协同刺激分子配体ICOSL参与高亲和力抗体 筛选生成的新机制

刘 丹 徐和平 祁 海*
清华大学医学院, 清华大学免疫学研究所, 动态免疫生物学实验室, 北京 100084
 
 

祁海, 清华大学医学院教授、博士生导师。2003年毕业于德克萨斯州加尔 维斯顿医学院, 获病理学博士学位, 主要从事免疫寄生虫学研究。2003年6 月至2009年4月在美国国立卫生研究院从事博士后研究, 参与完善了基于双 光子显微镜的在体免疫组织动态成像技术, 主要关注体液免疫调节、多细 胞在体交互作用机制、细胞与组织动态对免疫反应及记忆的影响。对该 领域的主要贡献包括: 2006年, 在《Science》上证明B细胞在体内受树突状 细胞活化的过程; 2008年, 在《Nature》上揭示SAP分子调控T-B细胞相互作 用; 2013年, 在《Nature》上鉴定ICOS分子调控滤泡辅助T细胞运动能力的 新机制; 2014年, 在《Nature》上揭示生发中心B细胞亲和力成熟筛选的新 机制。祁海教授是国家“杰出青年”基金获得者、科技部“973”项目首席科 学家、国家“中青年科技创新领军人才”和教育部“跨世纪优秀人才”, 曾获 得《科学新闻》与Elsevier “Scopus未来科学之星”金奖, 是Nature、Science、 Journal of Experimental Medicine的审稿人, 也是Scientific Reports编委。

 
 

免疫系统是机体抵抗感染、维护自身健康的重 要屏障。以产生高亲和力抗体为主要效应的体液免 疫应答, 是免疫系统清除外界抗原物质的重要生理 过程。B淋巴细胞在外周淋巴组织中进行增殖和分 化, 然后进入B细胞区识别抗原, 与T淋巴细胞发生 相互作用, 从而出现增殖性原发灶, 继而形成生发中 心(germinal center, GC)[1-2]。被抗原激活的B淋巴细 胞在此发生克隆性增殖、Ig可变区基因的体细胞高 频突变、Ig类型转换、高亲和力B淋巴细胞克隆的 阳性选择以及无关或自身反应性B淋巴细胞克隆的 阴性选择, 最终生成记忆性B淋巴细胞和浆细胞[3-4]。 在这个过程中, T淋巴细胞给予B淋巴细胞的辅助信 号是筛选高亲和力抗体生成B细胞的决定性因素之 一, 而滤泡辅助T细胞(follicular T-helper cells, Tfh细 胞)则可专一地给B淋巴细胞提供帮助, 促进B淋巴 细胞免疫应答及生发中心的产生和维持的T细胞亚 群[5-6]。

Tfh细胞选择性地高表达其特有的表面分子, 如CXCR5(C-X-C chemokine receptor type 5)、PD- 1(programmed cell death protein-1)、SAP(SLAMassociated protein)、IL-21(interleukin-21)、SLAM 家族成员CD84、CD40L和ICOS(inducible costimulatory molecule)以及低表达Blimp-1(Blymphocyte- induced maturation protein-1)[7-8]。这个特 有的表达谱反映了Tfh细胞两大关键特点: 独特的解 剖定位和通过接触性互作为抗原特异性B淋巴细胞 提供帮助。在免疫反应过程中, B淋巴细胞上表达的 CXCR5使其对CXCL13(C-X-C motif chemokine 13) 产生响应并运动到一定区域从而形成滤泡区。继而, 表达CXCR5的CD4+ T淋巴细胞也能对CXCL13产生 响应并定位到B淋巴细胞形成的滤泡区, 成为Tfh细 胞[9-10]。这种T淋巴细胞与B淋巴细胞共定位的关系 对于T-B细胞之间的相互作用以及TCR与MHC之间 的结合都起到了非常关键的作用, 直接影响T淋巴细 胞在这一过程中对抗原特异性B淋巴细胞的帮助。

比如, SAP的缺失或突变会导致T淋巴细胞与B淋巴 细胞之间无法形成紧密的长时间的相互作用, 从而 影响生发中心和Tfh细胞的生成, 进而影响高亲和力 抗体的形成, 造成X-连锁淋巴细胞增生症等疾病的 发生[11-13]。之所以Tfh-B细胞间抗原特异的长时程 接触性作用很重要, 是因为B细胞所需的重要辅助 因子多是膜表面分子。比如, Tfh细胞表达的CD40L 结合B细胞表面CD40受体, 从而刺激B细胞增殖及 分化。CD40或者CD40L的缺失均会导致生发中心 及Tfh细胞的缺失, 并且当用抗体来封闭CD40L的活 性时, 已发育成熟的GC会也迅速萎缩[14]。有趣的是, 尽管Tfh细胞与抗原特异性的B淋巴细胞在滤泡区 进行长时程的相互作用, 它们在生发中心里往往以 很快的速度穿梭, 两者间的相互作用大部分是短暂 的(一般小于5 min)[4,13]。那么, 在这些短暂的相互作 用过程中, Tfh细胞是如何来调节生发中心反应并筛 选高亲和力B细胞的?这是我们一直希望回答的问题。

协同刺激分子ICOS及其配体ICOSL均对GC的 形成与发育起到重要作用。在小鼠模型中, ICOS 或者ICOSL的缺失均会导致生发中心和Tfh细胞的 缺失[15-17], 而在ICOS的抑制基因Roquin突变情况下, ICOS的持续表达会增加Tfh细胞的比例, 从而引发自 身免疫疾病狼疮[18]。临床研究也发现, 在ICOS突变的 情况下, 人类会出现IgG、IgM和浆细胞缺失的免疫缺 陷病, 并且这些病人易被细菌和病毒感染[19-21]。在细 胞水平上, ICOS和ICOSL这对分子至少有两方面重 要作用: 一方面, T细胞能够从树突状细胞的ICOSL 上获得ICOS的信号刺激来维持并促进其分化成Tfh 细胞, 同时ICOS缺陷的T细胞不能上调CXCR5的 表达, 从而缺失了迁徙进入滤泡区的能力[17]; 另一 方面, 最新的研究表明, 独立于协同刺激信号以外, ICOS信号可以通过PI3K通路来诱导T淋巴细胞伪足 的产生, 直接控制T淋巴细胞在体内迁移运动能力, 从而决定其在滤泡区组织中的迁移和分布[22]。在这个过程中, 抗原非特异的滤泡旁观B淋巴细胞表面 表达的ICOSL至关重要。然而, 抗原激活的B细胞以 及GC B细胞都表达ICOSL, ICOS-ICOSL在抗原特 异GC B-Tfh细胞互作中起何种作用并不明确。我们 猜测, ICOS-ICOSL信号或许参与调控了那种短暂的 GC B-Tfh细胞间互作, 进而影响生发中心反应。

为了检验ICOS-ICOSL信号是否调控生发中心 反应, 我们使用50%的ICOSL+/+骨髓细胞和50%的 ICOSL–/–骨髓细胞构建了混合骨髓重建模型, 在免 疫反应的不同时间点检测两种B细胞在生发中心及 浆细胞中所占据的比例。我们发现, 在这种竞争条 件下, ICOSL–/– B细胞在维持生发中心反应以及发 育成浆细胞方面存在缺陷。这些结果说明, ICOSICOSL 信号确实会调控生发中心反应。那么, 这是 否是通过调控GC B细胞与T细胞之间的互作而实现 的呢?对此, 我们利用了双光子显微成像技术来观 测ICOSL+/+与ICOSL–/– B淋巴细胞与T淋巴细胞生发 中心附近相互运动。我们发现, ICOSL–/– B淋巴细 胞与T细胞的接触多是“擦肩”而过的形式, 即两种 细胞相互接触的面积很小; 而ICOSL+/+ B淋巴细胞 却更加倾向于与T淋巴细胞以“交互纠缠”模式进行 相互作用, 两者接触表面积很大很充分。另外, 实 验发现, T淋巴细胞分别与抗原非特异性的ICOSL+/+ 和ICOSL–/– B淋巴细胞的相互作用形式没有区别, 均倾向于“擦肩”模式。由此可见, 抗原特异性ICOSICOSL 的信号能够促进T-B细胞的胞膜接触面积, 使 得T细胞能够通过这个接触面更好、更迅速地向B 淋巴细胞传递B细胞生存增殖分化所需要的辅助信 号, 并且这种“纠缠”般的接触是T细胞受体刺激产生的。

那么, 这种“纠缠”般的T-B细胞间的互作形式 对于生发中心反应的发生具体有什么功能性的作用 呢?已有的研究结果表明, 与抗原特异性B淋巴细 胞相互作用时, T细胞能够产生钙信号[23], 所以我们 构建了体内基于FRET(fluorescence resonance energy transfer)的钙信号报告系统[24-25], 能够实时监测T淋 巴细胞产生的钙信号。我们发现, T-B细胞间短暂而 频繁地“纠缠”般的相互作用能够促使T细胞产生大 量的钙信号, 而即使在这种充分地T-B细胞接触下, ICOSL–/– B淋巴细胞依然不能刺激T细胞产生钙响 应。同时我们还关注到, 当共刺激T细胞受体和ICOS 时, T细胞能够产生更多的钙响应。

CD40信号是B淋巴细胞生存增殖所必需的, 活化的T淋巴细胞内有 着大量的CD40L, 但T细胞膜表面的CD40L量是被严 格控制的, 其主要是通过外排的过程表达到细胞膜 上, 从而跟B细胞接触来给予CD40信号刺激[26-28]。通 过共刺激ICOS增强钙信号, T细胞就可以在与B细 胞纠缠互作过程中通过胞吐过程给B淋巴细胞传递 的更多的CD40信号。而更加有趣的是, 接收了更多 CD40信号的B淋巴细胞会进一步上调其ICOSL的表 达量, 从而能够更加容易与T淋巴细胞进行“纠缠”互 作, 产生更多的钙信号, 进而得到更多的辅助信号, 这就形成了一个正反馈调节。于是我们猜想, T-B细 胞之间的这种正反馈调节可能会在生发中心B细胞 群相互竞争中构成一种“马太效应”: 高亲和力B细 胞将通过更有优势的抗原受体获取更多的抗原, 从 而能与Tfh细胞更好地“纠缠”互作; 这会导致B细胞 获得更多的CD40L辅助信号进而表达更多ICOSL; ICOSL升高会促进这些B细胞更有效地与T细胞“纠 缠”互作, 从而在竞争T细胞帮助的过程中更容易获 胜。如此, 正反馈调节可能是高亲和力B细胞能从生 发中心被有效选择出来的一个重要保证。

为了进一步验证上述我们的假说, 我们从B细 胞定位分化及亲和力成熟两方面进行了实验。获得 足够T细胞帮助的B细胞会离开生发中心而分化成 浆细胞。所以, 我们将ICOSL+/+和ICOSL–/– B细胞与 T细胞共同回输到小鼠体内并免疫, 利用双光子活体 成像显微技术来观测两种B细胞与T细胞的分布及 运动。结果发现, ICOSL+/+ B细胞与Tfh细胞在主要 由ICOSL+/+ B细胞构成的生发中心里均匀分布, 而当 生发中心主要是由ICOSL–/– B细胞构成时, Tfh细胞 与ICOSL+/+ B细胞共定位在生发中心的外周边缘。 边缘分布显示, 这些ICOSL+/+ B细胞可能即将离开生 发中心, 而少量ICOSL+/+ B细胞在与多数ICOSL–/– B 细胞竞争时仍能“纠缠”住Tfh细胞, 暗示正反馈循环 的存在使得ICOSL+/+ B细胞更受Tfh细胞的“青睐”。

选择高亲和力B细胞是生发中心反应的主要功 能。为了直接检验B细胞亲和力成熟的过程, 我们 使用了NP(4-hydroxy-3-nitrophenyl hapten)半抗原系 统, 由此我们可以通过克隆结合NP的B细胞受体然 后测序来检测亲和力谱[29-31]。实验结果显示, 在GC B细胞群里高表达ICOSL的细胞多为高亲和力B细 胞; 在ICOSL+/+:ICOS–/–骨髓嵌合小鼠中, 无论是在 GC B细胞还是骨髓浆细胞中, ICOSL–/– GC B细胞都有更高的相对抗原亲和力, 说明ICOSL分子缺失导 致的竞争缺陷需要由更高亲和力的B细胞受体来弥 补; 当我们选择性地从GC B细胞上去掉ICOSL从而 打破这种正反馈循环时, 生发中心的形成不受影响, B细胞受体随机突变频率不变, B细胞间对抗原和T 细胞的竞争也仍然存在, 唯一改变的是这种生发中 心不能再有效地选择出高亲和力B细胞。由此可见, ICOSL驱动的正反馈循环对生发中心里亲和力B细 胞的选择及分化至关重要。

总结起来, 我们的研究显示, 在生发中心T-B细 胞间短暂而反复的互作中, ICOSL能够促进T-B细 胞以更大的胞膜接触面积进行相互作用, 通过刺激 ICOS促进T细胞钙响应, 从而进一步增大“纠缠”互 作及传递辅助信号给B细胞; 而获得更多辅助信号 的B细胞会进一步上调ICOSL, 更容易与T细胞“纠 缠”互作, 从而获得更多的T细胞帮助。这种ICOSL 分子驱动的T-B细胞间正反馈调节是机体免疫应答 中有效提高抗体亲和力的新机制, 是看似随机、混 乱的细胞间竞争过程的内在调节规律。更重要的是, 过去我们几乎不可能人为地在疫苗诱导保护性抗 体过程中对亲和力进行干预, 而这项研究为改善抗 体疫苗的研发提供了一个可操控的重要靶点, 为开 发更有效的抗病毒中和抗体疫苗指明了潜在的新方向。

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