第32卷 第4期(2010年8月):575-582

 

L303E/F309S 突变促进细胞分泌内含肽连接的B 区缺失型凝血VIII 因子

 

朱甫祥* 杨树德 刘泽隆 缪 静 屈慧鸽 迟晓艳

 

(鲁东大学生命科学学院, 烟台264025)

 

摘要  凝血VIII 因子(FVIII)尽管与凝血V因子具有相似的结构,但其分泌的低效性不仅限制了重组产品在甲型血友病患者中的广泛应用,也困扰基于转FVIII 基因的基因治疗。为了提高FVIII的分泌效率,在我们以前用内含肽(intein)的蛋白质剪接功能介导的双载体转B区缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因研究的基础上,探讨了重链L303E/F309S 双突变对剪接BDD-FVIII 蛋白分泌的影响。PCR 突变法将L303E/F309S 双突变引入我们以前构建的融合Ssp DnaB 内含肽的野生型重链(HCIntN),得到融合内含肽的重链突变基因(DMHCIntN),与融合内含肽的轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA检测了培养上清中的重链多肽和剪接的BDD-FVIII蛋白浓度,用Coatest法分析了培养上清的凝血生物活性。结果显示,单独转DMHCIntN和DMHCIntN与IntCLC共转染细胞上清中的分泌的重链多肽浓度分别为(35±12) ng/ml 和(178±19) ng/ml,高于单独转HCIntN 细胞和HCIntN 与IntCLC 共转细胞[(14±6) ng/ml 和(127±23) ng/ml]; 共转DMHCIntN 和IntCLC 细胞上清中剪接的BDD-FVIII 蛋白浓度和活性分别为(128±24) ng/ml 和(1.01±0.15) U/ml,明显高于共转HCIntN 和IntCLC 细胞[(90±12) ng/ml 和(0.71±0.14) U/ml]; 另外,单独转DMHCIntN 和IntCLC 的细胞合并培养后的上清也检测到剪接的BDD-FVIII 蛋白[(20±3) ng/ml]和活性[(0.17±0.07) U/ml]。结果表明,双突变可提高重链的分泌效率并明显被轻链顺式提高,伴之以剪接BDD-FVIII的分泌增加,表明内含肽对双载体转BDD-FVIII 基因功效的改善并表现出不依赖细胞机制的BDD-FVIII 剪接作用。为进一步动物体内实验运用内含肽的双AAV转重链双突变BDD-FVIII 基因研究奠定了基础。

 

关键词  B 区缺失型FVIII; 突变重链; 分泌; 内含肽; 蛋白质剪接

 
收稿日期: 2010-4-26  接受日期: 2010-7-2
山东省自然科学基金(No.Y2005D14), 烟台市科技计划项目(No.2008152), 教育部留学回国人员科研启动基金(No.20071108)和鲁东大学学科建设项目资助项目
 

*通讯作者。Tel: 0535-6693825, E-mail: fuxiangmail@163.com

 
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