第30卷 第1期（2008年2月）： 89-94

创伤弧菌溶细胞素融合蛋白重组、表达与 细胞毒活性鉴定

桂　静s　肖美英　楼永良*　胡　蝶　严　杰¹　朱晔晶

(温州医学院微生态学研究所, 浙江省医学遗传学重点实验室, 温州325035; ¹浙江大学医学院病原生物学教研室, 杭州310031)

摘要　　研究重组创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, human ECV304)凋亡的作用。诱导含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白, 应用Ni²⁺亲和层析方法对rVvhA进行纯化; 利用分步稀释加透析相结合的方法进行蛋白质复性; 绵羊红细胞裂解试验对复性后的rVvhA进行溶血活性初步测定; MTT法检测rVvhA对人ECV304细胞的体外毒性作用; 应用Hochest33342/PI活细胞荧光双染及流式细胞术分析rVvhA对人ECV304细胞诱导凋亡的影响。结果显示, 用Ni²⁺-NTA His Band亲和层析柱纯化rVvhA纯度达88.6%左右; 复性后的rVvhA有一定的溶血活性, 其溶血活性具有时间-剂量依赖性; MTT结果显示rVvhA具有降低人ECV304细胞的存活率活性; 浓度为2.0 HU/ml rVvhA作用人ECV304 12 h后, 其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5 HU/ml rVvhA处理组,具有剂量依赖性; 浓度为2.0 HU/ml rVvhA处理组加用40 μmol/L caspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0 HU/ml rVvhA处理组有一定程度降低。rVvhA对人ECV304细胞具有诱导凋亡的生物学活性, 推测诱导调亡途径可能与caspase家族有关。

关键词　　创伤弧菌; 溶细胞素; rVvhA; 人ECV304细胞; 细胞凋亡; caspase

收稿日期: 2007-10-19　　接受日期: 2007-11-30
浙江省自然科学基金项目(No.X205004)
*通讯作者。Tel: 0577-86699200, E-mail: lyl@wzmc.net