高致病性中东呼吸综合征冠状病毒识别细胞受体分子机制的破译

逯光文 吴 莹 高 福*
(中国科学院微生物研究所, 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室, 北京 100101)
 
 

高福, 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室主任, 中国科学院微生物研究所研究员, 中国科学院北京生命科学研究院副院长, 中国疾病预防控制中心副主任。先后在山西农业大学和北京农业大学获得学士和硕士学位, 1995年在英国牛津大学获得博士学位, 相继在英国牛津大学、加拿大卡尔加里大学、美国哈佛大学从事博士后研究工作。2001–2004年在英国牛津大学任讲师、实验室主任、博士生导师。2004年入选中科院“百人计划”, 2005年获“国家杰出青年基金”资助, 2005、2011连续两次担任国家973项目“病毒跨种间传播机制”的首席科学家, 是国家基金委“病原微生物与宿主互作”创新研究群体带头人。2006年起任国际抗病毒联盟(International Consortium of Anti-Virals, ICAV)国际执委会委员。2010年起被聘为英国牛津大学客座教授(Visiting professor)。在多个国际杂志编委会任职。2012年获得发展中国家科学院(TWAS)基础医学奖。2013年获年度科技创新人物。2013年当选中国科学院院士。
高福研究员长期从事病原微生物与免疫学领域研究, 整合分子生物学、流行病学、结构生物学等研究手段, 针对病原跨种传播机制, 特别是在病原与宿主界面的相互识别和相互作用、免疫细胞与感染细胞(靶细胞)的相互识别机制研究方面进行了系统性和创新性工作。MERS-CoV的疫情在中东地区暴发后, 高福研究员带领课题组逯光文等迅速开展研究, 破译了这种新型冠状病毒的受体识别过程和膜融合机制(Lu et al. Nature, 2013)。高福研究员在包括Nature、Science、The Lancet、NEJM、PNAS等在内的SCI杂志发表论文260余篇。

 
 
冠状病毒属巢状病毒目(Order: Nidovirales)冠状病毒科(Family: Coronaviridae)冠状病毒属(Genus: Coronavirus), 为一类具囊膜的RNA病毒[1]。在电镜下, 冠状病毒呈现为球形或卵圆形, 病毒粒子直径通常在100~160 nm之间; 粒子内部为单股正链的RNA基因组, 大小可达26~32 Kb; 粒子外部的囊膜中含有刺突蛋白, 因其覆盖表面而使得整个病毒粒子在电镜下如日冕一般, 因而得名冠状病毒。

人们对冠状病毒的认识最早可追溯到上世纪30年代, 研究人员从鸡身上分离得到了第一个冠状病毒——传染性支气管炎病毒; 随后若干冠状病毒被陆续发现, 包括可引起人类疾病的人类冠状病毒OC43、229E等, 但这些冠状病毒通常只引起感冒等普通的呼吸系统疾病[1]。2003年, 一场突如其来的非典疫情在全球造成了超过8 000例的感染病例和逾800例的死亡病例[2], 而其致病原正是被称作重症急性呼吸综合征病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)的冠状病毒, 这使得人们开始重新认识这些“温和”的致病原, 它们一旦跨越种间屏障, 可以造成严重的人类疾病和人群感染。这也是人们对新出现的高致病性中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronaviurs, MERS-CoV)如此关注的原因。

2012年9月23日, 英国健康保护局通报了一例严重的呼吸系统疾病患者, 这位49岁的卡塔尔人在7~8月曾到沙特阿拉伯旅行, 9月初发病后, 病情恶化而转至英国治疗, 经实验室确诊为感染了一种新型的冠状病毒[3]。在此之前, 一位沙特阿拉伯男性已经被证实感染了同样的冠状病毒而死亡[4]; 而在此之后, 越来越多的实验室确诊病例相继在不同国家和地区被报道。截至2013年7月29日, 世界卫生组织已累计通报了91例该新病毒的感染病例, 其中46例死亡, 病死率超过50%; 病毒已扩散到多个中东和欧洲国家, 包括约旦、卡塔尔、沙特阿拉伯、阿拉伯联合酋长国、法国、德国、意大利、突尼斯和英国等[5]。更有切实的证据表明, 这一新型冠状病毒具备一定的人际传播能力[6]。一时间, 其高病死率、人传人的能力以及向其他国家蔓延的趋势引起各方重视和担忧。尽管早先该病毒曾被称作hCoV-EMC(human coronavirus-erasmus medical center), 2012年5月15日, 国际病毒分类委员会正式将该病毒命名为MERS-CoV[7]。

为了更有效地应对MERS-CoV对公共卫生安全所造成的严重威胁, 认识并解析其致病机理是重中之重。MERS-CoV感染引起的临床症状与SARS-CoV非常相似, 包括高烧、呼吸急促、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征等, 并有很高几率伴发急性肾衰竭[8-9]。但全基因组序列分析表明, MERS-COV不同于SARS-CoV。依据目前的分类原则, 冠状病毒包括α-、β-和γ-冠状病毒属[1]。SARS-CoV与MERS-CoV虽同属β-冠状病毒属, 在进化上却隶属于不同的亚群, 前者为2b亚群的成员, 而后者属于2c亚群, 与冠状病毒蝙蝠分离株HKU4和HKU5等亲缘关系最近[10-11]。这也提示我们, MERS-CoV很可能来源于蝙蝠。在组织嗜性上, 与目前已知的其他人类冠状病毒相比, MERS-CoV表现出更广泛的感染能力[12]; 更有证据表明, MERS-CoV的复制周期快于SARS-CoV[13]。这些特征很可能与这一新型冠状病毒的极高致死率密切相关。此外, MERS-CoV还表现出更广泛的种属选择性。有研究显示, MERS-CoV在灵长类、猪、兔、果子狸和蝙蝠来源的细胞系内均能有效复制[12]。在宿主的免疫应答方面, MERS-CoV感染并不会有效诱导干扰素和促炎性因子的产生; 与之对应的, I型干扰素可以有效抑制该病毒在体外培养的肺组织中的复制[14]。

上述研究开启了人们认识MERS-CoV致病机理的大门。但作为囊膜病毒, MERS-CoV识别何种宿主细胞分子作为受体, 如何介导病毒的黏附和侵入从而起始感染, 是致病机理研究中不可或缺的一环。虽然新近的研究显示, SARS病人的康复期血清对MERS-CoV存在一定的交叉反应[15], 提示我们两者的表面刺突蛋白可能存在一定的相似性, 但MERS-CoV并不能利用SARS-CoV的受体血管紧张素转换酶2(angiotension converting enzyme 2, ACE2)侵入细胞[16]。2013年3月14日, 一个荷兰的研究小组首先鉴定了MERS-CoV在宿主细胞的功能性受体[17]。研究人员发现, MERS-CoV的刺突蛋白可以特异性地与人二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase 4, DPPIV, 又称CD26分子)相互作用; 人为表达CD26分子可以使非敏感细胞对MERS-CoV变得易感; 而CD26的抗体能够有效阻断病毒的感染[17]。这一工作极大地深化了人们对该病毒致病性和宿主范围的认识, 但更深入的问题随之而来, MERS-CoV识别该受体分子的分子机制为何?这一问题的研究对于解析MERS-CoV的侵入机制和有效药物靶点的发现都具有重要意义。

为了解决这一问题, 首先需要鉴定病毒的刺突蛋白中与CD26分子发生特异相互作用的部分, 即病毒的受体结合域(receptor binding domain of MERS-CoV, MERE-RBD)。与其他的冠状病毒类似, MERE-CoV的刺突蛋白(spike, S)在宿主细胞中也会被加工成S1和S2两个亚基[18], 其中S1负责结合宿主的受体分子, 而S2含有典型的七肽重复区, 通过形成六螺旋簇结构而介导病毒与宿主细胞的膜融合[19]。根据前人的研究, 冠状病毒的S1亚基又可以进一步分成N-端和C-端两个结构域: 有些冠状病毒, 如鼠肝炎病毒[20], 利用N-端结构域结合受体分子; 而目前已知的更多的冠状病毒, 包括SARS-CoV[21]、人冠状病毒NL63[22]等, 则通过C-端结构域识别受体。据此, 我们分别制备了MERS-CoV刺突分子的S1、N-端和C-端蛋白, 并通过流式分析测定各蛋白对于细胞表面CD26分子的结合。结果显示, MERS-CoV刺突的C-端蛋白(367-606位氨基酸)能够识别CD26[23]。进一步的结合动力学研究表明, 这一C-端蛋白特异性结合CD26分子, 两者的亲合力(Kd)高达16.7 nmol/L; 但对于SARS-CoV的受体ACE2则没有任何互作(图1A)。

受体结合域的成功鉴定为我们进一步剖析MERS-CoV识别CD26的分子机制奠定了基础。我们的目标是通过结构生物学手段, 在分子层面直接“观察”MERS-RBD结合CD26的互作细节。我们首先解析了MERS-RBD的高分辨率晶体结构。整体上, MERS-RBD可分为“核心”和“外部”两个亚结构域。前者为α/β结构, 包括一个由5个反向平行的β-折叠片形成的片层, 以及围绕在片层两侧的4个α-螺旋、2个310-螺旋和2个短β-折叠片等二级结构元件; 在这一“核心”的内部存在3对二硫键, 对于其结构的稳定性起着关键作用。而后者是一个β-折叠为主的结构, 主体为3个长折叠片和一个短折叠片以反向方式排列所形成的片层。这一片层的一侧接触“核心”亚结构域, 而另一侧则几乎完全暴露于溶剂[23]。

我们进一步解析了MERS-RBD与CD26的复合物晶体结构。与之前对CD26的结构研究一致, 在我们所解析的结构中, 该受体分子由两个结构域组成, 包括一个α/β催化结构域和一个由8-桨叶片(blade I~VIII)所组成的“β-螺旋桨”样结构域; MERS-RBD识别CD26分子的IV、V桨叶片。在宿主细胞表面, CD26以同源二聚体的形式存在, 而MERS-RBD结合在CD26分子的远膜端, 形成类似U-型的分子结构(图1B)。对病毒刺突蛋白而言, 受体识别区则完全位于蛋白的“外部”亚结构域中, MERS-RBD利用上述提到的片层中暴露于溶剂的一侧结合受体。细致的分析表明, MERS-RBD与CD26的结合在两分子中的包埋面积均超过1 100 ?2, 这从分子层面揭示了两者间高亲合力的结构基础; 在病毒配体识别受体的过程中, 侧链基团形成的氢键和盐桥等亲水相互作用至关重要。与这一结合模式相一致, 当我们将RBD中的关键氨基酸突变后, 该病毒配体即失去结合CD26分子的能力[23]。

有趣的是, 虽然MERS-CoV与SARS-CoV的刺突蛋白在一级序列上同源性很低, 但两者的RBD结构却存在一定的相似性[21,23]。结构比对显示, 两种冠状病毒RBD的“核心”亚结构域高度同源; 但“外部”亚结构域则差异显著。这提示我们, 前者很可能作为结构支架而在进化中被保留; 后者由于趋异进化而形成完全不同的结构域, 以实现一些病毒特异的致病过程, 如受体识别。

通过上述结构和功能研究, 我们成功破译了MERS-CoV识别细胞受体的分子机制。这一新型冠状病毒对公共卫生安全的潜在威胁亟需特异、高效的抗病毒药物。阻断病毒的结合和侵入, 防患于未然, 是最有效的抗病毒手段之一。在分子层面上对病毒配体/受体互作细节的分析, 为我们设计靶向病毒侵入的小分子药物提供了重要的参考。同时功能性RBD蛋白的成功表达和制备, 也为疫苗设计奠定了基础。上述研究还为我们更深入了解MERS-CoV的致病机制指出了新的研究方向。比如我们发现, MERS-RBD与腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)在CD26分子中的识别位点完全重叠[23-24], 这意味着病毒蛋白结合CD26后, 将竞争性地抑制ADA对该受体分子的结合。有研究表明, ADA/CD26的互作是T细胞活化中非常重要的共刺激信号[25]。因此, MERS-CoV很可能通过竞争ADA对CD26的结合而对宿主的免疫应答进行“操纵”。

A: 表面等离子共振的结果。MERS-RBD以高亲合力与CD26分子相互作用, 但不结合SARS-CoV的受体hACE2; B: MERS-RBD与CD26的复合物晶体结构。CD26以二聚体形式存在于细胞表面, MERS-RBD结合于CD26分子的远膜端, 形成U形的分子结构。 A: an SPR assay. MERS-RBD can specifically bind to CD26, but not to the SARS-CoV receptor ACE2, with high affinity; B: the complex structure between MERS-RBD and CD26. CD26 is present on the cell surface as homodimers. MERS-RBD locates at the distal-tip of the receptor dimer, forming an overall “U”-shaped structure.
图1 MERS-CoV与宿主受体分子CD26的相互作用特征(根据参考文献[23]修改)
Fig.1 Characterization of the interaction between MERS-CoV and its cellular receptor CD26 (modified from reference [23])


参考文献 (References)
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