第36卷 第6期(2014年6月):791-798 DOI:10.11844/cjcb.2014.06.0031

 

酿酒酵母TORC1信号通路重要调控元件Ego1/Ego3复合物的共表达及纯化

 

马 瑞1,2 李 昂2 王玉炯1 张 勇2*

 

(1宁夏大学生命科学学院, 银川 750021; 2上海交通大学生命科学技术学院, 上海 200240)

 

摘要  支架和连接蛋白在调节信号级联传导中起着重要作用。最近, Ego1/Ego3蛋白复合物被证实作为定位在细胞内体膜表面的支架蛋白在TORC1信号通路感知氨基酸丰度方面发挥重要调控作用。研究中通过克隆酵母Ego1与Ego3基因, 构建了双T7启动子的双元原核表达载体。通过在大肠杆菌中共表达、共破菌以及带有不同抗性的两个质粒共转化的方法来重组表达Ego1/Ego3复合物。结果发现, Ego1可与Ego3蛋白形成可溶性的复合物, 但纯化后蛋白比例存在明显差异, 且Ego1有降解现象。通过构建一系列带组氨酸标签截短的Ego1与全长Ego3共表达, 依靠pulldown纯化来鉴定Ego1与Ego3相互作用的区段。最终发现, 共转化pRSFDuet-mcs1Ego1(35-184)和pACYDuet-mcs1Ego3可共表达、纯化到较稳定的比例较一致的复合物, 从而为进一步对Ego1/Ego3蛋白复合物进行生化鉴定和结构生物学研究奠定了基础。

 

关键词  TOR信号通路; EGO复合物; 双元载体; 蛋白纯化

 
收稿日期: 2014-1-25  接受日期: 2014-3-12
国家自然科学基金(批准号: 31200597、81202397、J1210047)资助的课题
 

*通讯作者。Tel: 021-34205996, E-mail: yzhang2011@sjtu.edu.cn

 
您是第 位访问者,欢迎!
主 办:中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 中国细胞生物学学会
协办: 上海国联干细胞技术有限公司 上海赛傲生物技术有限公司
地 址:上海徐汇区岳阳路319号31号楼A楼303室 邮编:200031 电话:021-54920950 / 2892 / 2895 Email:cjcb@sibs.ac.cn
沪ICP备05017545号