显著影响 cER的形成。为排除该阴性结果是由于所用技术手 段分辨率不够造成的假象的可能, 我们进一步利用 cER的选择性标记蛋白“膜系外周内质网(membraneattached peripheral ER, MAPPER)”来标记cER, 或 用我们构建的光遗传工具“光诱导膜系外周内质 网(light-inducible membrane-tethered peripheral ER, LiMETER)”可逆性地标记cER, 然后进行高分辨率 成像观察STIMATE的敲除对cER形成的影响。两 种实验的结果均表明, STIMATE敲除仅减少了大约 10%的cER。STIMATE敲除后对cER的微小抑制不 能完全解释STIM1 puncta大量减少(约70%)的现象。 因而STIMATE可能是更多的通过与STIM1直接的相 互作用来影响后者的激活的。

我们之前的研究发现, 在静息时, STIM1激活 Orai1的最小功能域SOAR(STIM-Orai-activating region)/CAD[CRAC(calcium release-activated calcium channel) activation domain][10-11] 被STIM1 的 CC1区锚定在内质网附近, 阻止了其激活。在钙库 清空后, STIM1的构象变化, 使得CC1区释放SOAR/ CAD, 后者结合并激活质膜上Orai1钙离子通道, 引 发钙内流[4]。因而我们猜想, STIMATE与CC1的相互 作用可能破坏了CC1与SOAR/CAD相互作用, 解除 了静息时STIM1自抑制状态, 促进了STIM1从静息 到激活的构象变化, 从而使得SOAR/CAD从STIM1 上解离下来而激活Orai1。利用我们之前开发的可 以检测STIM1构象变化的二元FRET体系STIM11-310- CFP和YFP-SOAR[4], 我们发现, 共表达STIMATE和 钙库清空一样, 都使得二者之间的FRET信号变弱。 这说明STIMATE的确通过与STIM1-CC1的相互作 用, 竞争性地减弱了STIM1的CC1区与SOAR区的相 互作用, 从而促进了STIM1由静息到激活的构象及 定位变化。

5 总结

我们运用非破坏性的活体原位生物素蛋白标 记的方法无损地鉴定了一个ER-PM连接内STIM1蛋 白附近的蛋白质组。这一结果不仅提供了生理状态 下ER-PM连接区蛋白质组成的第一个视角, 也为未 来研究它们在信号转导和疾病发生过程中的功能提 供了一个框架。活体生物素标记技术有望揭示更多 亚细胞结构中的分子信息。特别地, 随着ER-PM连 接区调控着STIM1依赖的钙信号过程的内质网驻留 蛋白STIMATE的发现, 我们不禁要问, STIMATE是 怎样与ER-PM连接区的其他成分协同从而在钙信号 转导和其他生理过程中发挥作用的? STIMATE本 身对ER-PM连接区的cER形成与维持的作用又是如 何实现的? ER-PM连接区隐藏着更多的疑惑需要我们进一步探索和回答。


参考文献 (References)
1 Stefan CJ, Manford AG, Emr SD. ER-PM connections: Sites of information transfer and inter-organelle communication. Curr Opin Cell Biol 2013; 25(4): 434-42.

2 Henne WM, Liou J, Emr SD. Molecular mechanisms of interorganelle ER-PM contact sites. Curr Opin Cell Biol 2015; 35: 123-30.

3 Carrasco S, Meyer T. STIM proteins and the endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions. Annu Rev Biochem 2011; 80: 973-1000.

4 Ma G, Wei M, He L, Liu C, Wu B, Zhang SL, et al. Inside-out Ca2+ signalling prompted by STIM1 conformational switch. Nat Commun 2015; 6: 7826.

5 Soboloff J, Rothberg BS, Madesh M, Gill DL. STIM proteins: Dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol 2012; 13(9): 549-65.

6 Hogan PG, Rao A. Store-operated calcium entry: Mechanisms and modulation. Biochem Biophys Res Commun 2015; 460(1): 40-9.

7 Parekh AB, Putney JW Jr. Store-operated calcium channels. Physiol Rev 2005; 85(2): 757-810.

8 Wu MM, Buchanan J, Luik RM, Lewis RS. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol 2006; 174(6): 803-13.

9 Rhee HW, Zou P, Udeshi ND, Martell JD, Mootha VK, Carr SA, Ting AY. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science 2013; 339(6125): 1328-31.

10 Park CY, Hoover PJ, Mullins FM, Bachhawat P, Covington ED, Raunser S, et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell 2009; 136(5): 876-90.

11 Yuan JP, Zeng W, Dorwart MR, Choi YJ, Worley PF, Muallem S. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol 2009; 11(3): 337-43.

12 Jing J, He L, Sun A, Quintana A, Ding Y, Ma G, et al. Proteomic mapping of ER-PM junctions identifies STIMATE as a regulator of Ca2+ influx. Nat Cell Biol 2015; 17(10): 1339-47.

此内容已有4477人浏览

您是第 位访问者,欢迎!
主 办:中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 中国细胞生物学学会
协办: 上海国联干细胞技术有限公司 上海赛傲生物技术有限公司
地 址:上海徐汇区岳阳路319号31号楼A楼303室 邮编:200031 电话:021-54920950 / 2892 / 2895 Email:cjcb@sibs.ac.cn
沪ICP备05017545号