LKB1在非小细胞肺癌可塑性及耐药反应中的重要作用及机制

李福明 韩向琨 李 飞 季红斌*
(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 系统生物学重点实验室, 上海 200031)
 
 

季红斌, 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员。 1995年毕业于吉林大学生物化学系, 2000年获中国科学院上海生命科学研究院生物 化学与细胞生物学研究所博士学位, 2000~2007年在美国哈佛医学院从事博士后工 作, 2007年晋升为讲师。2007年入选中国科学院“百人计划”, 加入生物化学与细胞 生物学研究所; 2013年获国家杰出青年基金; 2013年获上海市科技进步二等奖(第二 完成人); 2014年获第七届上海青年科技英才称号。长期从事肺癌发病分子机理研 究, 在肺癌关键致病基因的鉴定及其功能和机理研究方面取得一系列原创性的科研 成果。他的课题组发现, LKB1功能性缺失突变在人非小细胞肺癌中普遍高发, 并揭 示其在肺癌转移中的重要作用及分子机制; 利用动物模型证实肺腺癌向肺鳞癌的转 分化, 为后续肺腺鳞癌转分化的机制研究奠定了基础; 发现新的肺癌驱动基因RET 融合, 为临床肺癌“个体化”分子靶向治疗提供理论指导。近五年来发表研究论文58 篇, 其中作为通讯或共同通讯作者在Cancer Cell、Nat Commun、Proc Natl Acad Sci USA、J Clin Oncol、Cell Res等期刊发表研究论文共29篇, 专业综述3篇; 申请发明专 利3项, 获授权1项。

 
 

肺癌是全球范围内具有较高发病率和致死率 的原发性恶性肿瘤之一, 患者的5年存活率大约为 15%。根据病理学分类, 肺癌大致可分为小细胞肺 癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌约占肺癌的85%, 具有显著的遗传多样性和病理组织异质性, 又包括 腺癌(adenocarcinoma, ADC)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)、腺鳞癌(adeno-squamous cell carcinoma)和大细胞癌[1]。不同的非小细胞亚型如 肺腺癌和肺鳞癌具有不同的发病过程和病理学特 征, 而且对某些药物或治疗手段也有着不同的响应 效果[2-3]。

基于大规模的临床样本分析和基因组学研究, 目前已经发现多个参与非小细胞肺癌发病的驱动基 因(driver gene)突变, 包括KRAS(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 或EGFR(epidermal growth factor receptor)的功能激活型突变, 以及TP53(tumor protein 53)或LKB1(liver kinase B1)的功能失活型突 变等[4-5]。这些突变有的已经作为药物靶点被成功地 用于分子靶向治疗(molecular targeted therapy)。例如, 携带EGFR突变的肺癌患者可以使用针对EGFR的小 分子药物(如Gefitinib或Erlotinib)或单克隆抗体药物 (如Cetuximab)进行靶向治疗。然而, 超过20%的非 小细胞肺癌患者携带LKB1的功能失活型突变, 且目 前对这类患者尚无针对性的治疗策略[3]。

经基因工程改造的肺癌小鼠模型, 如KrasG12D (KRAS)、KrasG12D;Trp53lox/lox(KP)和KrasG12D;Lkb1lox/lox (KL)模型等, 不仅能模拟人类肺癌的起始、恶性进 展以及转移等阶段, 还可用于临床前试验(preclinical trials)以评估某些药物或治疗策略的有效性和安全 性[6-7]。研究人员在前期工作中比较了KRAS、KP 和KL小鼠模型, 发现化疗药物Docetaxel和靶向MEK的小分子抑制剂Selumetinib(AZD6244)联合用药对 KRAS和KP肺癌有一定的治疗效果, 对KL肺癌却无 疗效[8]。目前普遍认为, LKB1可作为鉴定和/或影响 非小细胞肺癌细胞响应药物作用的分子标志物, 但 其作用机制尚不清楚。

LKB1是经典的抑癌基因。作为丝氨酸/苏氨 酸激酶, LKB1通过磷酸化激活包括AMPK(AMPactivated protein kinase)在内的多个底物并抑制 mTOR(mechanistic target of rapamycin)等调控细胞 增殖或存活的信号通路, 而失活LKB1导致mTOR信 号通路持续激活并促进细胞增殖或存活[9]。同时, LKB1在细胞的能量感应和代谢稳态的维持方面发 挥重要调节作用。例如, 处于静息期的造血干细胞 一旦缺失LKB1就会快速进入细胞周期并伴随线粒 体功能障碍和细胞能量代谢异常[10-12]。体外研究表 明, 当细胞面对代谢应激(metabolic stress), 如营养匮 乏或胞外基质减少时, 会激活AMPK并通过调控还 原力NADPH的稳态来维持细胞存活; 缺失LKB1的 细胞由于不能及时激活AMPK, 会对这些应激条件 更为敏感并发生凋亡[13]。由此可见, 失活LKB1一方 面加速细胞增殖, 另一方面又使细胞缺乏对代谢应 激的适应能力。这种“双刃剑”功能带来一个科学问 题: 缺失LKB1的肺癌细胞如何在体内协调肿瘤进程 和代谢应激这一矛盾?

我们发现, 在KL小鼠模型中敲除LKB1不仅显 著地加速肺腺癌的发生和进展, 还特异地导致了肿 瘤异质性, 即肺腺癌、肺鳞癌和肺腺鳞癌的出现, 而 KRAS和KP小鼠模型只产生肺腺癌[6]。此外, 过表达 激活型KRAS并下调LKB1的人支气管上皮细胞接种 至裸鼠皮下也会导致肺癌异质性[14]。我们近期的研 究表明, KL小鼠的这种肺癌异质性源于LKB1失活引起的肿瘤可塑性(tumor plasticity), 即肺腺癌经由 腺鳞癌转分化为肺鳞癌[15-16]。我们把这种转变过程 叫做腺鳞癌转分化(adenocarcinoma to squamous cell carcinoma transdifferentiation, AST)。基于上述发现, 我们推测, AST可能是LKB1失活的肺腺癌在恶性进 展过程中适应代谢应激(metabolic adaptation)而发生 的重要事件。

在本研究中, 我们利用cDNA microarray比较了 KL小鼠肺腺癌和肺鳞癌的基因表达谱, 并对该数据 进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA), 发现KL肺鳞癌显著富集参与谷胱甘肽 (glutathione, GSH)代谢的基因集。GSH可以有效地 清除细胞内过多的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS), 而细胞缺乏GSH会累积ROS并导致氧化应激 (oxidative stress)[17]。我们通过定量PCR(Q-PCR)和 免疫组织化学染色(immunohistochemical staining, IHC)比较了GSH合成(Gclm、Gsta4、Gstya1和Gsto1 等)或抗氧化相关特征基因(Nrf2和Nqo1等)在KL肺 腺癌和肺鳞癌中的差异, 发现它们在肺鳞癌中具有 更高的水平, 而肺腺癌却含有更多的DNA氧化性修 饰产物8-oxo-dGuo。采用液相层析串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LCMS)分 析, 我们进一步发现, KL肺鳞癌含有更多的GSH和 ATP, 而KL肺腺癌具有更高的葡萄糖含量和更低的 乳酸含量。这些结果暗示, KL肺腺癌和肺鳞癌具有 不同的氧化还原水平和代谢水平。由于Trp53缺失 会加速KRAS肺腺癌的进展却不会导致其转分化为 肺鳞癌, 我们就ROS相关特征基因对KP肺腺癌和KL 肺腺癌进行比较, 结果发现, KP肺腺癌富集了GSH 代谢的基因集, 且KP肺腺癌不仅具有更低的ROS水 平, 还表达更高水平的NRF2(nuclear factor, erythroid derived 2, like 2) 和NQO1[NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1]。这表明, ROS相对特异地在KL肺腺癌中 出现异常积累。

我们对含有162例人肺腺癌样本的组织芯片 (tissue microarray, TMA)进行免疫组化统计分析, 发 现LKB1的表达水平跟ROS水平呈显著负相关, 约 40%(65/162)的样本不表达LKB1, 同时表现出较高 的ROS水平。在这65例肺腺癌样本中, 我们还发现 有8例样本表达肺鳞癌的特征基因(p63、K5和K14); 同时, 携带LKB1突变的6例人肺腺癌样本中有2例也 表达肺鳞癌特征基因。通过免疫组化, 进一步发现人肺腺鳞癌样本呈现不同的ROS水平和LKB1表达 水平, 且二者在腺鳞癌的腺癌部分具有负相关性, 而 在鳞癌部分却无相关性。此外, 19例样本中有6例不 表达LKB1, 且5例样本的腺癌部分跟鳞癌部分相比 具有更高的ROS水平和更低的NQO1表达水平; 其 中2例样本的腺癌细胞同时表达腺癌特征基因TTF1 和鳞癌特征基因p63, 而鳞癌细胞亦同时表达p63和 TTF1。最后, 我们对154例肺鳞癌样本进行免疫组 化统计分析, 发现约97.4%的样本只表达p63, 37.6% 样本不表达LKB1, 其中有4例样本同时表达p63和 TTF1。基于这些临床样本分析的结果并结合KL小 鼠模型中的发现, 我们推测LKB1缺失引起的肿瘤可 塑性(AST)可能跟ROS积累相关。

接下来, 我们通过两个实验探讨了ROS对于 AST的影响。首先, 我们采用抗氧化剂N-乙酰半胱 氨酸(N-acetylcycteine, NAC)对KL小鼠进行处理并观 察其对AST的影响。结果显示, NAC处理显著地降 低了肺鳞癌的发生率(SCC incidence)和数目, 却增加 了肺腺癌的数目。其次, 我们利用慢病毒介导的基 因表达系统在KL小鼠肺上皮细胞中过表达抗氧化转 录因子NRF2。结果发现, 过表达NRF2不仅降低了 KL肿瘤中的ROS水平、肺鳞癌的发生率以及数目, 还增加了肺腺癌的数目。上述结果表明, 降低KL小 鼠肺腺癌中的ROS水平可以抑制其转分化为鳞癌。

实体肿瘤恶性进展中肿瘤微环境的改变, 包 括营养匮乏或细胞外基质减少等会引起代谢应 激和ROS积累。戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway, PPP)负责产生细胞内大约60%的NADPH, 后者用于去除ROS来维持氧化还原态的平衡。PPP 还负责生成核糖-5-磷酸, 为细胞分裂和合成代谢中 的核苷酸合成提供原料[18]。基于GSEA结果, 我们发 现KL肺鳞癌富集与嘌呤代谢和嘧啶代谢相关的基 因集。此外, PPP的关键限速酶在KL鳞癌中具有更 高的mRNA水平和蛋白水平。其中, 葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)作 为PPP的第一个限速酶, 在KL肺鳞癌中具有更高的 酶活性和蛋白水平。上述结果暗示, PPP下调可能是 导致KL肺腺癌异常积累ROS的一个原因。于是, 我 们通过改变KL肿瘤中G6PD的表达水平来研究PPP 是否影响AST。一方面, 过表达G6P显著地降低肺腺 癌的ROS水平、肺鳞癌的发生率和数目, 增加肺腺 癌的数目; 另一方面, G6pd基因的沉默虽然会增加肺腺癌的ROS水平并降低其数目, 却增加了肺鳞癌 的数目和发生率。综合以上实验结果, 我们认为PPP 确实可以影响AST。

细胞内氧化还原态的维持依赖于ROS生成和清 除通路之间的动态平衡。上述结果表明, PPP失调促 进ROS生成, 但我们不确定清除ROS的通路是否也 出现异常从而导致ROS的进一步异常累积。AMPK 作为LKB1下游底物, 是已知的并被广泛研究的细 胞能量感应器, 在细胞能量稳态维持过程中具有不 可或缺的作用[19]。基于AMPK磷酸化(pAMPK)水 平的检测结果, 我们发现KL肿瘤中AMPK处于失活 状态, 这就使得AMPK不能发挥能量感应器的功能。 由此我们推测, 在KL肿瘤中重新激活AMPK可能会 缓解ROS的异常累积并抑制AST。我们利用慢病毒 系统在KL肿瘤中表达组成型激活的AMPK突变体 caAMPK(constitutively active AMPK), 结果显示, 无 论是肺鳞癌的发生率还是平均数目都发生明显的下 降, 而肺腺癌的数目则无显著变化。


当PPP被抑制时, 细胞可以动用受AMPK-ACC 信号激活的脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO) 通路来产生包括NADH在内的还原力以维持氧化 还原态[13]。我们发现, KL肿瘤中的AMPK-ACC 信号通路处于失活状态, 而表达caAMPK可以激 活AMPK-ACC通路; 与肺鳞癌相比, KL肺腺癌具 有更低的FAO限速酶酶活性, 包括Cpt1(carnitine palmitoytransfearase 1)和ACS(acyl-coenzyme A synthase)等。此外, KL肺腺癌中FAO特征基因的 mRNA水平和蛋白水平比KL肺鳞癌低, 而且KL肺 腺癌含有更多的脂滴。这些证据表明, KL肺腺癌 和肺鳞癌的FAO通路具有不同的活性水平, 并暗 示AMPK-ACC信号失活可能导致FAO受影响后不 能清除ROS, 从而导致ROS的进一步累积并最终 促进AST的发生。由于过表达CPTA可以增强FAO 活性并降低ROS水平, 我们在KL小鼠模型中表达 CPT1A(carnitine palmitoyltransferase 1a), 发现其与 caAMPK一样可以降低肺鳞癌的数目和发生率, 并 增加肺腺癌的数目。结合PPP失调的数据, 上述实验 结果揭示了KL肺腺癌异常累积ROS的原因: 一方面, 肿瘤的恶性进展会伴随PPP的失调, 从而导致ROS的 过度生成; 另一方面, LKB1失活会导致下游AMPKACC 信号轴失活无法发挥功能, 从而使得FAO通路 不能被激活, 故而不能有效清除ROS, 这两方面的失调最终导致ROS的进一步累积最终促成了氧化还原 态的失衡(redox imbalance)。

利用临床样本, 我们比较性地分析了肺腺癌中 LKB1表达水平、AMPK磷酸化水平和ACC磷酸化 水平。统计结果显示, 三者中两两相比均具有显著 的正相关性。其次, 无论是在8例不表达LKB1的肺 腺癌样本中, 还是在2例携带LKB1突变的腺癌样本 中, 我们都没有检测到pAMPK和pACC水平。这些 结果支持LKB1失活引起AMPK-ACC信号轴失活的 结论。有趣的是, 在这2例携带LKB1突变的样本中, p63阳性的细胞与邻近TTF1阳性的细胞相比, 具有 更高的G6PD和CPT1A蛋白水平。同样, 在4例不表 达LKB1的肺腺鳞癌样本中, 尽管腺癌部分和鳞癌部 分都不表达pAMPK和pACC, 鳞癌部分的细胞却表 达更高的G6PD和CPT1A蛋白水平。这些现象跟KL 小鼠的结果一致, 表明PPP和FAO的差异很可能与氧 化还原态的异质性相关。

由于ROS诱导剂可用于抗肿瘤治疗[20], 且KL 肿瘤呈现异常的氧化还原态, 我们利用ROS诱导剂 荜茇酰胺(Piperlonguine)在KL小鼠模型上进行临床 前试验以评价其疗效。组织学统计分析结果表明, Piperlonguine可以有效地降低肺腺癌的数目, 但肺鳞 癌的数目和发生率都明显上升。进一步分析发现, Piperlonguine会抑制腺癌细胞增殖, 并促进其凋亡, 而鳞癌细胞却并无明显的变化。有趣的是, 我们在 Piperlonguine处理组中发现一些腺癌会同时表达鳞 癌的标记物p63和腺癌的标记物TTF1, 提示这些肿 瘤可能代表了转分化的中间态肿瘤。

近期研究发现, 抗糖尿病药物Phenformin对 KL肺腺癌具有一定的疗效, Phenformin单一用药 虽可导致KL肺腺癌消退, 却使其最终获得了耐药 性[21]。我们推测, Phenformin处理可能导致AST, 于是用Phenformin对KL小鼠进行处理以验证此假 说。研究结果显示, 与KL肺鳞癌相比, KL肺腺癌对 Phenformin更加敏感; Phenformin处理虽然加剧肺腺 癌细胞的凋亡并导致肺腺癌数目的下降, 却显著地 增加了肺鳞癌的数目和发生率。

因此, 靶向肿瘤代谢的临床前药物包括 Piperlonguine和Phenformin虽然能够有效地抑制KL 肺腺癌的恶性进展, 却会促使一部分KL肺腺癌转分 化为肺鳞癌, 而后者对该Piperlonguine或Phenformin 并不敏感, 因此肿瘤呈现出耐药性。


图1 LKB1在非小细胞肺癌恶性进展中的“双刃剑”功能(根据参考文献[22-24]修改)
Fig.1 “Double-edged sword” function of LKB1 in non-small cell lung cancer progression (modified from references [22-24])

图2 KL肺腺癌通过转分化为肺鳞癌从而产生对Piperlongumine和Phenformin的耐药性
Fig.2 KL lung adenocarcinoma acquires drug resistance to Piperlongumine and Phenformin treatments through
squamous transdifferentiation

综合以上研究结果和我们前期的工作[22-24], 我 们提出LKB1在非小细胞肺癌恶性进展过程中的“双 刃剑”功能模型。在肺腺癌发生发展的早期阶段, LKB1作为抑癌基因, 其缺失会激活mTOR-HIF1a- LOX以及SIK2-CRTC1-NEDD9信号轴, 从而促进肺 腺癌的恶性进展; 而在肺腺癌恶性进展的后期阶段, LKB1作为氧化还原/代谢稳态的调控因子, 其缺失 会使AMPK-ACC信号轴以及下游FAO通路无法激 活, 从而导致细胞无法有效地清除因PPP通路失调 引起的ROS累积并最终导致氧化还原态的失衡。在 这种应激条件下, KL肺腺癌最终发生肺腺鳞癌转分 化(图1)。此外, 值得关注的是, 尽管一些靶向细胞 代谢的临床前药物如Piperlongumine和Phenformin能 通过ROS的异常积累来促进细胞凋亡和KL肺腺癌 的消退, 却会带来的一个不好的结果, 即促使一部分 KL肺腺癌通过转分化为肺鳞癌从而获得耐药性(图 2)。这提示, 临床上LKB1失活的肺腺癌有可能通过 转分化为肺鳞癌来逃脱某些靶向肿瘤代谢的药物治疗。当然, 这只是一个假说, 还需要大量后续临床数 据的证明。终上所述, 该研究不仅为认识人类肺癌 的发病机理提供了新的视角和思路, 而且有可能对 肺癌的临床治疗提供一定的指导。

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